Laboratorio de Técnicas Microbiológicas UPIBI-IPN PRÁCTICA No. 8 PRODUCCIÓN DE ÁCIDO LÁCTICO UNIDAD V: Crecimiento microbiano 1. OBJETIVOS El alumno realizará la producción de un metabolito de importancia industrial de origen microbiano, medirá algunos parámetros para verificar su producción. I.2 Objetivos específicos 1.2.1 El alumno determinará cuantitativamente el lactato producido. 1.2.2 El alumno establecerá la correlación entre el crecimiento microbiano y la producción de un del metabolito primario. 2. INTRODUCCIÓN Por biotecnología se entiende “Toda aplicación tecnológica que utilice sistemas biológicos y organismos vivos o sus derivados para la creación o modificación de productos o procesos para usos específicos”, según la definición de la ONU. Desde los inicios de la civilización, la humanidad ha hecho uso de los microorganismos para obtener productos específicos como pan, cerveza, vino, yogurt, etc., en lo que se conoce como biotecnología tradicional o de primera generación. En la década de los 40´s, se emplearon las herramientas de la bioquímica y la microbiología en el uso y manipulación de organismos para la obtención de metabolitos (aminoácidos, antibióticos, enzimas), como biotecnología de segunda generación. Actualmente, la biotecnología de tercera generación hace uso de las herramientas de la biología molecular y la ingeniería genética para la producción de compuestos, enzimas, vacunas, anticuerpos, etc. Uno de estos metabolitos de origen microbiano es el ácido láctico, obtenido generalmente a partir de bacterias lácticas homofermentativas. Fue el primer ácido orgánico producido mediante fermentación microbiana industrial en 1880. Se emplea en medicina para estabilización hemodinámica, en cosmética como queratinolítico, para curtir pieles en peletería, y como acaricida en el ganado. El ácido láctico tiene múltiples aplicaciones en la industria alimentaria como aditivo y conservante en productos cárnicos y lácteos, en industria derivada de cereales y en numerosas industrias de bebidas. De hecho el yogurt se produce por la fermentación de la lactosa de la leche hasta ácido láctico, cuya acidez genera la precipitación de la caseína, dando el aspecto grumoso del yogurt. Se producen otros alimentos a partir de fuentes de carbono diversas, en donde se genera acido láctico, tales como la leche búlgara, el yakult, el jocoque, etc. En la producción de saeukrut (col fermentada), la primera fase del proceso incluye la fermentación láctica. La producción sólo del ácido es de 20,000 toneladas anuales. El ácido láctico se produce a través de la degradación de lactosa ó glucosa por la ruta de Embden – Meyerhoff –Parnas o glicólisis, hasta producir piruvato, el cuál es reducido por la Lactato deshidrogenasa (LDH) a L – (+) Lactato. El lactato es un ácido carboxílico, y la acidez que genera, la cual llega a ser de pH 4.5, detiene el crecimiento de los microorganismos, lo que da fin al proceso fermentativo, y permite conservar los productos, pues la acidez evita la contaminación por otros microorganismos. Las cepas utilizadas desde hace tiempo en la producción de lactato (sal sódica del ácido láctico, y que es la forma como se comercializa) son principalmente lactobacilos (homofermentativos), como son Lactobacillus delbruckii sub. delbrueckii, sub. bulgaricus y sub. lactis, y L. helveticus. Estos microorganismos son anaerobios aerotolerantes, por lo que la fermentación se puede llevar a cabo en 66 Laboratorio de Técnicas Microbiológicas UPIBI-IPN condiciones parcialmente anaerobias, y no es necesaria la anaerobiosis absoluta. Otros lactobacilos son heterofermentativos (grupo III), y además de producir lactato, producen acético, etanol u otros productos, por lo que no son útiles para la producción. L. delbruckii sub. delbrueckii fermenta la glucosa y la fructosa, pero no la lactosa; L. delbruckii sub. bulgaricus y lactis si pueden fermentar la lactosa. Actualmente la mitad del lactato que se genera se produce por fermentación, y el resto por síntesis química. Los fabricantes ponen especial interés en la selección de las condiciones adecuadas de cultivo para lograr altas tasas de producción del ácido. En la producción se puede emplear glucosa o lactosa como fuentes de carbono, pero se prefiere la glucosa por el precio. Además de la glucosa y de la fuente de nitrógeno, generalmente fosfato de amonio, estas bacterias requieren vitaminas del grupo B para su crecimiento, las cuales se pueden adicionar puras, o adicionar una fuente rica en ellas, como el extracto de levadura. En los procesos continuos, se adiciona CaCO3 para mantener el pH alto y evitar que la fermentación se detenga. La fermentación típica dura 72 horas y debe mantenerse una temperatura entre 30 -35° C. En los últimos tiempos, se han desarrollado procesos para la obtención a partir del suero lácteo desproteineizado que es un subproducto de queserías, con lo cual se disminuyen costos, además de evitar contaminación por su desecho. Este suero contiene un 5% aprox. de lactosa que funciona como fuente de carbono. También se emplea la melaza del azúcar, dando un uso alternativo de la caña de azúcar. Un proceso típico de fermentación “batch”, consiste en la preparación del inóculo, la inoculación del fermentador semilla, la fermentación en el tanque de producción y la etapa de purificación del metabolito. El estudio cinético de un proceso fermentativo para la obtención de un metabolito consiste en la determinación y análisis de los componentes del sistema que nos permitan establecer las mejores condiciones de producción y tener control sobre ellas, como son: determinación del crecimiento del microorganismo como biomasa producida (x), el consumo de carbohidratos o de la fuente de carbono empleada, es decir el sustrato (s) y la cantidad de metabolito producido (P). La determinación de biomasa microbiana se puede hacer por peso seco o peso húmedo, ó por cuenta directa. La determinación del consumo de la fuente de carbono o sustrato depende de la naturaleza de éste, y y existen varias técnicas espectrofotométricas para ello. La técnica elegida para la determinación del metabolito producido, también depende de la naturaleza de este. Dado que el ácido es un metabolito asociado al crecimiento, la medición de la biomasa producida, puede ser indicativa de la producción de láctico en un cultivo “batch”. En este caso la determinación de la acidez del medio nos permitirá determinar su producción. 3. MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS 3.1 EQUIPO Y MATERIAL Estufa de incubación a 40 ºC Potenciómetro Microscopio Cámara de Neubauer Balanza analítica Tubos de ensaye de 13 X 100 mm Refrigerador Bureta graduada Matraces Erlenmeyer de 125 ml y 250 ml. Vaso de precipitados de 30 ml Pipetas graduadas de 1, 5 y 10 ml estériles Centrifuga 3.2 MATERIAL BIOLÓGICO Cepa: Lactobacillus delbrueckii sub. lactis en tubos inclinados de medio MRS 67 Laboratorio de Técnicas Microbiológicas UPIBI-IPN 3.3 MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS Un matraz con 150 ml de Medio MRS Solución salina isotónica estéril NaOH 0.1 N Colorantes para tinción de Gram Regulador de pH 4.0 Solución de fenolftaleína Regulador de pH 7.0 4. DESARROLLO EXPERIMENTAL 4.1 PREPARACIÓN DEL INÓCULO Y MATRAZ SEMILLA. a) Tomar un tubo con medio inclinado con un cultivo de Lactobacillus lactis y adicionarle 2 ml de solución salina isotónica. b) Homogeneizar perfectamente para tomar suspensión celular. c) Inocular un matraz conteniendo 150 ml de medio MRS de cultivo con 2.0 ml de la suspensión celular. A fin de verificar la pureza de éste matraz semilla, se realizará una tinción de Gram y se revisará en el microscopio. d) Incubar a 40 oC durante 48 horas sin agitación PRIMERA SESIÓN e) .Adicionar del matraz anterior 10 ml de la cepa semilla a un matraz conteniendo 150 ml de medio MRS y homogenizar. f) Tomar 10 ml de la muestra del tiempo 0 h y colocarlo en un tubo previamente pesado, etiquetar perfectamente y guardar en el refrigerador. g) Tomar 2 ml y colocarlo en un tubo de ensaye, etiquetar y guardarlo en el refrigerador. SEGUNDA, TERCERA y CUARTA SESIÓN: (algunas de estas sesiones son extraclase). 1.- Tomar 10 ml de la muestra y colocarlo en un tubo de ensaye previamente pesado, tapar con parafilm y guardar en el refrigerador. 2.- Colocar los 2 ml en un tubo de ensaye y colocarle parafilm para guardarse en el refrigerador. 3.- Del volumen que quede en la pipeta esparcir un poco para la realización del Gram 4.- Realizar este procedimiento a las 24, 48 y 72 h. 4.2 TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS a) Centrifugar los cuatro tubos, para ello recuerda que hay que tararlos. b) Verter el sobrenadante en un vaso de 15 ml para la determinación de pH c) Posteriormente vaciar el sobrenadante en un matraz y colocarle 3 gotas de fenolftaleína para realizar el procedimiento de titulación. d) De los dos ml que tienes en el tubo, agitar perfectamente y proceder a colocar una gota en la cámara de Neubauer para el recuento de células. e) Realizar la tinción de Gram y proceder a observar la pureza y morfología microscópica 4.2.1 DETERMINACIÓN DEL PESO HÙMEDO. a) Pesar cuatro tubos de 0. 24,48 y 72 h previamente etiquetados b) En estos tubos se pondrá los 10 ml de la muestra de cada tiempo 68 Laboratorio de Técnicas Microbiológicas UPIBI-IPN c) El día de la práctica, sacar los tubos del refrigerador y tarar los tubos, centrifugar 5 min a 4000 rpm. d) Una vez centrifugado decantar el sobrenadante en un vaso de precipitados de 15 ml. Etiquetar el vaso con el tiempo y pasarlo a la sección de determinación de pH con el potenciómetro. e) Pesar el tubo que contiene las células y con la diferencia de peso de los tubos vacíos y los centrifugados sacar el peso en g/ml f) Realizar lo mismo para las otras muestras. 