Práctica de laboratorio #2

PRÁCTICA
LABORATORIO DE Inocuidad y Bioseguridad Alimentaria
2
FACTORES QUE AFECTAN EL CRECIMIENTO MICROBIANO
OBJETIVOS:
1. Evaluar el efecto de la temperatura y la adición de diversas sustancias en el crecimiento
microbiano
2. Determinar la estimulación o la inhibición de las bacterias acido lácticas en relación con
su capacidad para producir ácido láctico.
INTRODUCCIÓN
Puesto que nuestros alimentos son de origen vegetal y animal, vale la pena examinar las
características de los tejidos vegetales y animales que influyen en el crecimiento de los
microorganismos. Las plantas y los animales que sirven como fuente de alimento, todos ellos han
desarrollado mecanismos de defensa contra la invasión y proliferación de microorganismos, y
algunos actúan en los alimentos de cada uno de ellos o de todos para prevenir o retardar la
alteración microbiana de los productos que de ellos derivan.
El deterioro del alimento debe ser minimizado para prolongar el tiempo durante el cual un nivel
aceptable de características fisicoquímicas y organolépticas puede ser mantenido. Los parámetros
o factores que afectan la proliferación de microorganismos se puede categorizar como parámetros
intrínsecos y extrínsecos:
PARAMETROS INTRINSECOS
1.
2.
3.
4.
5.
pH
Contenido de humedad
Potencial de óxido-reducción (Eh)
Contenido de nutrientes constituyentes antimicrobianos
Estructuras biológicas
1. EFECTO DEL pH
La mayoría de los microorganismos crecen mejor a valores de pH alrededor de 7.0 (6.5 a 7.5)
mientras que son pocos los que crecen por debajo de 4.0. Las bacterias tienden a ser más exigentes
con el pH que los mohos y levaduras. Los valores de pH mínimos de algunos microorganismos se
representan en el Cuadro 1 de crecimiento; por ejemplo se ha demostrado que los valores de pH
mínimos para determinados lactobacilos dependen del tipo de ácido usado, siendo los ácidos cítrico,
clorhídrico, fosfórico y tartárico los que permiten el crecimiento a un valor más bajo que los ácidos
acético o láctico.
Cuadro 1. Rangos de pH mínimos y máximos para el crecimiento de microorganismos
Bacterias Gram negativas
Escherichia coli
Klebsiella pneumoniae
Proteus vulgaris
Pseudonomas aeruginosa
Salmonella typii
Vibrio parahaemolyticus
Bacterias Gram positivas
Bacillus cereus
Bacillus subtilis
Clostridium botulinum
Enterococcus spp
Staphylococcus aureus
Streptococcus lacti
pH mínimo
4.4
4.4
4.4
5.6
4.0-4.5
4.8
pH mínimo
4.9
4.5
4.7
54.8
4.0
4.3-4.8
pH máximo
9
9
9.2
8
8-9.6
11.0
pH máximo
9.3
8.5
8.5
10.6
9.8
9.2
En los alimentos, las frutas, las bebidas refrescantes, el vinagre y los vinos el pH está por debajo del
punto en el cual las bacterias crecen normalmente. En las frutas generalmente crecen mohos y
levaduras ya que estos son capaces de crecer a pH menor a 3.5.
En el cuadro 2 se muestran los valores aproximados de pH de algunos alimentos. La mayoría de las
carnes y alimentos marinos tienen un pH final alrededor de 5.6 o mayor por lo que se considera que
son productos sensibles a las bacterias así como a los mohos y levaduras.
La mayoría de las hortalizas tienen valores de pH más elevados que las frutas y por lo tanto son
alteradas por la actividad bacteriana. Con respecto a la carne se sabe que la carne de los animales
fatigados se altera con mayor rapidez que la de los animales descansados y esto es una consecuencia
directa de pH final alcanzado después de la terminación de la rigidez cadavérica. Después de la
muerte de un animal bien descansado, el 1 % de glucógeno se convierte en ácido láctico, que
directamente causan una disminución de los v alores de pH desde 7.4 hasta aproximadamente 7.6
Cuadro 2. VALORES DE pH EN ALIMENTOS SELECCIONADOS.
