Práctica de laboratorio #3

04/05/15
LABORATORIO DE INCOCUIDAD Y BIOSEGURIDAD DE ALIMENTOS
Análisis Microbiológico de Recuento Total aerobio,
Lab N°3
Coliformes Totales, Coliformes Fecales y Escherichia coli en
muestras de agua, alimentos y superficies.
OBJETIVOS:
1. Determinar el número más probable de Coliformes Totales, Coliformes fecales y
Escherichia coli en muestras de aguas potables, residuales y alimentos, así como el
recuento total aerobio mesófilo en agua potable y superficies.
REACTIVOS:
1. Agua peptonada estéril 0,1 %: Preparar una solución de peptona al 10 % en agua destilada.
Diluir en un volumen determinado para obtener una solución final al 0,1 %. El pH final
debe ser 6,8.
2. Caldo lauril triptona: Diluir 20,0 g triptona, 5,0 g lactosa, 2,75 g K2HPO4, 2,75 g KH2PO4, 5,0
g NaCl y 0,1 g sulfato lauril de sodio en 1 l de agua grado reactivo. Mezclar y calentar hasta
disolver, dispensar tubos con campana de Durham invertida. Autoclavar y ajustar el pH a
6,8 ± 0,2. Preparar a doble concentración cuando se utilizan inóculos de 10,0 ml.
3. Caldo lactosa bilis verde brillante: Diluir 10,0 g peptona, 10,0 g lactosa, 10,0 g de bilis de
buey y 0,0133 g de verde brillante, en 1 l de agua grado reactivo. Mezclar y calentar hasta
disolver, dispensar en tubos con campana de Durham invertida. Autoclavar y ajustar el pH
a 7,2 ± 0,2.
4. EC-MUG: Diluir 20 g de triptona, 5 g de lactosa, 1,5 g sales biliares N°3, 4,0 g fosfato de
dipotasio hidrogenado, 1,5 g fosfato de potasio dihidrogenado, 5 g Cloruro de sodio (NaCl)
y 0,05 g de 4-metilumbeliferil-β-D-glucorónico en 1 L de agua reactivo. Mezclar y calentar
hasta disolver, dispensar en tubos sin campana de Durham invertida, estos tubos no
deben presentar fluorescencia bajo una longitud de onda de 366 nm. Autoclavar y ajustar
el pH a 6,9 ± 0,2.
5. Agar estándar: Diluir 5,0 g triptona, 2,5 g extracto de levadura, 1,0 g glucosa y 15,0 g agar
en 1 L de agua grado reactivo. Autoclavar a 121 ºC durante 15 min. Ajustar el pH a 7,0
±0,2.
6. Hidróxido de sodio 0,1 M: pesar 2 g de NaOH y disolver en 500 ml de agua destilada.
MATERIALES:
Placas de petri estériles
Pipetas estériles de 0,1 ml, 1 mL y, 5 ml
Tubos con campana de Durham invertida
Gradillas
Palillos de madera estériles
Beakers 500 ml
Espátulas
Probeta de 250 ml
EQUIPO:
Incubadora a 35 °C
Baño María a 45 °C, 44,5°C
Autoclave
Balanza
Lámpara UV
INTRODUCCIÓN:
1. Determinación del Recuento Total Aerobio Mesófilo:
El término “recuento total” resulta muy ambicioso dentro de la Microbiología, por cuanto el
crecimiento por obtener dependerá de la temperatura, atmosfera y nutrientes presentes en el
medio de cultivo por usar, los cuales van a seleccionar una subpoblación específica. El recuento
total es una prueba de rutina en el Laboratorio de Microbiología de Alimentos, con la cual se
puede estimar la vida útil de productos no inoculados.
El RTAM permite determinar la vida útil de una muestra al cuantificar las bacterias presentes en la
misma mediante la inoculación de un volumen definido de diversas diluciones de la muestra en
diferentes placas de petri que contienen un medio de cultivo apto para el crecimiento de bacterias
aerobias mesófilas, durante un tiempo de incubación y a una temperatura específica.