4.2.2. DETERMINACIÓN DEL ÁCIDO LÁCTICO PRODUCIDO POR DETERMINACIÓN DE pH . a) Ajustar el potenciómetro según las indicaciones del profesor con un regulador de pH= 4 y otro de pH= 7 y medir el pH de las muestras. Esto será indicativo de la producción de ácido láctico. b) Medir el pH de la muestra y pasar el vaso a la sección de titulación c) Realizar lo mismo para las otras muestras 4.2.3. DETERMINACIÓN DEL ÁCIDO LÁCTICO PRODUCIDO POR DETERMINACIÓN DE ACIDEZ . d) Vaciar el contenido del vaso a un matraz, colocarle 3 de gotas de fenolftaleína y mezclar bien. e) Realizar la titulación con NaOH 0.1 N a las cuatro muestras f) Registrar el volumen de álcali gastado, para calcular los moles de ácido orgánico láctico. 4.2.4. DETERMINACIÓN DE LA PUREZA a) Para verificar la pureza del cultivo se realizarán las cuatro tinciones de Gram. 4.2.5 CUENTA DIRECTA EN CÀMARA DE NEUBAUER PARA MEDIR EL CRECIMIENTO. a) Tomar una gota de la alícuota previamente homogenizada del tubo que contiene los 2 ml y colocarla en la cámara de Neubauer. b) Colocar la cámara en el microscopio y enfocar a 10X, eligiendo el campo de la cuadricula. c) Cambiar a 40X y realizar el conteo de bacterias. Registrarlas para el cálculo posterior del número de células. 5. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS. 5.1 Anotar en la tabla siguiente anotar los resultados obtenidos. Los resultados obtenidos serán utilizados para elaborar la gráfica de la cinética de producción de lactato Tiempo 0 24 48 72 Peso húmedo Valor de pH Acidez Pureza No. de Cel / ml 5.2 Con los datos del gasto en ml de NaOH de cada una de las muestras y con las formulas calcula los moles de NaOH. * La solución de sosa es 0.1N, lo que equivale a 0.1 moles / L 69 Laboratorio de Técnicas Microbiológicas UPIBI-IPN Después se calculan los moles de lactatos presentes en la muestra: 5.3 ¿Cuántos moles de lactato se produjo en el matraz que se corrió? Comparar la cantidad de lactato producido en los matraces con suero de leche y con glucosa, e indicar cuál es más conveniente para la producción de lactato. 5.4 Con los resultados de pH, y número de células, elaborar una gráfica, de tiempo contra crecimiento y pH a los diferentes tiempos. Con esto tendremos una gráfica donde se muestre como se comporta el cultivo con respecto al pH. Recuerda que es una sola gráfica para pH y número de células. 5.5 Escribir la vía metabólica utilizada en la fermentación para la producción de ácido láctico. 5.6 Explicar porque se eligió esta cepa para la producción de lactato. 5.7 Mencionar dos usos del ácido láctico. 6. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS Discutir los resultados obtenidos en función del medio empleado y la cantidad de lactato producido en cada medio. Explicar las ventajas de producir lactato en cada uno de los medios. 7. CONCLUSIONES Elabora las conclusiones sobre la base de los resultados obtenidos, al análisis y discusión de estos, a la bibliografía consultada y a los objetivos de la práctica. 8. BIBLIOGRÁFIA 8.1 Crueger,D y Crueger, A. Biotecnología: Un texto de microbiología industrial. 2da. Edición. Ed. Omega. Barcelona. 1994. 8.2 Jakymec, M.; Moran, H.; Páez, G.; Ferrer, J.; Mármol, Z.; Ramones, E. 2001. “Cinética de la producción de ácido láctico por fermentación sumergida con lactosuero como sustrato”. Rev. Cient., FCV-LUZ. XI(1): 53-59. 8.3 Rodríguez Pascual, L. y Martínez Zúñiga R.1999. Manual de Prácticas de Laboratorio de Bioquímica Microbiana. UPIBI-IPN. México. 8.4 Río de Janeiro. Convenio de Diversidad Biológica. Secretariat of the Convention on Biological Diversity. UNEP. 1992. Disponible en WEB como [ref. marzo de 2007] http://www.biodiv.org/convention/convention.shtml 70 Laboratorio de Técnicas Microbiológicas UPIBI-IPN PRÁCTICA No. 9 CUANTIFICACIÓN DE BACTERIAS COLIFORMES POR LA TÉCNICA DEL NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP) UNIDAD V: Crecimiento microbiano 1.-OBJETIVOS. El alumno cuantificará bacterias coliformes por la Técnica de Número Más Probable de una muestra biológica. 1.1 Objetivos específicos: 1.2.1 El alumno aplicará adecuadamente la Técnica del Número Más Probable para cuantificar a los microorganismos coniformes totales o fecales presentes en una muestra. 1.2.2 El alumno interpretará la Técnica de Número Más Probable para el conteo de organismos coliformes totales o fecales en muestras según la NOM-112-SSA1-1994, Bienes y servicios. Determinación de bacterias coliformes. Técnica del número más probable. 2.- INTRODUCCIÓN Esta técnica esta basada en la estadística, matemática inobjetable, para expresar cuantitativamente la densidad de microorganismos en una muestra. Se basa en la presunción de que las bacterias se hallan normalmente distribuidas en un medio líquido. La Norma Oficial Mexicana NOM-112-SSA1-1994 Bienes y Servicios Determinación de bacterias coliformes Técnica del Número Más Probable. Secretaria de Salud. México, establece el método microbiológico para estimar el número de coliformes presentes en productos alimenticios, por medio del cálculo del número más probable (NMP). Este procedimiento puede aplicarse a agua potable, agua purificada, hielo y alimentos procesados térmicamente, así como a muestras destinadas a evaluar la eficiencia de prácticas sanitarias en la industria alimentaria. Este procedimiento debe seleccionarse cuando la densidad esperada es como mínimo de una bacteria en 10 ml de producto líquido o una bacteria por gramo de alimento sólido. Cuando la densidad bacteriana sea menor que la aquí citada y si la naturaleza del alimento lo permite, utilizar el método de filtrado en membrana. Si la densidad microbiana se espera sea mayor a 100 por mililitro o gramo de muestra, ampliar el intervalo de diluciones o utilizar el método en placa. El método se basa en que las bacterias coliformes, fermentan la lactosa incubadas a 35 ± 1°C durante 24 a 48 h, resultando una producción de ácidos y gas el cual se manifiesta en las campanas de fermentación. La técnica NMP requiere de mucho más material que la utilizada en los recuentos en placa y se considera en general, que posee una menor exactitud y precisión; es sin embargo, incomparablemente y más sensible ya que pone de manifiesto unos cuantos microorganismos o uno solo, en un gran volumen de muestra (teóricamente litros). Por esta razón encuentra aplicación en el análisis de agua, por ejemplo, en donde la presencia de dos organismos coliformes en 100 ml, ya reclama atención especial en un sistema de abastecimiento. Con frecuencia en la aplicación de la técnica de NMP de un grupo particular de microorganismos, el ensayo se extiende a dos o más estadios, en el primero, que constituye la prueba presuntiva, los tubos positivos pueden ser el resultado de la actividad del microorganismos en cuestión, o también de otros con comportamiento similar e incluso, de asociaciones de diferentes microorganismos. La que viene a ser la prueba presuntiva en la investigación de organismos coliformes, consiste en inocular alícuotas de la muestra en tubos de fermentación con caldo lactosado. En ellos, estos microorganismos proliferan fácilmente fermentando la lactosa y liberando gas que se acumula en la campana de Durham. Un efecto 72 Laboratorio de Técnicas Microbiológicas UPIBI-IPN semejante puede ocurrir en ausencia de organismos coliformes como resultado de la acción sinérgica de dos tipos de bacterias; una capaz de fermentar la lactosa hasta ácido láctico y pirúvico; y otra que metaboliza estos ácidos generando el gas aldehído y ácidos menores. Algunas bacterias Gram positivas también pueden, aunque en menor grado producir gas a partir de la lactosa. Se hace por ello indispensable efectuar un segundo ensayo, llamado prueba confirmatoria en la cual los organismos coliformes, en caso de existir, proliferan activamente en tanto que los falsos positivos serán inhibidos por la presencia de sustancias selectivas antibacterianas adicionadas al medio de confirmación. Otra prueba para determinar la presencia de bacterias coliformes es la cuenta total en placa El método permite determinar el número de microorganismos coliformes presentes en una muestra, utilizando un medio selectivo (agar rojo violeta bilis) en el que se desarrollan bacterias a 35°C en aproximadamente 24 h, dando como resultado la producción de gas y ácidos orgánicos, los cuales viran el indicador de pH y precipitan las sales biliares. El número de organismos se establece mediante la cuenta de unidades formadoras de colonias NOM113-SSA1-1994. Método para la Cuenta de Microorganismos Coliformes Totales en Placa. Las bacterias coliformes son bacilos cortos, Gram negativos, que fermentan la lactosa y producen ácido y gas, son anaerobios facultativos y se multiplican a mayor rapidez a temperaturas entre 30 y 37 ºC. Las bacterias coliformes incluyen la E. coli y otras bacterias que se asemejan morfológica y fisiológicamente. 3.- MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS, MEDIOS DE CULTIVO Y MUESTRAS 3.1 MEDIOS DE CULTIVO Organismos coliformes totales Organismos coliformes fecales 5 frascos de dilución con 90 ml de agua peptonada al 0.1 %. 6 frascos de dilución con 90 ml de agua peptonada al 0.1 %. 3 tubos con 10 ml de caldo lactosado de doble 3 tubos con 10 ml de caldo lauril sulfato triptosa concentración y campana de Durham de doble concentración y campana 6 tubos con 10 ml de caldo lactosado de 6 tubos con 10 ml de caldo lauril sulfato triptosa concentración sencilla y campana de Durham. de concentración sencilla y campana. 9 tubos con 10 ml de caldo lactosa bilis verde brillante con campana de Durham. 9 tubos con 10 ml de caldo EC y campana Un frasco con tiosulfato de sodio Determinación de coliformes fecales en muestras de agua o hielo. 5 tubos con 20 ml de caldo lauril sulfato triptosa (CLST) de doble concentración con campana Durham 10 tubos con 10 ml de caldo lauril sulfato triptosa de concentración sencilla y campana 15 tubos con 10 ml de caldo EC Determinación de coliformes totales en muestras de agua o hielo. 5 tubos con 20 ml de caldo lactosado (CL) de doble concentración con campana Durham 10 tubos con 10 ml de caldo lactosado de concentración sencilla y campana 15 tubos con 10 ml de caldo de bilis verde brillante (CBVB) Esterilización de frascos para muestras de agua con cloro residual libre. Previo a la esterilización agregar 0.1 ml de tiosulfato de sodio al 3% por cada 120 ml de capacidad de los mismos. 