ALIMENTO
Espárragos
Vainicas
Remolacha
Zanahoria
Coliflor
Berenjena
Lechuga
Papas
Tomate
Carne de res
Jamón
Atún
pH
5.7-6.1
4.6-6.5
4.2-4.4
4.9-5.2
5.6
4.5
6.0
5.3-5.6
4.2-4.3
5.1-6.2
5.9-6.1
5.2-6.1
ALIMENTO
Manzana
Banano
Melón
Naranja
Ciruela
Uva
Mantequilla
Leche
Queso
Pollo
Pescado
Camarones
pH
2.9-3.3
4.5-4.7
6.3-6.7
3.6-4.3
2.8-4.6
3.4-4.5
6.1-6.4
6.3-6.5
4.9-5.9
6.2-6.4
6.0-6.8
6.8-7
Algunos alimentos se caracterizan por la acidez intrínseca; otros deben su acidez y pH a las
actividades de ciertos organismos; a este tipo se le denomina acidez biológica y es propio de
productos fermentados. Algunos alimentos son mas capaces que otros para contrarrestar los
cambios de pH; se dice que están tamponados, como por ejemplo, las carnes están más tamponadas
que las hortalizas por lo que resisten mejor los cambios de pH.
Un pH desfavorable afecta dos aspectos de una célula microbiana que respira: el funcionamiento
de esas enzimas y transporte de nutrientes al interior de la célula. El pH interno de casi todas las
células se haya próximo a la neutralidad. Cuando se sitúan microorganismos en medios por debajo
o por encima de la neutralidad, su capacidad para multiplicarse depende de su capacidad para llevar
el pH del medio a un valor o un intervalo más favorable. Cuando se sitúan a medios ácidos, las células
deben evitar que entren H+ o que se expulsen los iones H+ rápidamente a medida que entran. Estos
compuestos clave (DNA y ATP) necesitan neutralidad. Cuando la mayoría de los microorganismos
crecen en medios ácidos, los resultados de sus actividades metabólicas y el medio llegan a ser menos
acidas, mientras que los que crecen en medios de pH elevados tienden a efectuar una disminución
del pH. Por ejemplo bacterias como Clostridium acetobutylicum, elevan el pH del sustrato ´´CH3) a
partir del ácido pirúvico para elevar el pH de su medio de crecimiento. Cuando los aminoácidos son
descarboxilados se da un aumento del pH como consecuencia de las aminas resultantes (ejemplo;
histidina se descarboxila a histamina).
2. CONTENIDO DE HUMEDAD
Uno de los métodos más antiguos para conservar alimentos es la deshidratación o secado. La
conservación de alimentos por desecación es una consecuencia directa de la extracción o de la
ligazón de la humedad sin la cual los microorganismos no crecen. Las necesidades de agua de los
microorganismos se deben definir en términos de actividad de agua (aw) en el medio. Este
parámetro se define mediante la relación de presión del vapor de agua y del sustrato del alimento
con respecto a la presión del agua pura a la misma temperatura
𝑎𝑤 =
𝑝
𝑝0
Donde p es la presión del vapor de la solución y p0 es la presión de vapor del solvente (generalmente
agua). La aw de casi todos los alimentos frescos se haya por encima de 0.99. Los valores mínimos
indicados para el crecimiento de algunos microorganismos se muestran a continuación:
Cuadro 3. Aw MINIMOS PARA EL CRECIMIENTO BACTERIANO
TIPO DE MICROORGANISMO
Mayoría de bacterias Gram-negativas
Mayoría de bacterias Gram-positivas
Mayoría de levaduras
Mayoría de hongos
Bacterias halófilas (amantes de la sal)
Hongos xerófilos (amantes de la sequedad)
Levaduras osmófilas (prefieren presiones
osmóticas elevadas)
Aw mínimo
0.97
0.90
0.88
0.80
0.75
0.61
0.61
Cuadro 4. Aw MINIMOS PARA EL CRECIMIENTO BACTERIANO
MICROORGANISMOS SELECCIONADOS
Alternaria citri
Aspergillus fumigatus
Penicillium islandicum
Aspergillus flavos
Saccharomyces cerevisiae
Clostridium botulinum
Bacillus cereus
Clostridium perfringens
Escherichia coli
Salmonella spp
Vibrio parahaemolyticus
Staphylococcus aureus
Halobacterium halobium
Aw mínimo
0.84
0.82
0.83
0.78
0.90
0.94-0.97
0.95
0.95
0.95
0.95
0.94
0.86
0.75
En general las bacterias necesitan para el crecimiento valores de aw más elevados que los hongos,
teniendo las bacterias Gram negativas mayores posibilidades que las gram positivas. La mayoría de
las bacterias de la alteración no crecen por debajo de una aw igual a 0.91, mientras que los mohos
de la alteración son capaces de crecer a valores tan bajo como 0.80. Una excepción notable es el
caso de Staphylococcus aureus que puede crecer a valores d aw de 0.86.