Cuadro 1. Relación de la vida útil del producto con el resultado del recuento total
Recuento total aerobio mesófilo UFC/g o mL
<10 -10
6
10 -10
8
>10
6
7
Interpretación
Se puede almacenar (a mayor recuento, menor será
este tiempo)
Ingerir de inmediato
Desechar
Se puede realizar de dos maneras: por vaciado o por esparcimiento. Teóricamente, a partir de
cada célula presente en la muestra, se obtendrá una colonia. Este concepto no es totalmente real,
pues a veces resulta imposible separar grumos de bacterias. Por esta razón el recuento total se
reporta como UFC (Unidades Formadoras de Colonias)/g o mL, según convenga. Se pretende
realizar diluciones de la muestra, hasta obtener un rango contable entre 25-250 UFC/placa para
bacterias, con la excepción de Bacillus cereus y hongos filamentosos, donde el rango contable va
de 3-30 UFC.
 Recuento total por vaciado: a partir de cada dilución preparada (recolección y tratamiento
de muestra) se inoculará por duplicado con 1 mL a placas Petri estériles, previamente
rotuladas. Para inocularlas, se abre de forma aséptica y se deja decantar la pipeta
libremente en ángulo de 45°, luego se hace pasar su punta a un sitio seco, con el objeto de
que drene el sobrante de muestra por capilaridad (no se sopla). En el caso de utilizar 0,1
mL, de cada dilución, se obtendrá una dilución decimal adicional (0,1 mL de la dilución 10-4
equivale a 10-5 y su medición debe hacerse entre marcas).
Como estrategia ahorrativa, puede emplearse la misma pipeta en este trasvase, siempre y
cuando se vaya de la dilución más diluida a la más concentrada. A cada placa Petri se le
agregará entre 12-15 mL de agar estándar fundido a 44,46 °C en baño maría. Cada plato
debe ser mezclado completamente, sin que haya derrames o se toque la tapa, moviendo
en forma de ocho. No debe transcurrir más de 20 minutos entre la realización de la
primera dilución y el agregar el agar.
Incubación: una vez sólido el agar se debe incubar las placas invertidas (para evitar la
aparición de esparcidores) a 35 °C durante 48 horas en humedad controlada.
Conteo: se cuentan aquellos platos que contengan entre 25-250 UFC/g o mL.
Errores: diversos errores pueden causar resultados no interpretables o inciertos en la
técnica de recuento total. Entre ellos se encuentran los siguientes:
 Agentes inhibitorios en la muestra
 Agentes inhibitorios en el medio
 Diluciones inadecuadas
 Homogeneización inadecuada
 Error de conteo
 Contaminación
 Artefactos
 Error del operador

Recuento total por esparcimiento: se hace uso de medios ya preparados sobre los cuales
se esparce 0,1-0,5 ml de las diluciones preparadas (por duplicado) con asa o la punta de la
pipeta utilizada en la aplicación de la muestra. No incurrir en un volumen mayor porque e
quebraría el agar. Se deja secar durante 15 minutos y luego se incuba como fue descrito
anteriormente. Este método presenta varias ventajas sobre la técnica de vaciado; entre
ellas, las bacterias no sufren de estrés por temperatura, puede apreciarse la morfología
colonial, puede utilizarse medios opacos y el repique es más fácil de hacer; no obstante, su
principal desventaja radica en que es menos sensible que la técnica del medio empleado,
tiempo, temperatura y atmósfera de incubación.
2. Determinación del número más probable (NMP) para Coliformes Totales, Coliformes
Fecales y Escherichia coli
El NMP de los Coliformes totales, fecales y escherichia coli funge como indicador de
contaminación fecal en aguas, ya que permite recuperar las bacterias “golpeadas” por medio de
una fase presuntiva que se encarga de brindarles un medio rico para que se multipliquen,
posteriormente la fase confirmatoria tiene como objetivo obtener específicamente las bacterias
que se desean cuantificar mediante las tablas estadísticas.
La técnica de NMP es una técnica estadística e indirecta, aplicada a muestras con bajo número de
microorganismos (<10 UFC/g) o con bacterias dañadas debido al calor, acidez, congelación,
radiación u otro y donde se busca diluir a extinción el microorganismo evaluado. El NMP da un
estimado de la población y no identifica especies en particular.