73 Laboratorio de Técnicas Microbiológicas UPIBI-IPN 3.2 MATERIAL Un pipetero metálico con pipetas de 1 ml estériles Cuatro pipetas de 10 ml 3.3 REACTIVOS Tiosulfato de sodio Benzal 3.4 EQUIPO Una autoclave. Una incubadora a 35° C. Una balanza granataria Un horno a 180° C. Un baño María a 44.5 ° C 4.- PROCEDIMIENTO Para los equipos que van a traer muestras de agua potable, tendrán que llevar un frasco que contenga 1 ml de tiosulfato de sodio al 10 % para inactivar el cloro residual. Para muestras solidas se tomaran en una bolsa de plástico nueva y tendrán que realizar la dilución primaria si es que la muestra aparentemente no tiene muncha carga microbiana. Las muestras a traer serán las siguientes: equipo Determinación 1y6 Agua Determinación de Organismos coliformes totales 2y7 Hielo Determinación de Organismos coliformes fecales 3y8 Queso Determinación de Organismos coliformes totales 4y9 Leche Determinación de Organismos coliformes fecales 5 y 10 Fresas Determinación de Organismos coliformes totales 4.1 Preparación de las diluciones. Realizar diluciones para muestras sospechosas de una gran carga microbiana a. Etiquetar los frascos que contienen 90 ml de agua peptonada estéril como 10 –1, 10-2 y 10-3…… b. Para muestras liquidas medir 10 ml de la muestra y colocarla en el frasco o 10-1 y homogenizar según las recomendaciones de la NOM 110. c. Con una pipeta estéril se transfiere 10 ml de la dilución 10-1 al frasco de la dilución 10-2 y así sucesivamente, utilizar una pipeta estéril para cada dilución. d. Para muestras sólidas solo realizar la dilución 10-1 y continuar el procedimiento. 4.3 DETERMINACIÓN DE ORGANISMOS COLIFORMES TOTALES: USANDO LA TABLA 333. Prueba presuntiva a) Inocular 10 ml de la muestra en cada uno de los 3 tubos con 10 ml de CL de doble concentración. b) Inocular 1 ml de la muestra en cada uno de los 3 tubos con 10 ml de CL de concentración. sencilla. c) Inocular 0.1 ml de la muestra en cada uno de los 3 tubos con 10 ml de CL de concentración. sencilla. d) Incubar los tubos a 35° C durante 24 horas. e) Observar si hay producción de gas en los tubos a las 24 horas, si no la hay, seguir incubando hasta las 48 horas, si en este tiempo no hay formación de gas la prueba se considera negativa. 74 Laboratorio de Técnicas Microbiológicas UPIBI-IPN Prueba confirmativa f) Agitar suavemente los tubos de caldo lactosado que resultaron positivos en la prueba presuntiva. g) Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo a caldo lactosa bilis verde brillante. h) Incubar a 35° C durante 24 horas. i) Considerar la prueba (+) si hay formación de gas en cualquier cantidad, si no existe, incubar por 24 h más y si no existe producción de gas se reporta como negativa el análisis. j) Determinar el número de organismos coliformes de acuerdo con la tabla correspondiente 333, tomando como base el número de tubos en que se observe producción de gas. k) Reportar: Número más probable de coliformes por gramo o mililitro de muestra NMP/g ó NMP/ml. 4.4 DETERMINACIÒN DE ORGANISMOS COLIFORMES FECALES: USANDO LA TABLA 333. Prueba presuntiva a) Inocular 10 ml de la muestra en cada uno de los 3 tubos con 10 ml de CLST de doble concentración. b) Inocular con 1 ml de la muestra en cada uno de los 3 tubos con 10 ml de CLST concentración sencilla. c) Inocular 0.1 ml de la muestra en cada uno de los 3 tubos con 10 ml de CLST concentración sencilla. d) Incubar los tubos a 35° C durante 24 horas. e) Observar si hay producción de gas en los tubos a las 24 horas, si no la hay, seguir incubando hasta las 48 horas, si en este tiempo no hay formación de gas la prueba se considera negativa. f) Prueba confirmativa g) Agitar suavemente los tubos de CLST que resultaron positivos en la prueba presuntiva. h) Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo a caldo EC. i) Incubar a 44.5 °C durante 24 horas. j) Considerar la prueba (+) si hay formación de gas en cualquier cantidad, si no existe, incubar por 24 h más y si no existe producción de gas se reporta como negativa el análisis. k) Determinar el número de organismos coliformes fecales de acuerdo con la tabla correspondiente 333, tomando como base el número de tubos en que se observe producción de gas. l) Reportar: Número más probable de coliformes por gramo o mililitro de muestra NMP/g ó NMP/ml. 75 Laboratorio de Técnicas Microbiológicas UPIBI-IPN 4.5 DETERMINACIÓN DE ORGANISMOS COLIFORMES FECALES PARA AGUA POTABLE Y HIELO, usando la tabla (555): Prueba presuntiva a. En caso de hielo dejar fundir completamente la muestra, homogenizar la muestra y transferir 10 ml a cada uno de 5 tubos que contienen 20 ml de caldo lauril sulfato triptosa (CLST) de doble concentración, 1.0 ml a otros cinco tubos que contiene 10 ml de CLST de concentración sencilla y 0.1 ml de muestra a otros 5 tubos que contienen 10 ml de CLST de concentración sencilla. b. Incubar los tubos a 35 °C, observar a las 24 ± 2 horas y observar si hay formación de gas, si no tiene incubar otras 24 ± 2 horas, si en este tiempo no hay formación de gas la prueba se considera negativa Prueba confirmativa c. De cada tubo que muestre formación de gas, tomar una asada y sembrar en un número igual de tubos que contienen 10 ml de caldo EC. Incubar a 44.5 ± 0,5 °C por 24 ± 2 horas, si en este tiempo no hay formación de gas, incubar otras 24 horas, en casi de no haber gas la prueba se considera negativo. d. La presencia de gas, en cualquier cantidad, dentro del tiempo de incubación hace positiva la prueba. b) Determinar el número de organismos coliformes de acuerdo con la tabla correspondiente 555 tomando como base el número de tubos (+) en la prueba confirmatoria. c) Reportar: Número más probable de coliformes por gramo o mililitro de muestra NMP/g ó NMP/ml. Para la determinación de organismos coliformes fecales es lo mismo, solo cambian los medios de cultivo. Presuntivo: Caldo Lactosado y Caldo de bilis verde brillante y la temperatura de incubación es de 35°C 5.- RESULTADOS Y CUESTIONARIO Anota los resultados de todos los equipos en el siguiente cuadro. Equipo Muestra Organismos coliformes por NMP 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 5.1.-¿Qué son los organismos coliformes? 5.2.-Anota todos los componentes del caldo lactosado y menciona la función de cada uno de ellos. 5.3.- ¿Por qué se usa caldo lactosado de doble concentración para análisis de agua? 5.4.-Anota todos los componentes del caldo lauril sulfato triptosa y del caldo EC, menciona la función de cada ingrediente. 76 Laboratorio de Técnicas Microbiológicas UPIBI-IPN 5.5.-Anota todos los componentes del caldo lactosado y el caldo de bilis Verde brillante menciona la función de cada uno de ellos. 5.6.- ¿Por qué se les llama microorganismos indicadores a los coliformes? 5.7.- A que se debe la presencia de organismos coliformes fecales en muestras de agua y alimentos. 6.- ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS Analice la Técnica del Número Más Probable, presencia o ausencia de organismos coliformes totales y coliformes fecales en muestras de agua, así como el uso de las tablas. Analiza la presencia o ausencia de organismos coliformes totales y coliformes fecales en agua 7.- CONCLUSIONES Elabora las conclusiones con base a los resultados obtenidos y a los objetivos de la práctica. 8.- BIBLIOGRAFÍA Anota la bibliografía consultada para el reporte de esta práctica. 9.- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 9.1 American Public Health association 1998. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. Ed. Marvin L. Speck. E.U.A. 9.2 Fernández Escartín E. 1981. Microbiología Sanitaria Agua y Alimentos. Vol 1. Universidad de Guadalajara. ANUIES-SEP. México. 9.3 MOM-109-SSA-1994 Bienes y Servicios Procedimiento para la toma, manejo y transporte de muestras de alimentos para su análisis microbiológico. Secretaria de Salud México. 9.4 NOM-110-SSA-1994 Bienes y Servicios. Preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis microbiológico. Secretaria de Salud México. 9.5 NOM-112-SSA1-1994 Bienes y Servicios Determinación de bacterias coliformes Técnica del Número Más Probable. Secretaria de Salud. México. 77 Laboratorio de Técnicas Microbiológicas UPIBI-IPN PRÁCTICA No 10 IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS No. DE UNIDAD: IV Metabolismo bacteriano OBJETIVOS: El alumno identificará bacterias de interés, a través de su metabolismo microbiano. 1.2 Objetivos específicos 1.2.1 El alumno realizará pruebas para determinar la actividad enzimática sobre los carbohidratos y sales orgánicas como principales fuentes de carbono. 1.2.2 El alumno realizará pruebas de hidrólisis para aminoácidos y proteínas para demostrar su actividad enzimática. 1.2.3 El alumno realizará pruebas para demostrar la actividad enzimática en los procesos de óxidoreducción. 