El efecto general de la reducción de la aw por debajo del valor óptimo es aumentar la duración de la
fase lag de crecimiento y disminuir la velocidad de crecimiento y el tamaño de la población final. En
general, la estrategia empleada por los microorganismos como protección contra el estrés osmótico
es la acumulación intracelular de solutos compatibles. Los usados por las bacterias incluyen iones
K+, glutamato, glutamina, prolina, y-aminobutirato, alanina, glicinobetaína, sacarosa, trehalosa y
glucosil-glicerol. Los organismos gram negativos tienden a acumular prolina. Los hongos
halotolerantes (que toleran alta concentración de sal) y xerotolerantes (que toleran ambientes muy
secos) tienden a producir alcoholes polihídricos tales como glicerol, eritritol y arabitol que poseen
respectivamente 3.4 y 5 átomos de carbono en sus moléculas.
Con respecto a los compuestos específicos usados para disminuir la actividad de agua, se han
utilizado en diferentes estudios cloruro de sodio (NaCl), glicerol (CH 2OH-CHOH-CH2OH), cloruro de
calcio (CaCl2), glucosa (C6H12O6), sorbitol (C6H14O6), etilenglicol (CH2OH-CH2OH), acetamida
(CH3CONH2) o urea (CO(NH2)2).
Aunque los mecanismos no se conocen del todo es posible que todas las células microbianas
necesitan la misma aw interna eficaz. Las que son capaces de crecer en condiciones extremas de aw
al parecer lo hacen por su capacidad para concentrar sales, polioles y aminoácidos hasta niveles
internos suficientes no solo para evitar que las células pierdan agua sino para permitir que la célula
extraiga agua del medio externo casi exento de agua.
3. POTENCIAL DE OXIDO-REDUCCION (Eh)
El potencial de O/R de un sustrato, generalmente se puede definir como la facilidad con la cual el
sustrato gana o pierde electrones. Cuando un elemento o un compuesto pierden electrones se dice
que el sustrato se oxida, mientras que un sustrato que gana electrones se reduce. La oxidación
también se puede conseguir mediante la adición de oxígeno. Por lo tanto, una sustancia que
realmente cede electrones es un buen agente reductor y una que capta fácilmente electrones es un
buen agente oxidante. Cuando los electrones se traspasan de un compuesto a otro, se crea una
diferencia de potencial entre los dos compuestos. Esta diferencia de potencial puede ser medida
mediante el uso de un instrumento apropiado y expresada en milivoltios (mV). Cuanto más oxidada
esta una sustancia, tanto más positiva será su potencial eléctrico; cuanto más reducidas esta una
sustancia, tanto más negativa será su potencial eléctrico. Cuando la concentración del oxidante y
del reductor es igual, existe un potencial eléctrico 0. El potencial de O/R de un sistema se expresa
mediante el símbolo Eh. Para su crecimiento, los microorganismos aerobios necesitan valores
positivos (oxidados), mientras que los anaerobios necesitan valores negativos (reducida).
Entre las sustancias de los alimentos que ayudan a mantener condiciones reductoras están los
grupos –SH en las carnes y el ácido ascórbico y los azucares reductores en las frutas y hortalizas. El
potencial de O/R de un alimento está determinado por:




El potencial O/R característico de cada alimento
Resistencia al cambio de potencial del alimento
La tensión de oxigeno de la atmosfera que rodea el alimento
El acceso que la atmosfera tiene al alimento
-1
Caldo de carne cocida
AEROBIOS
E0 de resofurina (pH 6.7)
[reductor] = [oxidante]
Tiras de azul de metileno
Carnes picadas
Zumos de frutas
½ O2 + 2H+  H2O
ANAEROBIOS
S H + 2e  H2
+
mV
-421
-350
-200
-100
-42
0
+10
+200
+400
+816
Mínimo de bacterias metanógenas
Mínimo para Desulfovibrio (pH 7.2)
levaduras y mohos favorecidos
FIGURA 1. Representación esquemática de los potenciales de óxido reducción con respecto
al crecimiento de determinados microorganismos
Algunas bacterias necesitan condiciones reducidas para la iniciación de crecimiento (Eh
aproximadamente de -200mV) mientras que otras necesitan un Eh positivo para el
crecimiento. En la primera clase se encuentran bacterias anaerobias tales como el
Clostridium; a la última pertenece las bacterias aerobias tales como algunos representantes
del genero Bacillus.