En esta técnica se utilizan una serie de tubos para cada dilución. Las series pueden ser de 3, 5 ó
hasta de 10 tubos cada una. A mayor número de tubos por dilución, mayor será la sensibilidad de
la prueba (para análisis de potabilidad de agua se utilizaran series de 5 tubos y para el análisis de
alimentos series de 3 tubos).
Al igual que en recuento total, la técnica NMP presenta problemas al analista y está sujeta a varias
fuentes de error, entre ella se encuentran:




Falsos negativos debido a la presencia de agentes inhibitorios en la muestra
Falsos positivos debido a sustancias dentro de la misma muestra
Error de diluciones
Células dañadas o muertas
Se recomienda la preparación de al menos cinco diluciones de la muestra de alimentos por
analizar al hacer uso de esta técnica, a no ser que ya se tenga experiencia con ella.
La fase de preenriquecimiento (presuntiva) generalmente se lleva a cabo en medio líquido y a
partir de ella no se da ninguna interpretación.
La fase confirmatoria es muy versátil, puede realizarse en medios líquidos o sólidos y puede leerse
con base en la detección de producción de gas, turbidez, detección de ácido o base, con métodos
de reducción, u otros.
Determinación del NMP: se utiliza únicamente el resultado de 3 diluciones consecutivas para
determinar el NMP, este se reporta como NMP/g o ml.

Prueba presuntiva: la fase de enriquecimiento se puede llevar a cabo en series de 3 ó 5
tubos de caldo lactosado simple (CLS) o caldo lauril triptona simple con campana Durham.
Este último medio es más selectivo que el caldo lactosado. Se inocula 1 mL de cada
dilución en caso de alimentos y 0,1 , 1,0 y 5,0 ml en el caso de y se incuba (48 ± 3) horas a
(35 ± 1) °C. los tubos que presentan gas y crecimiento bacteriano (Turbidez) luego de este
periodo de incubación, se consideran como presuntivamente positivos. (Los tubos pueden
ser revisados a las 18 ó 24 horas, si están positivos en ese momento, se pasa a la fase
confirmatoria.

Prueba confirmatoria:
Coliformes totales: se subcultivan todos los tubos que presentaron gas con crecimiento
bacteriano a caldo bilis verde brillante, usando asa o palillo estéril. Se incuba a (35 ± 1) °C
durante (48 ± 3) horas y los tubos con gas y crecimiento bacteriano se interpretan como
coliformes totales / g o mL.
Coliformes fecales: se subcultiva cada tubo con gas y crecimiento bacteriano positivo (a partir
de la prueba presuntiva) a caldo EC-MUG, el cual debe incubarse a (44,5 °C ± 0,2) °C por 24
horas únicamente. Los tubos que presenten formación de gas y crecimiento bacteriano se
considerarán coliformes fecales.
Esterichia coli: Todos los tubos de caldo EC-MUG con formación de gas y crecimiento
bacteriano, se les agregará una gota de hidróxido de sodio el cual permitirá observar de mejor
manera el color fosforescente bajo una lámpara de luz ultravioleta que indica la presencia de
Escherichia coli. Con el fin de asegurar que efectivamente los tubos contienen Escherichia coli
se le agregará 5 gotas del reactivo erlich (alcohol etilico, p-dimetilaminobenzaldehído y ácido
clorhídrico concentrado), los resultados positivos se muestran por la presencia de un color
rojo o rojo-violeta en la superficie de la capa de alcohol en el cultivo. Un resultado negativo se
muestra amarillo.
PROCEDIMIENTO:
A. Preparación de disoluciones de alimentos
1. Pesa la muestra (pepino, pollo cocido o sandia) en un recipiente estéril en balanza
granataria y de manera aséptica, 25 g de muestra y 225 ml de diluente (Agua peptonada)
esto se homogeniza en una licuadora (disolución madre 10-1). A partir de la disolución
madre se prepara disoluciones de 10-2 y 10-3 según el anexo 1.