2. INTRODUCCIÓN El metabolismo es un proceso químico, mediante el cual los seres vivos transforman una serie de compuestos químicos con el fin de obtener energía. Los microorganismos son capaces de efectuar reacciones bioquímicas para degradar nutrientes cuyos productos finales permiten su identificación, a este grupo de reacciones se les denomina pruebas bioquímicas, las cuales se han clasificado según su origen: a) Reacciones de carbohidratos (almidón, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol, etcétera). b) Reacciones para sales orgánicas (citrato, malonato, urea). c) Reacciones para proteínas y aminoácidos (gelatina, caseína, triptófano, lisina, arginina y ornitina). d) Por el tipo de respiración que efectúan (aerobios estrictos, microaerofílicos, anaerobios facultativos y anaerobios estrictos). La identificación bacteriana preliminar pueden efectuarse observando las características de las colonias y la morfología microscópica, pero la caracterización final de un aislamiento bacteriano desconocido en género y especie se logra mediante la detección de ciertos sistemas enzimáticos exclusivos de cada especie. En el laboratorio estos sistemas se detectan inoculando una pequeña porción de la colonia aislada a una serie de medios de cultivo que contienen substratos específicos, e indicadores químicos que detectan los cambios de pH o la presencia de un subproducto. Para poder realizar una identificación bacteriana es necesario primero sembrar por estría a los microorganismos, ya que generalmente se parte de un cultivo mixto, de esta manera se logra aislar y observar su morfología colonial. Una vez que se tiene el cultivo puro, se transfiere a un medio de cultivo en la cual se desarrolle, para poder lograr estos pasos es necesario saber la temperatura óptima de crecimiento. Cuando se tiene el cultivo puro, se procede a realizar la tinción de Gram para clasificarlo y saber a qué grupo pertenece G+ ó G-. Además en la morfología microscópica permite conocer la forma y agrupación del microorganismo (bacilo, coco, coma, etc.) Recientes avances biotecnológicos son usados para el análisis microbiológicos. Las pruebas de identificación bioquímica esta miniaturizada y automatizada haciéndose el análisis más rápido y económico. Los microorganismos patógenos deben ser aislados e identificados debido a que producen enfermedades a cientos de personas causando daños económicos. Una vez aislados podemos medir 78 Laboratorio de Técnicas Microbiológicas UPIBI-IPN específicamente los cambios fisicoquímicos resultado del crecimiento o actividad metabólica aunque la formulación de un producto con proteínas, aceites, ácidos grasos, conservadores hace que en un momento dado favorezcan o inhiban el crecimiento microbiano. Algunos métodos utilizados para identificar grupos microbianos o microorgansimos (género y especie) son: Placa Petrifilm, Detección de Salmonella por el sistema VIDAS, Sistema API, Coli-complete, Sistema VITEK, Identificación por PCR, etc En nuestro caso identificaremos a los microorganismos por medio de pruebas bioquímicas de manera tradicional, ya que existen métodos “rápidos” que facilitan el trabajo, pero es necesario saber el fundamento. PRUEBAS BIOQUÍMICAS RECOMENDADAS PARA BACTERIAS GRAM NEGATIVAS Fermentación de carbohidratos (glc lac, sac, manitol, dulcitol, salicina, adonitol, sorbitol, raf, ram, xilosa) en el medio base CRF. Fermentación de la glucosa, producción de ácido sulfhídrico, producción de gas, en el medio TSI Descarboxilación de la lisina, en el medio LIA Movilidad, descarboxilación de la ornitina y la producción de indo, en el medio MIO Movilidad, producción H2S, producción de indol, en el medio SIM Prueba cuantitativa para la producción de ácidos. Prueba de Rojo de metilo, medio RM/VP Producción de ureasa, en caldo urea Hidrólisis de la gelatina (licuefacción de la gelatina), en el medio gelatina Crecimiento en caldo nutritivo Utilización de la esculina, medio de bilis y esculina Utilización del gluconato (oxidación), medio caldo gluconato peptona Requerimientos de oxígeno, condiciones aerobias y anaerobias Producción de Catalasa y oxidasa Reducción de nitratos, en caldo nitrato. Detección del metabolismo oxidativo /Fermentativo, en el medio OF con sacarosa Utilización del citrato, en citrato de Sodio Utilización de Malonato, en malonato Producción de acetil metil carbinol. PRUEBAS BIOQUÍMICAS RECOMENDADAS PARA BACTERIAS GRAM POSITIVAS Fermentación de carbohidratos (glc, lac, sac, manitol, dulcitol, salicina, adonitol, sorbitol, raf, ram, xilosa, etc.) Fermentación de la glucosa, producción de ácido sulfhídrico, producción de gas, medio de TSI Descarboxilación de la lisina, medio de LIA Movilidad, descarboxilación de la ornitina y la producción de indol, medio de MIO Movilidad, producción de indol y producción Crecimiento en bilis al 40 % Coagulasa Hidrólisis de gelatina (licuefacción de la gelatina), en el medio gelatina Hidrólisis de la esculina, en caldo esculina Producción de acetil metil carbinol, prueba Voges – Proskauer, medio VP/RM Producción de la fosfatasa, medio PDP Prueba de la DNAsa, en el medio agar ADN 79 Laboratorio de Técnicas Microbiológicas UPIBI-IPN de ácido sulfhídrico, medio SIM Crecimiento a 10 y 45 ª C Producción Catalasa y oxidasa Reducción con azul de metileno en leche Reducción de nitratos Hidrólisis en caldo hipurato de sodio Producción de hemólisis, en agar sangre Formación de cápsula Crecimiento en NaCl al 5, 10 y 15 % Hidrólisis de almidón, Sensibilidad a optoquina y bacitracina Debemos mencionar que para la identificación de un microorganismo es necesario consultar la literatura para hacer una selección de pruebas recomendable y logras su identificación lo más rápido posible y sin pérdida de tiempo y de pruebas, las pruebas antes mencionadas son algunas de las cuales podemos realizar en un momento dado y a continuación se describirán algunas de ellas. FUNDAMENTO DE ALGUNAS PRUEBAS BIOQUIMICAS 1 PRUEBA DE HIDRÓLISIS DEL ALMIDÓN Determinar la capacidad de un microorganismo para secretar la enzima amilasa para la degradación de almidón en moléculas más pequeñas para ser utilizadas en su metabolismo. 2 PRUEBAS DE FERMENTACIÓN DE CARBOHIDRATOS EN TUBOS CON CALDO ROJO DE FENOL Determinar la capacidad de un organismo de fermentar un carbohidrato incorporado a un medio, produciendo ácido y/o gas en una campana de Durham; el medio es líquido y como indicador contiene rojo de fenol. 3 PRUEBAS EN AGAR TRIPLE AZÚCAR Y HIERRO (MedioTSI) Detección de fermentadores de glucosa y lactosa en agar de hierro de Kligler (KIA) o agar triple azúcar hierro (TSI). Este medio sirve para determinar la fermentación de glucosa, sacarosa y lactosa además de la producción de gas a partir de glucosa y la producción de ácido sulfhídrico que precipita como sulfuro férrico al reaccionar con el hierro, la liberación del ácido sulfhídrico se libera por acción enzimática, de los aminoácidos que contienen azufre produciendo una reacción visible de color negro. La fórmula del TSI y del KIA son idénticas, salvo que el TSI contiene 10 g/l de sacarosa además de glucosa y lactosa (triple azúcar), el agar está preparado en pico de flauta, de tal manera que se tienen 2 cámaras de reacción dentro del mismo tubo. La porción inclinada, “pico de flauta” expuesta en toda su superficie al oxígeno, es aeróbica y la parte inferior llamado “fondo” está protegida del aire y es relativamente anaerobia. Al preparar el medio es importante que el medio solidifique en forma de pico de flauta y el fondo, además que estos tengan la misma longitud de aproximadamente 3 cm cada uno, a fin de conservar este efecto de las dos cámaras. La técnica de inoculación es por picadura y por estría en el pico de flauta, para esto hay que utilizar el asa recta, primero se introduce en la parte profunda y luego se estría el pico de flauta con un movimiento hacia uno y otro lado, el indicador de pH: rojo de fenol y un pH ácido da una coloración amarilla y en un pH alcalino es rojo. 4. PRUEBA DE ROJO DE METILO El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo entre 6-8 amarillo) y 4,4 (rojo), esta prueba es cuantitativa para la producción de ácido y requiere de organismos positivos que produzcan ácidos láctico, acético, o fórmico a partir de la glucosa, por la vía de la fermentación mixta. Dado que existen muchos microorganismos que producen ácidos, sólo se consideran rojo de metilo positivo aquellos 80 Laboratorio de Técnicas Microbiológicas UPIBI-IPN organismos que puedan mantener este pH bajo un largo tiempo de incubación (48-72 h), contrarrestando el sistema estabilizador de pH del medio. Controles Prueba Control negativo Control positivo Rojo de metilo Escherichia coli Enterobacter aerogenes 4.5. PRUEBA DE VOGES-PROSKAUER La reacción de Voges – Proskauer se basa en la conversión del acetilmetilcarbinol (acetoína) en diacetilo por acción del KOH al 40 % y el O2 atmosférico, la acetoína se convierte en diacetilo el -naftol actúa como catalizador para revelar un complejo de color rojo, el indicador de pH es el Rojo de metilo. Controles Prueba Control negativo Control positivo Voges - Proskauer Escherichia coli Klebsiella sp UTILIZACIÓN DE SALES ORGÁNICAS 6. PRUEBA DE CITRATO Algunos microorganismos pueden suministrar energía en ausencia de la fermentación o producción de ácido láctico empleando como única fuente de carbono al citrato. El metabolismo del citrato comprende una condensación de acetilo con la coenzima A y oxaloacetato para entrar en el ciclo de Krebs. Los productos obtenidos del metabolismo del citrato dependen del pH del medio si es alcalino se produce más acetato y formato con una disminución del lactato y CO2. Por encima del pH de 7 no hay producción de lactato y los productos son CO2 ácido fórmico y ácido acético. Con un pH ácido el acetil metilcarbinol y el lactato son los principales productos de la utilización del citrato. El medio utilizado para la fermentación del citrato contiene también sales de amonio inorgánicas, un organismo que es capaz de utilizar citrato como su única fuente de carbono utiliza también las sales de amonio como su única fuente de nitrógeno. Cualquier medio empleado para detectar la utilización de citrato por parte de las bacterias en estudio debe estar desprovisto de proteínas e hidratos de carbono como fuente de carbono. Controles Prueba Control negativo Control positivo Citrato de sodio Escherichia coli. Enterobacter aerogenes 7. PRUEBA DE MALONATO Determinar la capacidad de un organismo de utilizar malonato de sodio como única fuente de carbono, con la consiguiente alcalinidad. El malonato es un inhibidor enzimático ya que interfiere en la oxidación del ácido succínico en ácido fumárico, inhibiendo la acción catalítica de la enzima succinato deshidrogenasa, mediante un proceso de inhibición competitiva. El ácido malonico (malonato) se une a la enzima bloqueando los sitios activos de manera que la enzima no puede combinarse con su sustrato normal, el ácido succínico. Esto ocasiona un bloqueo en la oxidación del ácido succínico. 