Algunas bacterias aerobias crecen mejor en condiciones ligeramente reducidas y se les
conoce como microaerofilos, por ejemplo los lactobacilos y los Campylbacters. Algunas
bacterias tienen la facultad de crecer en condiciones aerobias y anaerobias y se conocen
como facultativamente anaerobios. Casi todos los mohos y levaduras encontrados en el
interior o en la superficie de los alimentos son aerobios, aunque algunos pocos tienden a
ser anaerobios facultativos.
Los alimentos vegetales, especialmente los jugos vegetales, tienden a tener valores de Eh
de 300 a 400 mV por lo que son las bacterias aerobias y los mohos la causa habitual de su
alteración. Las carnes compactas tienen valores de Eh alrededor de 200 mV en las carnes
picadas alrededor de 200 mV y los quesos de varios tipos tienen valores de Eh entre -20mV
y -200mV.
Los microorganismos afectan el Eh de su medio durante el crecimiento del mismo modo
que afecta el pH. Los microorganismos aerobios son capaces de disminuir el Eh de su medio
mientras que los anaerobios no. Cuando los aerobios crecer el oxígeno se agota en el medio
y por lo tanto disminuye el Eh.
4. CONTENIDO DE NUTRIENTES
Con el propósito de crecer y actuar normalmente, los microorganismos necesitan:





Agua
Fuente de energía
Fuente de nitrógeno
Vitaminas y factores de crecimiento
Minerales
Con respecto a los últimos cuatro aspectos, los mohos tienen la necesidad más baja seguidos de las
levaduras, las bacterias gram negativas y las bacterias gram positivas. Como fuentes de energía, los
microorganismos transmitidos por alimentos pueden utilizar azúcares, alcoholes y aminoácidos.
Unos pocos microorganismos son capaces de utilizar carbohidratos complejos, como almidones y
celulosa, como fuente de energía, pero primero deben degradarlos a azúcares sencillos. Los
microorganismos también usan las grasas como fuente de energía pero su número es muy pequeño.
Las principales fuentes utilizadas por los microorganismos heterótrofos son aminoácidos aunque
algunos microbios usan otros compuestos. Por ejemplo, algunos microorganismos usan nucleótidos
y aminoácidos libres, mientras otros pueden usar péptidos y proteínas.
Los microorganismos pueden necesitar vitaminas del grupo B en pocas cantidades, y casi todos los
alimentos naturales tienden a tener una abundante cantidad para aquellos organismos que son
incapaces de sintetizar sus necesidades esenciales. En general, las bacterias gram positivas son
menos sintetizadoras y por esta razón se les debe aportar uno o más de estos compuestos. Las
bacterias gram negativas y los mohos son capaces de sintetizar la mayoría de todas sus necesidades.
Por lo tanto estos dos grupos se pueden encontrar creciendo en los alimentos pobres en vitaminas
del grupo B. las frutas tienden a ser más pobres en vitamina B que las carnes y junto con el pH bajo
y Eh positivo contribuye a que sean alterados usualmente por mohos en lugar de bacterias.
5. ESTRUCTURAS BIOLOGICAS
La cubierta natural de algunos alimentos proporciona una excelente protección contra la entrada y
el daño subsiguiente por los organismos de la alteración. En esta clase se encuentran estructuras
tales como la testa de las semillas, la cubierta externa de las frutas, la piel de los animales y la cáscara
de los huevos.
La cáscara externa y las membranas de los huevos impiden la entrada de casi todos los
microorganismos cuando se conservan almacenados en las condiciones adecuadas de humedad y
temperatura. Las frutas y hortalizas con cubierta dañada se alteran con mucha mayor rapidez que
aquellas que no lo tienen dañada. La piel que recubre el pescado y carnes como las de vaca y cerdo
impide la alteración de los alimentos.
PARÁMETROS EXTRÍNSECOS
Los parámetros extrínsecos de los alimentos son aquellas propiedades del medio de conservación
que afectan tanto a los alimentos como a sus microorganismos. Los más importantes son:
1.
2.
3.
4.
Temperatura de conservación
Humedad relativa del medio
Presencia y concentración de gases
Presencia y actividades de otros microrganismos
1. TEMPERATURA DE CONSERVACIÓN
Los microorganismos, individualmente y como grupo, crecen en un amplio intervalo de
temperaturas. La temperatura más baja que se cree que un microorganismo crece es de -34 °C; la
temperatura más elevada está algo por encima de 100°C. Los microorganismos se pueden dividir en
tres grupos en base a sus necesidades de temperatura de crecimiento.