B. Determinación del Recuento Total Aerobio Mesófilo:
Alimentos
1. A partir de las diluciones preparadas (Alimento), se toma 1,0 ml de muestra y se coloca en
placas de Petri debidamente rotuladas (10-1, 10-2, 10-3, etc).
2. Se toman 0,1 y 1 ml de agua potable y se vierten en las placas con su respectiva
identificación (ver anexo 2).
3. Se vierten de 10 ml a 12 ml de agar estándar, fundido previamente en el autoclave y
mantenido a (44 – 46) °C hasta su uso en cada placa petri.
4. Una vez que se tienen la muestra y el medio en la placa, se homogenizan con movimientos
de ocho.
5. Se deja solidificar la mezcla por 15 min, luego se invierte la placa.
6. Se incuba a 35 °C durante 48 h.
7. Se cuentan las colonias en las placas de Petri que contengan entre 30 colonias y 300
colonias y se divide el número entre el volumen de muestra que se depositó en la placa
(en ml).
8. Se reporta el dato obtenido como UFC/ml:
UFC/mL= _____Colonias contadas__x dilución (10-1=10, 10-2 = 100, 10-3 = 1000)
Volumen real de muestra en la placa (mL)
1.
2.
3.
4.
Superficies
Tome una muestra de una superficie con el hisopo facilitado por el profesor.
Raye en todas las direcciones la superficie de la placa Petri con el agar solidificado.
Coloque en la incubadora a 35 °C por 48 horas.
Transcurrido el tiempo anote los resultados obtenidos (Cualitativamente).
C. Determinación del número más probable para Coliformes Totales
Alimento
Fase presuntiva
1. Utilizar tres series (10-1, 10-2y 10-3) de tres tubos agregando 1 ml de cada disolución a los
tubos con 10 ml de caldo lauril sulfato e inocular.
2. Incubar a (35 ± 0,5) °C durante (24 ± 2) horas y examinar si hay crecimiento y producción
de gas y acidificación del medio.
3. Reincubar y re-examinar los tubos que no cumplan las características anteriores hasta
completar las (48 ± 3) h.
Fase confirmatoria
1. Con un palillo de madera estéril, transferir crecimiento de cada tubo presuntivamente
positivo a un tubo que contiene 5 ml de caldo de lactosa bilis verde brillante.
2. Incubar a (35 ± 0,5) ºC durante (48 ± 3) horas.
3. Considerar positivos aquellos tubos que presenten crecimiento con producción de gas y
reportar según tabla de NMP (ver Anexo 3).
Agua
Fase presuntiva
4. Utilizar tres series (0,1 ml, 1,0 ml y 10,0 ml) de cinco tubos con 10 ml de caldo lauril sulfato
e inocular.
5. Incubar a (35 ± 0,5) °C durante (24 ± 2) horas y examinar si hay crecimiento y producción
de gas y acidificación del medio.
6. Reincubar y re-examinar los tubos que no cumplan las características anteriores hasta
completar las (48 ± 3) h.
Fase confirmatoria
4. Con un palillo de madera estéril, transferir crecimiento de cada tubo presuntivamente
positivo a un tubo que contiene 5 ml de caldo de lactosa bilis verde brillante.
5. Incubar a (35 ± 0,5) ºC durante (48 ± 3) horas.
6. Considerar positivos aquellos tubos que presenten crecimiento con producción de gas y
reportar según tabla de NMP (véase Anexo 4).
D. Determinación del número más probable para Coliformes Fecales
Alimento
Fase presuntiva
7. Utilizar tres series (10-1, 10-2y 10-3) de tres tubos agregando 1 ml de cada disolución a los
tubos con 10 ml de caldo lauril sulfato e inocular.
8. Incubar a (35 ± 0,5) °C durante (24 ± 2) horas y examinar si hay crecimiento y producción
de gas y acidificación del medio.
9. Reincubar y re-examinar los tubos que no cumplan las características anteriores hasta
completar las (48 ± 3) h.
Fase confirmatoria
7. Con un palillo de madera estéril, transferir crecimiento de cada tubo presuntivamente
positivo a un tubo que contiene 5 ml de caldo de lactosa bilis verde brillante.