81 Laboratorio de Técnicas Microbiológicas UPIBI-IPN Según la concentración del malonato, el inhibidor puede retardar simplemente la velocidad de la oxidación del ácido succínico o provocar su completa inhibición. En el ciclo de Krebs, cada compuesto ácido es influido independientemente por enzimas específicas; se consume una molécula y se forma otra en un proceso por etapas. Si se ha suprimido la formación de un ácido, y no es reemplazado, como el ácido fumárico, el ciclo se Krebs deja de funcionar, por lo tanto la célula bacteriana, recurre al ciclo del ácido glioxílico para la producción de intermediarios, para ulterior biosíntesis en el metabolismo. Indicador de pH: Azul de bromotimol Controles Prueba Control negativo Control positivo Caldo malonato Salmonella Alcaligenes faecalis 8. PRUEBA DE UREASA La urea es una diamida del ácido carbónico y esta es fácilmente hidrolizada con la liberación de amoníaco y dióxido de carbono. La enzima ureasa que posee un microorganismo pueden hidrolizar a la urea que está presente en el medio de cultivo de acuerdo con la siguiente reacción: El amoníaco reaccionan en solución para formar carbonato de amonio, produciéndose una alcalinización y un aumento del pH del medio, el indicador de pH es el rojo de fenol. Controles Prueba Control positivo débil Control positivo rápido Control negativo Ureasa Klebsiella sp Proteus sp Escherichia coli HIDRÓLISIS DE PROTEÍNAS Y AMINOÁCIDOS: 9.- PRUEBA DE LICUEFACCIÓN DE LA GELATINA (MÉTODO DEL TUBO) Determinar la capacidad de un organismo de producir enzimas proteolíticas que, a su vez son detectadas por la digestión o licuefacción de la gelatina presente. Las proteínas que se producen son demasiado grandes para entrar en la célula por lo tanto para ser metabolizadas deben ser hidrolizadas a componentes más pequeños, las enzimas extracelulares de tipo proteolítico son secretadas por ciertas bacterias para desdoblar a las proteínas y esta capacidad ayuda a la identificación bacteriana. El catabolismo de las proteínas por las proteasas se da en dos etapas la primera origina polipéptido y posteriormente estos se desdoblan en aminoácidos individuales. Controles Prueba Control negativo Control positivo Gelatina Listeria monocytogenes Staphylococcus aureus 10. PRUEBAS EN MEDIO SIM. (MOVILIDAD, PRODUCCIÓN DE H2S E INDOL). El indol producido por las triptofanasas se combina con el aldehido del reactivo de Kovac´s o de Erlich, para originar un compuesto de color rojo. Las cepas móviles pueden apreciarse en este medio, por la turbidez que producen alrededor de la punción de siembra, mientras que aquellas cepas productoras de sulfhídrico se distinguen por la formación de un precipitado negro de sulfuro de hierro a partir del tiosulfato siempre que el medio se mantenga a un pH mayor a 7.2. 82 Laboratorio de Técnicas Microbiológicas UPIBI-IPN 11. MEDIO MIO (MOVILIDAD, INDOL Y ORNITINA). La prueba de la descarboxilación de la ornitina nos sirve para determinar la capacidad enzimática de un microorganismo de descarboxilarla para formar una amina, con la siguiente alcalinidad del medio. La descarboxilación es un proceso por el cual las bacterias que poseen enzimas descarboxilasas específicas son capaces de atacar a los grupos carboxilo del aminoácido dando una amina o una diamina y anhídrido carbónico, la enzima que efectúa esta reacción se llama ornitina descarboxilasa, la cual es una enzima inducida que es formada por el organismo cuando son cultivadas en un medio ácido en presencia del sustrato y los productos de la descarboxilación provocan un cambio de pH hacia la alcalinidad. Además la descomposición del aminoácido se produce anaerobicamente y el proceso es irreversible, no oxidativo y requiere de una coenzima común, el fosfato de piridoxal. El aminoácido L-ornitina es descarboxilado por la enzima ornitina – descarboxilasa para dar la diamina putrescina y anhídrido carbónico. En ocasiones podemos producir condiciones de anaerobiosis si recubrimos la superficie del medio con aceite mineral. La prueba de movilidad nos sirve para determinar si un microorganismo es móvil por la presencia de flagelos o inmóvil. La prueba de indol nos sirve para determinar si un organismo es capaz de producir indol a partir de de la oxidación del aminoácido triptófano. Este aminoácido puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar tres metabolitos indólicos principales: indol, escatol e indolacético. El proceso es efectuado por varias enzimas que en conjunto se denomina “triptofanasa” y el indicador de pH es el púrpura de bromocresol. Control Sustancia Control positivo Control negativo Indol Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Movilidad Enterobacter sp Klebsiella sp Descarboxilación de la ornitina Enterobacter cloacae Klebsiella sp 12. DESAMINACIÓN Y DESCARBOXILACIÓN DE AMINOÁCIDOS EN MEDIO LIA. (LYSINE IRON AGAR) En este medio se determina la descarboxilación de la lisina que se lleva a cabo en anaerobiosis y la desaminación de la lisina que se lleva a cabo en aerobiosis. La prueba de la descarboxilación de la lisina nos sirve para determinar la capacidad enzimática de un microorganismo de descarboxilarla para formar una amina, con la siguiente alcalinidad del medio. La descarboxilación es un proceso por el cual las bacterias que poseen enzimas descarboxilasas específicas son capaces de atacar a los grupos carboxilo del aminoácido dando una amina o una diamina y anhídrido carbónico, la enzima que efectúa esta reacción se llama lisina descarboxilasa, la cual es una enzima inducida que es formada por el organismo cuando son cultivadas en un medio ácido en presencia del sustrato y los productos de la descarboxilación provocan un cambio de pH hacia la alcalinidad. Además la descomposición del aminoácido se produce anaeróbicamente y el proceso es irreversible, no oxidativo y requiere de una coenzima común, el fosfato de piridoxal. El aminoácido L-lisina es descarboxilado por la enzima lisina – descarboxilasa para dar la diamina cadaverina y anhídrido carbónico. En ocasiones podemos producir condiciones de anaerobiosis si recubrimos la superficie del medio con parafina o vaselina. Al Preparar el medio es importante que se deje solidificar en pico de flauta y el fondo, que estos tengan la misma longitud de aproximadamente 3 cm. cada uno, a fin de conservar este efecto de las dos cámaras, el inicador de pH es el púrpura de bromocresol. 83 Laboratorio de Técnicas Microbiológicas UPIBI-IPN Controles: Aminoácido Control positivo Control negativo Descarboxilación de la Lisina Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae Desaminación de la Lisina Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae DETERMINACIÓN DEL METABOLISMO OXIDATIVO Y/O FERMENTATIVO 13. REDUCCIÓN DE NITRATOS A NITRITOS La capacidad de un organismo para reducir nitratos a nitritos es una característica importante utilizada para la identificación y diferenciación de muchas especies, todas las enterobacterias, excepto ciertos biotipos de Enterobacter agglomerans reducen los nitratos. Los organismos que reducen nitratos tienen la capacidad de obtener oxígeno de los nitratos para formar nitritos y otros productos de reducción. La presencia de nitritos en el medio se detecta añadiendo naftilamina y ácido sulfanílico, con la formación de un color rojo de diazonio, p – sulfobenceno – azo - naftilamina. El color en caso de ser positiva aparecerá a los 30 s de añadir los reactivos y dado que los reactivos solo detectan nitritos, este último proceso llevaría a una lectura falsa negativa, por lo tanto es necesario añadir una pequeña cantidad de polvo de Zn a los tubos que sean negativos. Los iones Zn reducen los nitratos a nitritos, y el desarrollo de un color rojo tras agregar el polvo de Zn indica la presencia de nitratos residuales y confirma la reacción negativa verdadera. Controles: Prueba Control positivo Reducción de nitratos Escherichia coli Control negativo Acinetobacter calcoaceticus 14. DETERMINACIÓN DEL METABOLISMO OXIDATIVO Y/O FERMENTATIVO DE LA GLUCOSA EN MEDIO DE HUGH Y LEIFSON Los microorganismos sacarolíticos degradan glucosa por vía fermentativa u oxidativa, los subproductos de la fermentación son ácidos mixtos relativamente fuertes, que pueden detectar en un medio de fermentación convencional. En cambio, los ácidos formados por degradación oxidativa la glucosa son sumamente débiles y para su detección se requiere de un medio de oxido – fermentación más sensible, como el medio OF. Este medio difiere de otros medios de fermentación de carbohidratos en lo siguiente: a.- La concentración de proteína (peptonas) ha disminuido del 1,5 al 0,2 %. b.- La concentración de hidratos de carbono está aumentada del 0,5 % al 1 %. c.- La concentración de agar está disminuida de 1,5 a 0,25, con lo cual su consistencia es semisólida. La menor relación proteína a carbohidrato reduce la formación de aminas alcalinas que pueden neutralizar las pequeñas cantidades de ácidos débiles derivados del metabolismo oxidativo. La concentración relativamente mayor de carbohidratos sirve para aumentar potencialmente la producción de ácido. La consistencia semisólida del agar permite que los ácidos formados en la superficie se difundan por todo el medio, facilitando la visualización del viraje del indicador de pH. Este medio es también apto para determinar la movilidad de un microorganismo. 