Cuadro 5. CLASIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS SEGÚN TEMPERATURA ÓPTIMA DE SU
CRECIMIENTO BACTERIANO
Microorganismo
Psicrótrofos
Mesófilos
Termófilos
Temperatura de crecimiento
7 °C o menos
20 °C – 45 °C
45 °C o más
Temperatura óptima
20 °C – 30 °C
30 °C – 40 °C
55 °C – 65 °C
Algunos géneros psicrótrofos son: alcaligenes, shewannella, brochothrix, corynebacterium,
Flavobacterium, Lactobacillus, Micrococcus, Pseudomonas, Psychrobacter, Enterococcus. Los
psicrotrofos encontrados con mayor frecuencia en los alimentos son los que pertenecen al género
Pseudomonas y Enterococcus. Estos organismos cresen bien en temperaturas de refrigeración y
alteran las carnes, el pescado, las aves de corral, los huevos y otros alimentos que normalmente se
mantienen a esta temperatura. Las especies y cepas mesófilas pueden encontrarse en alimentos
mantenidos a temperaturas de refrigeradora. Algunos organismos son capaces de crecer en un
intervalo de 0 y 30 °C o a temperaturas más elevadas, por ejemplo enetrococus faecalis. La mayoría
de las bacterias termófilas generalmente no crecen en el intervalo termófilo.
Los mohos son capaces de crecer en amplios intervalos de temperatura. Las especies aspergillus,
cladosporium y thammidium se pueden encontrar creciendo en los huevos, la carne de vaca y en las
frutas aun cuando estén refrigerados. Las levaduras generalmente no crecen en el intervalo
termófilo.
La temperatura de almacenaje des el parámetro más importante que afecta a la alteración de los
alimentos sumamente perecederos. La eficacia de la temperatura de almacenaje depende en gran
manera de la RH (humedad relativa) del medio de almacenaje y de la presencia o ausencia de gases
tales como el dióxido de carbono, CO2 y el ozono O3.
2. HUMEDAD RELATIVA DEL MEDIO
La RH del medio ambiente de almacenaje es importante tanto desde el punto de vista de la aw en
los alimentos como del crecimientos de los microorganismos en las superficies. Cuando la aw de un
alimento se fija en 0.60 es importante que este alimento sea almacenado en condiciones de RH que
no permitan que el alimento capte humedad del aire y de este modo aumentar su propia aw de
superficie y subsuperficie hasta un punto donde pueda tener lugar el crecimiento microbiano.
Cuando el alimento con valores bajo de aw se sitúa en ambientes de RH elevada, los alimentos captan
humedad hasta que se ha establecido el equilibrio. De igual modo, los alimentos con aw elevada
pierden humedad cuando se sitúan en un medio de RH bajo.
Existe una relación entre RH y temperatura que se debe tener en cuenta para almacenar las
condiciones de almacenaje apropiadas para los alimentos. En general, cuanto más elevada es la
temperatura, tanto más baja es la RH y viceversa.
Los alimentos que se alteran en la superficie por mohos, levaduras y determinadas bacterias se
deben almacenar en condiciones de aw baja. Las carnes envueltas incorrectamente tienden a
experimentar mucha alteración de superficie en la refrigeradora antes de que se produzca la
alteración profunda, debido a la RH generalmente elevada de la refrigeradora y al hecho de que el
aflora que altera la carne es esencialmente de naturaleza aerobia.
Al seleccionar las condiciones de RH ambiental apropiadas, se debe tener cuenta tanto la posibilidad
de crecimiento superficial como la calidad deseable a mantener en los alimentos. Modificando la
atmosfera gaseosa, es posible retardar la alteración superficial sin disminuir la RH.
3. PRESENCIA Y CONCENTRACIÓN DE GASES
El dióxido de carbono (CO2) es el gas atmosférico más importante que se usa para controlar los
microorganismos en los alimentos. El ozono (O3) es el otro gas atmosférico que tiene propiedades
antimicrobianas y ha sido privado durante varias décadas como agente para prolongar la vida
comercial de determinados alimentos. Se ha demostrado que es eficaz frente a varios
microorganismos, pero por ser un fuerte agente oxidante, no se debe usar en alimentos ricos en
lípidos ya que produciría un aumento de la rancidez.
En general se ha demostrado que los niveles de 0.15 a 5 ppm de ozono (O3) en el aire inhiben el
crecimiento de algunas bacterias de la alteración y de algunas levaduras.