8. Incubar a (35 ± 0,5) ºC durante (48 ± 3) horas.
9. Considerar positivos aquellos tubos que presenten crecimiento con producción de gas y
reportar según tabla de NMP (ver Anexo 3).
Agua
Fase presuntiva
1. Utilizar tres series (0,1 ml, 1,0 ml y 10,0 ml) de cinco tubos con 10 ml de caldo lauril sulfato
e inocular.
2. Incubar a (35 ± 0,5) °C durante (24 ± 2) horas y examinar si hay crecimiento y producción
de gas.
3. Reincubar y re-examinar los tubos que no cumplan las características anteriores hasta
completar las (48 ± 3) horas.
Fase confirmatoria
1. Con un palillo de madera estéril, transferir crecimiento de cada tubo presuntivamente
positivo a un tubo que contiene 5 ml de CEC.
2. Incubar en baño maría a (44,5 ± 0,2) ºC durante (24 ±2) horas.
3. Considerar positivos aquellos tubos que presenten crecimiento con producción de gas y
reportar según tabla de NMP (ver Anexo 4).
E. Determinación del número más probable para Escherichia coli
Alimento
Fase presuntiva
1. Utilizar tres series (10-1, 10-2 y 10-3) de tres tubos agregando 1 ml de cada disolución a los
tubos con 10 ml de caldo lauril sulfato e inocular.
2. Incubar a (35 ± 0,5) °C durante (24 ± 2) horas y examinar si hay crecimiento y producción
de gas y acidificación del medio.
3. Reincubar y re-examinar los tubos que no cumplan las características anteriores hasta
completar las (48 ± 3) horas.
Fase confirmatoria
1. Con un palillo de madera estéril, transferir crecimiento de cada tubo presuntivamente
positivo a un tubo que contiene 5 ml de caldo EC-MUG.
2. Incubar a (44,5 ± 0,2) ºC durante (24 ± 2) horas en baño maría.
3. Aquellos tubos que presenten crecimiento con producción de gas, colocar bajo una
lámpara UV y si presentan fluorescencia considerar como positivos, confirmar agregando 5
gotas del reactivo y reportar según tabla de NMP (ver Anexo 2).
Agua
Fase presuntiva
4. Utilizar tres series (0,1 ml, 1,0 ml y 10,0 ml) de cinco tubos con 10 ml de caldo lauril sulfato
e inocular.
5. Incubar a (35 ± 0,5) °C durante (24 ± 2) horas y examinar si hay crecimiento y producción
de gas y acidificación del medio.
6. Reincubar y re-examinar los tubos que no cumplan las características anteriores hasta
completar las (48 ± 3) horas.
Fase confirmatoria
4. Con un palillo de madera estéril, transferir crecimiento de cada tubo presuntivamente
positivo a un tubo que contiene 5 ml de caldo EC-MUG.
5. Incubar a (44,5 ± 0,2) ºC durante (24 ± 2) horas en baño maría.
6. Aquellos tubos que presenten crecimiento con producción de gas, colocar bajo una
lámpara UV y si presentan fluorescencia considerar como positivos, confirmar agregando 5
gotas del reactivo y reportar según tabla de NMP (ver Anexo 3).
Cuadro 1. Análisis de coliformes totales, fecales y escherichia coli en muestra de alimento y agua.
Colifomes Totales tubos
positivos
-1
10
10-2
10-3
NMP
Muestra
Colifomes Fecales tubos
positivos
-
Muestra
Escherichia coli tubos
positivos
-
Muestra
-
Colifomes Totales tubos positivos
0,1 ml
1 ml
NMP
10 ml
-
Colifomes Fecales tubos positivos
-
Escherichia coli tubos positivos
-
ANEXOS
Anexo 1. Preparación de disoluciones de alimentos
Anexo 2. Determinación del Recuento Total Aerobio Mesófilo:
Figura 1. Guía para preparación de diluciones
Anexo 3. Tabla para la determinación de NMP en muestras de alimentos utilizando inóculos de 1
ml, en series de tres tubos.
ç
Anexo 4. Tabla para la determinación de NMP en muestras de agua utilizando inóculos de 0,1 mL,
1,0 mL y 10,0 mL en series de cinco tubos.

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