84 Laboratorio de Técnicas Microbiológicas UPIBI-IPN La prueba OF presenta limitaciones, ya que los bacilos fermentadores de desarrollo más lento pueden no producir cambios de color durante varios días, y las especies que son esencialmente proteolíticas pueden con el tiempo producir reversiones de las reacciones débiles, confundiendo así la interpretación final. Para realizar esta prueba se necesitan dos tubos con 5 ml del medio en posición vertical, se inocula por picadura con la suspensión microbiana a estudiar, el asa debe ser introducida hasta 0,5 cm desde el fondo del tubo Cubrir un tubo con 1 ml de aceite mineral estéril o parafina fundida, dejando el otro tubo “abierto al aire”, es decir sin aceite o parafina. Incubar ambos tubos a 35 ° C durante 48 h o más, el indicador de pH: Púrpura de bromocresol. Interpretación. Tipo de metabolismo Tubo abierto Tubo cubierto Oxidativo Ácido – amarillo Alcalino – verde Fermentativo Ácido – amarillo Ácido – amarillo No sacarolítico Alcalino - verde Alcalino – verde Controles Prueba Fermentador de la glucosa Oxidador de la glucosa No sacarolítico OF Pseudomonas aeruginosa Moraxella sp Escherichia coli 15. PRUEBA DEL CIANURO DE POTASIO Determinar la capacidad e un organismo de vivir y reproducirse en un medio que contenga cianuro de potasio. La respiración es el conjunto de reacciones químicas en las que se libera energía. La transformación de la energía puede ser aerobia o anaerobia. La respiración aeróbica es un proceso biológico de oxidación – reducción que produce energía y por medio del cual un sustrato orgánico es oxidado, el mismo trasfiere electrones e iones hidrógeno por medio del sistema de transporte de electrones, al aceptor final de electrones, el oxígeno molecular. El proceso produce agua o peróxido de hidrógeno, según la especie bacteriana y su sistema enzimático. El cianuro de potasio es un inhibidor de la citocromo oxidasa a nivel del complejo IV de la cadena respiratoria, compite con él O 2 y actúa como aceptor final de electrones, bloqueando la respiración. Controles Prueba Control positivo Control negativo KCN Klebsiella Escherichia coli 16. PRUEBA DEL CITOCROMO OXIDASA Los citocromos son hemoproteínas que contienen fierro y actúan como el último eslabón de la cadena respiratoria, transfiriendo electrones (hidrógeno) al oxígeno, con formación de agua. El sistema citocromo oxidasa se encuentra en los organismos aerobios o anaerobios facultativos, de modo que la prueba de oxidasa es importante para identificar a aquellos organismos que carecen de la enzima o son anaerobios obligados. La prueba es muy útil para el conocimiento de las colonias sospechosas de ser enterobacterias (todas negativas) y para la identificación de colonias que se presume sean especies de Pseudomonas o Neisseria (positivas). 85 Laboratorio de Técnicas Microbiológicas UPIBI-IPN **Esta prueba utiliza el reactivo diclororhidrato de p-fenilendiamina, que actúa como aceptor final de electrones, sustituyendo al oxígeno, la p-fenilendiamina es incolora en estado reducido, pero en presencia de citocromo oxidasa y oxígeno atmosférico se oxida formando azul de indofenol. La prueba se lleva a cabo por 3 métodos que son: 1.- La técnica directa en placas, en la cual se añaden directamente 2 a 3 gotas de reactivo a las colonias aisladas que se han desarrollado en la placa. 2.- La técnica indirecta en tiras de papel filtro, en la que se añaden unas gotas del reactivo y, 3.- Tiras comerciales impregnados del reactivo y secos. En la zona de papel donde se halla el reactivo se extiende un asa de la colonia sospechosa. Se recomienda no emplear alambres de acero inoxidable, dado que los productos de la oxidación de la superficie formados al esterilizarse a la llama pueden producir reacciones falsas positivas. Controles: Prueba Control positivo Control negativo Citocromo oxidasa Pseudomonas aeruginosa Escherichia coli 17.- PRODUCCIÓN DE CATALASA Determinar la presencia de la enzima catalasa, que se encuentra en la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contiene citocromo. La catalasa es una enzima que se descompone en peróxido de hidrógeno en oxígeno y agua, químicamente la catalasa es una hemoproteína de estructura similar a la de la hemoglobina. El peróxido de hidrógeno se forma como uno de los productos finales del metabolismo oxidativo aeróbico de los hidratos de carbono. Si se deja acumular el peróxido de hidrógeno es letal para la célula bacteriana. La catalasa transforma al peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno en agua. Controles Prueba Control positivo Control negativo Catalasa Staphylococcus aureus Streptococcus sp 18 PRUEBA DE LA COAGULASA (SOLO PARA COCOS GRAM POSITIVOS) Probar la capacidad de un microorganismo de coagular el plasma por la acción de la enzima coagulasa. Un resultado positivo constituye por lo común el criterio de diagnóstico de para la identificación de S. aureus y con frecuencia se utiliza para indicar la virulencia de la cepa. La estafilocoagulasa, producida por S. aureus es relativamente estable al calor y resistente hasta 60 °C / 30 min. Esta enzima es una proteína que es excretada al medio extracelular y se inactiva fácilmente por las enzimas proteolíticas. 19 HEMÓLISIS EN AGAR SANGRE (SOLO PARA COCOS GRAM POSITIVOS) La infusión de músculo de corazón y la peptona, otorgan al medio un alto valor nutritivo, pues son la fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas y factores de crecimiento que permite el desarrollo de una gran variedad de microorganismos exigentes. El agregado de sangre al medio de cultivo, en concentración final de 5-10 %, aporta nutrientes para el crecimiento bacteriano, y permite detectar hemólisis. El medio está libre de azucares reductores, ya que estos influirían de forma adversa en reacciones hemolíticas. El tipo de hemólisis en agar sangre sirve para clasificar al género Streptococcus, la β hemólisis está 86 Laboratorio de Técnicas Microbiológicas UPIBI-IPN asociada con una completa lisis de la célula alrededor de la colonia, la hidrólisis parcial y se manifiesta por una coloración verde. hemólisis se asocia con una 20.- CRECIMIENTO EN NaCl AL 7.5 % Existen microorganismos que presentan crecimiento a diferentes concentración de sales y se les denomina halófilos, aunque existen otros que son denominados extremófilos ya que viven en condiciones extremas y su hábitat natural son los lugares a salinos. En condiciones normales, la sal hace que la célula se deshidrate debido a la ósmosis, cosa que no ocurre en los halofilicos debido a diversas adaptaciones fisiológicas que le permiten retener el agua para su metabolismo. 3. MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS 3.1. EQUIPO Incubadora a 35 ° C Autoclave Microscopio Horno 3.2. MATERIAL Portaobjetos Asas bacteriológicas Pipetas Pasteur Colorantes esporas Gradilla metálica para tinción de Colorantes para tinción de Gram 3.3. MEDIOS DE CULTIVO: Pruebas de cada uno para Gram positivos Pruebas de cada uno para Gram negativos Tinción de esporas Hidrólisis de almidón. Hidrólisis de almidón Crecimiento en MacConkey. Hemólisis en agar sangre Prueba de TSI. Resistencia a polimixina de 300 Prueba de LIA Prueba de TSI Prueba de citrato. Prueba de SIM Prueba de MIO Prueba de MIO Prueba de SIM. Licuefacción de la gelatina a 22 °C Licuefacción de la gelatina Utilización del citrato Prueba Prueba de oxidación –fermentación fermentación. Prueba de Voges Proskauer Prueba de ureasa. Prueba de ureasa Prueba de reducción de nitratos. Fermentación de glucosa Fermentación de glucosa. Fermentación de manitol Fermentación de lactosa. Fermentación de arabinosa Fermentación de sacarosa Fermentación de Xilosa Fermentación de manitol. de oxidación- 87 Laboratorio de Técnicas Microbiológicas UPIBI-IPN Fermentación de lactosa Fermentación Xilosa. Crecimiento en NaCl al 6.5 % Rojo de metilo. Prueba de reducción de nitratos Prueba de Vogues Proakauer Prueba de catalasa Crecimiento en caldo KCN. Prueba de oxidasa Prueba de malonato. Prueba de coagulasa Prueba de catalasa y catalasa 3.4. REACTIVOS: Solución de rojo de metilo Aceite mineral Solución de alfa-naftol Solución de peroxido de hidrogeno al 1 % Solución de KOH N,N,N,N-tetrametil-p- Reactivo de Kovac o Erlich fenilendiamina Solución de ácido sulfanílico Reactivos para tinción de Gram Solución de alfa naftilamina Reactivos para tinción de esporas Plasma de conejo Oxidasa Tween 80 estéril Catalasa Plasma de conejo Jeringas de 10 ml 3.5. BACTERIAS: Escherichia coli Micrococcus luteus Salmonella typhi Staphylococcus aureus Proteus mirabilis Lactobacillus acidophilus Pseudomonas aeruginosa Bacillus subtilis Shigella sp Corynebacterium glutamicum 4. DESARROLLO EXPERIMENTAL: A. Preparación del inoculo a) Tomar un inoculo del cultivo para realizar una tinción de Gram y esporas si fuera necesario, anotar la morfología microscópica y determinar si esta puro, si es así continuar con la identificación, si no lo está es necesario re-aislar. b) En un tubo de ensaye que contenga 5 ml de solución salina estéril, colocar una asada del cultivo y homogenizar perfectamente para obtener una suspensión microbiana. c) Dependiendo el Gram, solicitar las pruebas bioquímicas indicadas para Gram (+) o Gram (-) d) Ordenar los tubos por la forma de inoculación y sembrar primero aquellos que no tienen inhibidores Estría simple ( Citrato, placa con agar almidón, agar sangre) Picadura y estría (TSI, LIA) Picadura ( SIM, MIO, gelatina, OF ) 88 Laboratorio de Técnicas Microbiológicas UPIBI-IPN Caldos (Fermentación de carbohidratos, RM, VP, NaCl, Urea, CM, reducción de NO3 ,KCN..) e) De la suspensión microbiana sembrar los tubos y en el caso de los caldos se puede hacer con el asa o con una pipeta Pasteur colocar 2 gotas de la suspensión para que se estandarice un poco la cantidad de inoculo. f) Colocar una batería de bioquímicas como testigo g) Incubar los tubos 24 horas y leer h) La placa con agar almidón y agar sangre dividirla en cuatro partes, cada cuadrante corresponde para un alumno y el cuarto cuadrante queda como testigo. B LECTURA DE PRUEBAS PRUEBA LECTURA DE LAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS RESULTADO FERMENTACIÓN DE AZÚCARES Hidrólisis de almidón Agregar lugol sobre la estría + Positiva: Si se forma un halo claro alrededor de la estría. - Negativa: No se forma un halo claro alrededor de la estría. Fermentación de manitol +Positiva: El medio se torna amarillo con la producción de gas, la campana está llena de gas - Negativa: El color del medio es rosa-rojizo. Fermentación de lactosa + Positiva: el medio se torna amarillo con la producción de gas, la campana está llena de gas - Negativa: El color del medio es rosa-rojizo. Fermentación de TSI Fermentación de glucosa, lactosa y sacarosa con producción de H2S Glucosa positiva: Fondo del tubo amarillo. Sacarosa y lactosa positiva: Superficie amarilla Lactosa positiva: Color amarillo