4. PRESENCIA Y ACTIVIDADES DE OTROS MICROORGANISMOS
Algunos microorganismos transmitidos por alimentos producen sustancias que son inhibidoras o
letales para otros; estas incluyen antibióticos, bacteriocinas, el peróxido de hidrógeno, y ácidos
orgánicos. La interferencia microbiana general se refiere a la inhibición o destrucción general
inespecífica de un microorganismo por otros representantes del mismo hábitat o medio. La flora
estafilocócica normal inofensiva de las ventanas nasales evita la colonización por cepas
estafilocócicas más virulentas.
Estudios recientes han demostrado las actividades antagonistas generales de la flora normal de los
alimentos frente a Listeria monocytogenes y frente a cepas patógenas de Escherichia coli. Además
están demostrados los efectos supresores de una flora bacteriana aerobia suficientemente
importante frente al crecimiento de Clostridium botulinum en las carnes frescas, al igual que la
supresión de levaduras y mohos por esta flora bacteriana.
La producción de sustancias inhibidoras por un organismo que inhibe o destruye a otro es uno de
los ejemplos más claro de interferencia microbiana. El antagonismo láctico es un fenómeno según
el cual una bacteria acido láctica inhibe o destruye organismos de la intoxicación alimentaria o que
alteran alimentos, íntimamente, cuando se encuentran en cultivo mixto.
Los microorganismos emparentados que se pueden incorporar a un producto alimenticio para
conseguir la conservación han sido denominados cultivos protectores. Entre las propiedades
deseables que deben poseer los cultivos protectores están las siguientes:
1.
2.
3.
4.
No ofrecer riesgos para la salud
Comunicar efectos beneficiosos al producto
No tener impacto sobre las propiedades sensoriales
Actuar como indicadores en condiciones de uso incorrecto
EQUIPO ESPECIAL
1.
2.
3.
4.
Bureta de 50 mL
Matraces Erlenmeyer de 250 mL
Beakers de 250 mL
Balanza granataria ± 0.01 g
REACTIVOS Y MUESTRAS
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
Leche en polvo descremada
Yogur activo (incubado por 6 horas al 13.3% de leche)
Cultivo iniciador yc-x11
Leche inoculada
Fenolftaleína al 1 %
Hidróxido de sodio 0,1 M
Cloruro de sodio
Glucosa
Extracto proteico
Aceite de oliva
Cloruro de hierro (III) 1,0 M
Hidrogenofosfato de amonio 1,0 M
Cloruro de calcio 1,0 M
Clorhidrato de tiamina (Vitamina B1)
Piridoxina (Vitamina B6)
PARTE EXPERIMENTAL
PARTE A.
Preparación de la leche madre inoculada
1.
2.
3.
4.
Pesar 800 g de leche en polvo descremada
Agregar 5500 mL de agua corriente y mezclar bien
Agregar 500 mL de yogur activo (incubado por 6 horas al 13,3% de leche) y mezclar bien.
Agregar 1 g de cultivo iniciador YC-X11 y mezclar bien.
PARTE B.
Efecto de la temperatura en el crecimiento bacteriano
1. Rotular 4 Beakers de 250 mL con las siguientes temperaturas: 0°C, 20°C, 40°C y 60°C.
2. A cada beaker agregar 100 mL (medido con probeta) de la leche inoculada provista y tapar
con papel aluminio.
3. Colocar el beaker rotulado con 0°C en el refrigerador, el rotulado con 20°C sobre la mesa
del laboratorio, el rotulado con 40°C en la incubadora y el rotulado con 60°C en el baño
maría.
4. Tomar en un matraz Erlenmeyer de 250 mL una muestra de alrededor de 10 ± 2 g de leche
inoculada del beaker rotulado con 20°C.
5. Agregar al matraz Erlenmeyer alrededor de 30 mL de agua destilada y 3 gotas de
fenolftaleína al 1 %.
6. Titular la muestra del Erlenmeyer con solución valorada de hidróxido de sodio 0.1 M hasta
que aparezca el primero color rosa permanente (>30s). Calcular la acidez. Nota: este valor
se registra como el valor 0 HR
7. Rotular 4 matraces Erlenmeyer de 250 mL con 0°C, 20°C, 40°C y 60°C.
8. Luego de una hora tomar en cada Erlenmeyer 250 mL rotulado una muestra de alrededor
de 10 ± 2 g de leche inoculada del beaker correspondiente rotulado.
9. Volver a colocar cada beaker rotulado en el lugar a la temperatura correspondiente (0°C en
el refrigerador, 20°C sobre la mesa del laboratorio, 40°C en la incubadora y con 60°C en el
baño maría)
10. Agregar a cada matraz Erlenmeyer alrededor de 30 mL de agua destilada y 3 gotas de
fenolftaleína 1 %.