en el pico de flauta, Producción de H2S positivo: Coloración negra en el medio. Producción de CO2 y H2: Burbujas, ligera muesca sobre el costado del tubo ó desplazamiento del medio. Glucosa, sacarosa y lactosa ( - ) el medio se torna rojizo. Producción de H2S ( - ): sin coloración. Producción de CO2 y H2 ( - ): no hay burbujas. Prueba de rojo de Agregar 2 gotas de rojo de metilo metilo + Positiva: Color rojo en la superficie del medio de cultivo (Producción de acetil-metil-carbinol). -Negativa: No hay cambio en el color Prueba de VogesProskauer agregar 6 gotas de naftol y 2 gotas de KOH +Positiva: El cultivo cambia a color rojo, en todo el tubo. - Negativa: El cultivo no cambia de color 89 Laboratorio de Técnicas Microbiológicas UPIBI-IPN PRUEBA LECTURA DE LAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS RESULTADO UTILIZACIÓN DE SALES INORGÁNICAS Utilización de citrato + Positivo: Desarrollo abundante, cambio de color verde a azul de sodio - Negativa: No hay desarrollo ni cambio de color. Utilización de Positivo: Desarrollo abundante con o sin alcalinización (color azul). malonato de sodio Negativa: No hay desarrollo (medio de Hidrólisis de Producción ureasa urea + Positiva: Color rosa fucsia en el medio. de - Negativa: Sin cambio de color en el medio HIDRÓLISIS DE PROTEÍNAS Y AMINOÁCIDOS Licuefacción gelatina de la Para leer la prueba los tubos se colocan en el cuarto frío durante cinco minutos. + Positivo: licuefacción de la gelatina. - Negativo: Si no hay licuefacción de la gelatina volver a incubar, descartar la prueba negativa hasta los 14 días. MIO (movilidad, indol Movilidad: Crecimiento alrededor de la picadura. y ornitina) Descarboxilación de la ornitina: + Positiva: Color púrpura del medio. - Negativa: Color amarillo del medio. Después de leer las dos pruebas se agregan 3 gotas de reactivo de kovacs (p-dimetilaminobenzaldehído) y se observa: - Indol + Positivo: Se forma un anillo de color rosa o rojo. - Negativo: No se forma el anillo. SIM (producción de Producción de H2S: Presencia de un precipitado color negro H2S, indol y alrededor de la picadura o en todo el tubo movilidad) Producción de Indol: Presencia de un anillo de color rojo en la superficie al adicionarle el reactivo de Kovac’s. (pdimetilaminobenzaldehído) Movilidad: Turbidez alrededor de la picadura. Nota: Cuando el microorganismo es móvil y productor de ácido sulfhídrico el medio se torna completamente negro. LIA (Desaminación y Desaminación de aminoácidos: descarboxilación de + Positiva: La superficie del tubo es de color rojo vino. aminoácidos) - Negativa: La superficie no tiene cambios. Descarboxilación de aminoácidos + Positiva: El fondo del tubo es de color púrpura. - Negativa: El fondo del tubo es de color amarillo. 90 Laboratorio de Técnicas Microbiológicas UPIBI-IPN PRUEBA LECTURA DE LAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS RESULTADO METABOLISMO OXIDATIVO – FERMENTATIVO Reducción nitratos a nitritos de Agregar 3 gotas de naftilamina y 3 gotas de ácido sulfanílico. + Positiva: Aparición de un color rojo en 30 segundos - Negativa: Sin cambio de color. Prueba del cianuro + Positivo: Presencia de crecimiento (turbidez) de potasio - Negativo: Ausencia de crecimiento (medio claro) Prueba de citocromo Tomar una asada del cultivo TSI y colocarla en un pedazo de papel oxidasa filtro impregnada con el reactivo (N.N.N.N-tetrametil-p-fenilendiamina). + Positiva: aparición de un color azul violeta. - Negativa: No hay cambio de color. Determinación de TUBO SIN SELLO DE ACEITE metabolismo Oxidativo: + positivo ácido–amarillo, - negativo verde, sin cambios oxidativo y/o fermentativo de la Fermentativo: + positivo ácido–amarillo, - negativo verde, sin cambios glucosa (OF) Sacarolitico: + positivo ácido–amarillo, - negativo verde, sin cambios. TUBO CON SELLO DE ACEITE Oxidativo: + positivo ácido–amarillo, - negativo verde, sin cambios Fermentativo: + positivo acido–amarillo, - negativo verde, sin cambios Sacarolitico: + positivo acido–amarillo, - negativo verde, sin cambios. Prueba catalasa de la Tomar una asada del cultivo TSI y colocarla en un portaobjetos que contiene 2 gotas de peróxido de hidrogeno y observar. + Positiva: Presencia de burbujas de oxigeno. - Negativa: Ausencia de burbujas de oxigeno. Crecimiento en NaCl Incubar el tubo a 35 °C durante 24 h, después de este tiempo registrar AL 7.5 % la turbidez. Positiva: Turbidez del medio. Negativa: Sin cambio de color en el medio. Hemólisis sangre en agar a) -En una placa con agar sangre estriar con la cepa presuntiva de (solo para Streptococcus sp, al final de la estría enterrar el asa en el medio, cocos positivos) Gram para crear un ambiente de microaerofilia. b) Incubar durante 24 horas a 35 °C y determinar el tipo de hemólisis que presenta. Positiva: Hemólisis β transparente alrededor de la colonia. Positiva: Hemólisis color verde tenue alrededor de la colonia. Negativa: Sin cambio de color en el medio. 91 Laboratorio de Técnicas Microbiológicas UPIBI-IPN PRUEBA Prueba LECTURA DE LAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS de RESULTADO la a) -Sembrar una colonia del Staphylococcus sp en un tubo con 0.5 ml de caldo infusión cerebro-corazón. Incubar a 35ºC durante 24 h. coagulasa (Solo b) Inocular en la misma forma cepas conocidas de S. aureus y S. para cocos Gram epidermidis como testigos positivo y negativo. positivos) c) -En un tubo de ensaye colocar 0,2 ml del cultivo anterior, 0.2 ml de plasma de conejo diluido volumen a volumen con solución salina estéril. d) -Incubar en baño de agua de 35 a 37ºC y observar durante 6 h a intervalos de 1 h; si no hay formación de coágulo, observar a las 24 h. Considerar positiva la prueba si hay formación de coágulo. e) Para comprobar la coagulabilidad del plasma de conejo se añade una gota de cloruro de calcio al 5% a 0,5 ml de plasma reconstituido empleado, formándose un coágulo en 10-15 s. f) En caso de utilizar plasma de humano citratado o heparina. Positiva: Coagulación del plasma. Negativa: El plasma esta líquido. 5. RESULTADOS Y CUESTIONARIO 5.1. Explicar el significado de la presencia o ausencia de un halo claro, al agregar el lugol, en las pruebas de hidrólisis del almidón. 5.2. Explicar porqué en las pruebas de fermentación de azúcares en tubos con campana de Durham se emplea un indicador de pH, cual es el indicador y cuál es su intervalo de sensibilidad. 5.3. ¿Qué otros azúcares se pueden utilizar para la fermentación de azúcares? 5.4. ¿Cuál es el indicador de pH que se emplea en las pruebas de utilización de sales orgánicas y cuál es su intervalo de sensibilidad? 5.5. Explicar cuál es la utilidad de detectar la capacidad de hidrólisis de proteínas que tienen ciertos microorganismos. ¿De qué manera se detectan estas enzimas proteolíticas de los microorganismos? 6. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS Discutir la importancia de la morfología microscópica y colonial, el aislamiento de los microorganismos, la adecuada selección de pruebas bioquímicas a realizar y el uso de las claves para la identificación de los microorganismos. 7. CONCLUSIONES 7.1. Elaborar las conclusiones con base a los resultados obtenidos, al análisis y discusión de éstos, a la bibliografía consultada y a los objetivos de la práctica. 7.2. Concluir el género del microorganismo analizado de acuerdo a las pruebas bioquímicas. 8. BIBLIOGRAFÍA UTILIZADA PARA LA ELABORACIÓN DE ESTA PRÁCTICA 8.1 Koneman, E.W. y S.D. Allen, W. R. Bocuell. Diagnóstico Microbiológico. 5ª edición Médica Panamericana. 2001. México. 1432 p. 8.2 Mac Faddin. Pruebas Bioquímicas, Identificación de Bacterias de Importancia Clínica. 3ª Edición. Médica panamericana. Buenos Aires. 850 p. 92 Laboratorio de Técnicas Microbiológicas UPIBI-IPN Llenar los siguientes cuadros y con la ayuda de la bibliografía y a la información obtenida durante el desarrollo de la practica menciona el género y si es posible la especie del microorganismo. Nombre del microorganismo: ______________________________________________________ Resultados obtenidos para bacterias: Gram positivas Tinción de esporas Hidrólisis de almidón Hemólisis en agar sangre Fermentación de glucosa / gas Fermentación de manitol / gas Fermentación de arabinosa /gas Fermentación de Xilosa / gas Fermentación de lactosa / gas Rojo de metilo. Prueba de Voges Proskauer Prueba de OF Prueba de TSI Glucosa positiva: Glucosa negativa: Sacarosa y lactosa positiva: Sacarosa y lactosa negativas: Lactosa positivo: Lactosa negativo: Producción de H2S: Prueba de SIM Resultado Gram negativas Hidrólisis de almidón. Crecimiento en MacConkey. Fermentación de glucosa. / gas Fermentación de sacarosa / gas Fermentación de manitol / gas Fermentación Xilosa / gas Prueba de Vogues Proakauer Fermentación de lactosa / gas Rojo de metilo. Prueba de Voges Proskauer Prueba de OF Prueba de TSI. Glucosa positiva: Glucosa negativa: Sacarosa y lactosa positiva: Sacarosa y lactosa negativas: Lactosa positivo: Lactosa negativo: Producción de H2S: Prueba de SIM Movilidad Movilidad Producción de H2S Producción de Indol Prueba de coagulasa Prueba de MIO Producción de H2S Producción de Indol Crecimiento en caldo KCN. Prueba de MIO Movilidad Descarboxilación Producción de Indol Movilidad Descarboxilación Producción de Indol Licuefacción de la gelatina a 22 °C Utilización del citrato Crecimiento en NaCl al 6.5 % Prueba de reducción de nitratos Prueba de oxidasa Prueba de ureasa Prueba de catalasa Resistencia a polimixina de 300 Prueba de reducción de nitratos. Prueba de citrato Prueba de ureasa. Prueba de malonato. Prueba de catalasa Prueba de oxidasa Prueba de LIA Resultado 93 Laboratorio de Técnicas Microbiológicas UPIBI-IPN Tablas de Cowan para la identificación de microorganismos Tabla No. 1 Forma Acido resistencia Esporas Movilidad Crecimiento aerobio Crecimiento anaerobio Catalasa Oxidasa Glucosa (prod. acido) O/F Micrococcus 1 S 2 3 4 5 S S S S 6 S + + D + + + + + Aerococcus Pediococcus Gemella Cocos anaeróbicos* Kurthia Corynebacterium Listeria Erysipelothrix Lactobacillus Arachnia Rothia Propionibacterium