11. Titular la muestra de cada matraz Erlenmeyer con solución valorada de hidróxido de sodio
0.1 M hasta que aparezca el primer color rosa permanente (>30s).
12. Expresar la acidez como porcentaje (p/p) de ácido láctico (HC3H5O3 MM= 90.05 g/mol) en la
muestra de la leche inoculada en proceso de fermentación
𝑉 𝑥 𝑀 𝑥 90.05
1000
%𝐴𝑐𝑖𝑑𝑒𝑧 =
𝑥 100
𝑚
13. Repetir las determinaciones de acidez al cumplirse las dos horas de iniciado el proceso.
14. Registrar los porcentajes (p/p) de ácido láctico en el siguiente cuadro:
Cuadro 1. Efecto de la temperatura
TEMPERATURA 0 HR
1 HR
2 HR
Δ % Acidez
0 °C
20 °C
40 °C
60 °C
PARTE C.
Efecto del salado (Adición de solutos) en el crecimiento bacteriano
1. Rotular 4 Beakers de 250 mL con los siguientes nombres: BLANCO, 1%, 3%, 5%.
2. Pesar en cada uno de ellos la cantidad de cloruro de sodio en gramos indicada por la
etiqueta, es decir, 0, 1, 3 y 5 gramos respectivamente.
3. A cada beaker agregar 100 mL (medidos con probeta) de la leche inoculada provista por su
profesor.
4. Mezclar bien el contenido de cada beaker utilizando un agitador de vidrio. Tomar
precauciones para no contaminar los beaker, lavar cada vez el agitador de vidrio, o usar un
agitador diferente para cada beaker.
5. Tomar en un matraz Erlenmeyer de 250 mL una muestra de alrededor de 10 ± 2 g del beaker
rotulado con blanco. Nota: este valor se registra como el valor 0HR
6. Colocar todos los beaker con la leche inoculada y las cantidades de cloruro de sodio
indicadas en la incubadora a 40°C.
7. Agregar al matraz Erlenmeyer con la muestra del blanco alrededor de 30 mL de agua
destilada y 3 gotas de fenolftaleína.
8. Titular la muestra del Erlenmeyer con solución valorada de hidróxido de sodio 0.1 M hasta
que aparezca el primero color rosa permanente (>30s).
9. Rotular 4 matraces Erlenmeyer de 250 mL con blanco, 1%, 3% y 5%.
10. Luego de una hora tomar en cada Erlenmeyer 250 mL rotulado una muestra de alrededor
de 10 ± 2 g del correspondiente beaker rotulado.
11. Agregar a cada matraz Erlenmeyer alrededor de 30 mL de agua destilada y 3 gotas de
fenolftaleína
12. Titular la muestra de cada matraz Erlenmeyer con solución valorada de hidróxido de sodio
0.1 M hasta que aparezca el primer color rosa permanente (>30s).
13. Expresar la acidez como porcentaje (p/p) de ácido láctico (HC3H5O3 MM= 90.05 g/mol) en la
muestra de la leche inoculada en proceso de fermentación
𝑉 𝑥 𝑀 𝑥 90.05
1000
%𝐴𝑐𝑖𝑑𝑒𝑧 =
𝑥 100
𝑚
14. Repetir las determinaciones de acidez al cumplirse las dos horas de iniciado el proceso
15. Registrar los porcentajes (p/p) de ácido láctico en el siguiente cuadro:
Cuadro 2. Efecto de adición de solutos (Aw)
NaCl
0 HR
1 HR
2 HR
Δ % Acidez
0%
1%
3%
5%
PARTE D.
Efecto de suplementos en el crecimiento bacteriano
1. Rotular 4 Beakers de 250 mL con los siguientes nombres: BLANCO, CARBOHIDRATOS,
PROTEÍNAS y LÍPIDOS.
2. A cada beaker agregue 100 mL (medido con probeta) de la leche inoculada provista por su
profesor.
3. Agregar al beaker rotulado con carbohidratos 1 g de glucosa al rotulado con proteínas 1 g
extracto proteico y al rotulado con lípidos 1 mL (20 gotas) de aceite de oliva
4. Mezclar bien el contenido de cada beaker utilizando un agitador de vidrio. Tomar
precauciones para no contaminar los beaker, lavar cada vez el agitador de vidrio, o usar un
agitador diferente para cada beaker.