Actinomyces Bifidobacterium Eubacterium Clostridium Bacillus Nocardia Mycobacterium + w w + + w + + + + + O/- F F F F Staphylococcus Streptococcus Primera etapa para la identificación de bacterias Gram positivas. · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · + · · + + · · + · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · 8 R 9 10 11 12 13 14 15 16 17 R R R R R R R R R 18 R 19 R 20 R 21 R - - - + + + - - + +/- + + + - + + + - + + + + + + + + + + + + + + x + + + x + + x + + x - + D + x D + D + D + d D + + + w + + + + + x + + F F/- - - F F F F F F - F/- F/O/- O O O/NT · · · · · · · · + · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · + · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · + + · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · + · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · + · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · + + + · · · · · · · · · · · · · · · · 7 S + · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · <> <> <> · · · · · · + + + + + · · · · · <> · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · + · + · + + <> <> · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · + · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · + · · + 94 Laboratorio de Técnicas Microbiológicas UPIBI-IPN Tabla No. 2 Forma Movilidad Crecimiento aerobio Crecimiento anaerobio Catalasa Oxidasa Glucosa (prod. acido) Carbohidratos [f/o/-] Bacteroides 1 R + d D F/- Primera etapa para la identificación de bacterias Gram negativas. 2 S + D x - + 3 S + + + + O · 4 5 6 S S/R R + + + + + + + + + O · · + Veillonella + 7 R + + + + + O 8 R + + + + - 9 R + + + + O 10 11 12 13 14 15 R R R R R R + - + D + + + + + + + + + + + + + + - + + D + + + + + + + + + D O F F F F NT 16 17 18 R R R - + -* - + + - + - D + + - + - F · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · Neisseria · Branhamella · Acinobacter · · · · · · · · · · · · · Moraxella · · · · + · · · · · · · · · · · · Brucella · · · · + · · · · · · · · · · · · Bortedella · · · · + · · · · · · · · · · · · Chromobacterium lividum · · · · · · + · · · · · · · · · Alvaligenes · · · · · · Flavobacterium · · · · · · Pseudomona · · · · · · · Actinibacillus · · · · · · · Pasteurella · · · · · · Necromonas · · · · · Cardiobacterium · · · · · Chromobacterium violaceum · · · · Benecktea · · · · Vibrio · · · Plesiomonas · · Aeromonas · · Enterobacterias · Haemophilus · Eikenella + + + · · · · · · · · · + · · · · · · · · · · · + · · · · · · · · · · · + · · · · · · · · · · + · · · · · · · · · · · + · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · Campylobacter · · · · · Streptobacillus‡ · · · · · Mycoplasmas · · · · · · · · · · · + · · · · · · · · + · · · · · · · + · · · · · · · · + · · · · · · · · · + · · · · · · · · · + · · · · · · · · · · · + · · · · · · · · · · · + · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · + · · · · · · · · · + + + 95 Laboratorio de Técnicas Microbiológicas UPIBI-IPN Tabla No. 3. Equivalencias de los símbolos utilizados en las Tablas 1 y 2. Símbolo * D d F O w x <> S R NT Significado Tabla No. 1 Peptococcus, Peptostreptococcus (también Leuconostoc) También Actinomyces odontolyticus Reacciones diferentes en distintas especies del género Reacciones diferentes en distintas cepas Fermentación Oxidación Reacción débil No se conoce Variantes no esporágenas Formas típicas Presentan algunas características comunes Cocos Bacilos No probada Tabla No. 2 * ‡ x NT + d () (d) (w) w/D · Crecimiento en aire + CO2 Crecimiento en oxígeno 5-6% También Shigela dysenteriae Forma típica No se conoce Presentan algunas características comunes No probada por métodos comunes Para ambas tablas Del 85-100% de las cepas son positivas (generalmente todas o la mayor parte) Del 16-84% de las cepas son positivas (muchas , algunas) Del 0-15% de las cepas son positivas (ninguna, pocas ó algunas) Reacción tardía en la prueba o crecimiento tardío Reacciones positivas tardías en diferentes cepas Reacción débil y tardía Reacciones débiles y crecimiento escaso en diferentes cepas Reacciones diferentes en distintos grupos (géneros, especies y variedades) No se conoce Tablas tomadas de: Cowan, S. T. Manual for identification of medical bacteria2 nd Cambridge University 1974. pp167. 96 Laboratorio de Técnicas Microbiológicas UPIBI-IPN MÉTODOS RÁPIDOS UTILIZADOS EN MICROBIOLOGÍA Recientes avances biotecnológicos son usados para la identificación de microorganismos por medio de pruebas de identificación bioquímica de manera miniaturizada y automatizada haciéndose la identificación más rápida y económica. Los microorganismos deben ser aislados y después identificados, una vez aislados podemos medir específicamente los cambios fisicoquímicos resultado del crecimiento o actividad metabólica, para ello se han desarrollado diversos métodos debido a la necesidad de detectar a los microorganismos como el sistema API El APHI 20 E es un sistema estandarizado que permite la identificación de enterobacterias y otros bacilos Gram negativos no exigentes, que incluyen 21 pruebas bioquímicas mimiaturizadas. Principio: La galería del sistema APHI 20 E se compone de 20 microtubos que contiene los sustratos deshidratados. Loa microtubos se inoculan con una suspensión bacteriana Reactivos complementarios: API OF Es un método de identificación que emplea reacciones bioquímicas y el que vamos a utilizar es el API 20 E y el API STAPH. INSTRUCCIONES 1) Primero tenemos que aislar al microorganismo en medios selectivos, posteriormente colocarla en un caldo nutritivo o en una placa de agar de soya y tripticaseína, de tal forma que el cultivo sea de 18 h. 2) Sacar la tira API (galería) que contiene las siguientes pruebas ONPG, ADH, LDC, ODC, CIT, H2S, URE, TDA, IND, VP, GEL, GLU, MAN, INO, SOR, RHA, SAC, MEL, AMY y ARA. 3) Preparación de la galería: Reunir fondo y tapa de una cámara de incubación y repartir aproximadamente 5 ml de agua destilada en los alveolos para crqar una atmosfera humeda. Etiquetar en la lengüeta lateral. 4) Sacar la galería de su envase y colocarla en la cámara de incubación 5) Preparación del inoculo Preparar la suspensión microbiana en 5 ml de solución salina fisiológica y a una turbidez del nefelómetro de Mac Farland de 2. 6) Inoculación de la galería. Introducir la suspensión bacteriana en los tubos de la galería con la ayuda de una pipeta, evitando la formación de burbujas en el fondo de los tubos. 7) Para las pruebas: llenar el tubo y la cúpula 8) Para las pruebas: ADH LCD ODC H2S y URE crear una atmosfera anaerobia llenando la cúpula con aceite de parafina. 9) Cerrar la cámara de incubación 10) Incubar 36 h ± 2 °C durante 18-24h.+ Lectura de interpretación: 11) Prueba de TDA, agregar una gota de reactivo TDA. Un color marrón rojizo indica una reacción (+) 12) Prueba de IND: agregar una dota del reactivo JAMES. Un color rosado que se disemina en toda la cúpula indica una reacción (+) 13) Prueba de VP2 esperar un minuto de 10 minutos un color rosa o rojo indica una reacción (+), una débil coloración rosa que aparece después de 10 minutos en (-). 14) Interpretación: Determinar el perfil numérico, donde las pruebas están separadas en grupos de 3, como la galería API 20 E se compone de 20 ensayos sumar al interior de cada grupo los valores que corresponden a las reacciones positivas y se obtiene el bionúmero de 7 cifras. 15) Identificación: se realiza a partir de la base de datos y se obtiene con el software de identificación. 97 Laboratorio de Técnicas Microbiológicas UPIBI-IPN 16) En algunas ocasiones es necesario la realización de pruebas adicionales como la reducción de Nitratos a nitritos, para ello añadir una gota de los reactivos NIT 1 y Nit 2 en el tubo de GLU, esperar de 2 a 5 minutos y una coloración roja indica una reacción (+) 17) Control de calidad 1 Proteus mirabilis 2.- E. coli ONPG ADH LCD ODC - - - + + - + + H2s URE TDA IND v + + + - - - - - - + - GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA NO2 N2 v + - - - - v - - - + - - + + - + + - + - + + - Tabla de lectura Prueba Componerntes activos Cantidad 0.223 ADH LCD ODC CIT H2S URE TDA IND VP GEL GLU 2 nitro fenilβDgalactopiranosido L-arginina L- lisina L- ornitina Citrato de sodio Tiosulfato de sodio urea L- triptófano L-triptófano Piruvato de sodio Gelatina bovina D- glucosa MAN D-manitol 1.9 INO Inositol 1.9 SOR D-sorbitol 1.9 RHA L-rammnosa 1.9 SAC D-sacarosa 1.9 MEL D-Melobiosa 1.9 AMY Amigdalina 0.57 ARA L-arabinosa 1.9 ONPG 1.2.3.4.5.- 1.9 1.9 1.9 0.756 0.075 0.76 0.38 0.19 1.9 0.6 1,9 Reacciones-enzimas Β galactyosidasa (Orto Nitrofenil βD galactopiranosido Arginina DiHidrolasa Lisina Descarboxilasa Ornitina DesCarboxilasa Utilización del CITrato Producción de H2S UREasa Triptofano DesAminasa Producción de InDol Producción de acetoina GELatinasa GLUcosa Oxidaciónfermentación MANitol FermentaciónOxidación Fermentación-Oxidación INOsitol Fermentación-Oxidación SORbitol Fermentación Oxidación RHAmnosa Fermentación-Oxidación SACarosa Ferm,entación-oxidación MELobiosa AMYgdalina Fermentación – Oxidación ARAbinosa Fermentación Oxidación Resultados Negativo Incoloro positivo Amarillo (1) Amarillo Amarillo Amarillo Verde palido- amarillo Incoloro grisáceo Amarillo amarillo Verde pálido amarillo Rosa pálido No difusión Azul-azul verdoso Anaranjado(2) Anaranjado Anaranjado (2) Azul-verde azu (3)l Depósito negro Rojo anaranjado(2) Marrón rojizo rosa Rosa –rojo(5) Azul-azul verdoso amarillo Azul-azul verdoso amarillo Azul-azul verdoso amarillo Azul-azul verdoso amarillo Azul-azul verdoso amarillo Azul-azul verdoso amarillo Azul-azul verdoso amarillo Azul-azul verdoso amarillo Difusión del pigmento negro Amarillo/amarillo La aparición de un color amarillo ligero implica un resultado + La aparición de un color naranja tras 36 h de incubación debe considerarse negativa Lectura en la cúpula (zona aerobia) La fermentación comienza en la parte inferior de los tubos, mientras que la oxidación empieza en la cúpula Una ligera coloración rosa, que aparece tras 10 minutos debe ser leída como negativa 98
© Copyright 2024 ExpyDoc