5. Tomar en un matraz Erlenmeyer de 250mL una muestra de alrededor de 10 ± 2 g del beaker
rotulado con blanco. Nota: este valor se registra como el valor 0HR
6. Colocar todos los beaker con la leche inoculada y los inhibidores en la incubadora a 40°C.
7. Agregar al matraz Erlenmeyer con la muestra del blanco alrededor de 30 mL de agua
destilada y 3 gotas de fenolftaleína.
8. Titular la muestra del Erlenmeyer con solución valorada de hidróxido de sodio 0.1 M hasta
que aparezca el primero color rosa permanente (>30s).
9. Rotular 4 matraces Erlenmeyer de 250 mL con blanco, CARBOHIDRATOS, PROTEÍNAS Y
LÍPIDOS.
10. Luego de dos hora tomar en cada Erlenmeyer 250 mL rotulado una muestra de alrededor
de 10 ± 2 g del correspondiente beaker rotulado.
11. Agregar a cada matraz Erlenmeyer alrededor de 30mL de agua destilada y 3 gotas de
fenolftaleína.
12. Titular la muestra de cada matraz Erlenmeyer con solución valorada de hidróxido de sodio
0.1 M hasta que aparezca el primer color rosa permanente (>30s).
13. Expresar la acidez como porcentaje (p/p) de ácido láctico (HC3H5O3 MM= 90.05 g/mol) en la
muestra de la leche inoculada en proceso de fermentación
𝑉 𝑥 𝑀 𝑥 90.05
1000
%𝐴𝑐𝑖𝑑𝑒𝑧 =
𝑥 100
𝑚
14. Repetir las determinaciones de acidez al cumplirse las dos horas de iniciado el proceso
15. Registrar los porcentajes (p/p) de ácido láctico en el siguiente cuadro:
Cuadro 3. Efecto de adición de suplementos
SUPLEMENTOS
0 HR
1 HR
2 HR
Δ % Acidez
BLANCO
CARBOHIDRATOS
PROTEÍNAS
LÍPIDOS
PARTE E.
Efecto de micronutrientes en el crecimiento bacteriano
1. Rotular 3 Beakers de 250 mL con los siguientes nombres: BLANCO, VITAMINAS Y
MINERALES.
2. A cada beaker agregue 100 mL (medido con probeta) de la leche inoculada provista por su
profesor.
3. Agregar al beaker rotulado con vitaminas 0.05 g de tiamina y 0.05 g y al rotulado con
minerales una gota de cloruro de hierro (III) 1 M, una gota de cloruro de calcio 1 M y una
gota de hidrogenofosfato de amonio.
4. Mezclar bien el contenido de cada beaker utilizando un agitador de vidrio. Tomar
precauciones para no contaminar los beaker, lavar cada vez el agitador de vidrio, o usar un
agitador diferente para cada beaker.
5. Tomar en un matraz Erlenmeyer de 250 mL una muestra de alrededor de 10 ± 2 g del beaker
rotulado con blanco. Nota: este valor se registra como el valor 0HR
6. Colocar todos los beaker con la leche inoculada y los inhibidores en la incubadora a 40°C.
7. Agregar al matraz Erlenmeyer con la muestra del blanco alrededor de 30 mL de agua
destilada y 3 gotas de fenolftaleína.
8. Titular la muestra del Erlenmeyer con solución valorada de hidróxido de sodio 0.1 M hasta
que aparezca el primero color rosa permanente (>30s).
9. Rotular 3 matraces Erlenmeyer de 250 mL con blanco, VITAMINAS Y MINERALES.
10. Luego de dos horas tomar en cada Erlenmeyer 250 mL rotulado una muestra de alrededor
de 10 ± 2 g del correspondiente beaker rotulado.
11. Agregar a cada matraz Erlenmeyer alrededor de 30 mL de agua destilada y 3 gotas de
fenolftaleína.
12. Titular la muestra de cada matraz Erlenmeyer con solución valorada de hidróxido de sodio
0.1 M hasta que aparezca el primer color rosa permanente (>30s).
13. Expresar la acidez como porcentaje (p/p) de ácido láctico (HC3H5O3 MM= 90.05 g/mol) en la
muestra de la leche inoculada en proceso de fermentación
𝑉 𝑥 𝑀 𝑥 90.05
1000
%𝐴𝑐𝑖𝑑𝑒𝑧 =
𝑥 100
𝑚
14. Repetir las determinaciones de acidez al cumplirse las dos horas de iniciado el proceso
15. Registrar los porcentajes (p/p) de ácido láctico en el siguiente cuadro:
Cuadro 4. Efecto de adición de micronutrientes
SUPLEMENTOS 0 HR
BLANCO
VITAMINAS
MINERALES
1 HR
2 HR
Δ % Acidez

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