生きた細胞内での単一分子ナノ計測～ミオシンモーターを“追う”～東北大学工学部情報知能システム総合学科鑓水大和王子超東北大学大学院医工学研究科神崎研究室 (病態ナノシステム医工学) ミオシン(Myosin)とは • 細胞内のアクチンフィラメント上を移動するモータータンパク質 • ミオシンVbは細胞内の小胞輸送を担う小胞 C末端アクチンフィラメント脚部 N末端従来の生細胞内ライブイメージング有機蛍光分子や蛍光タンパク(GFPなど)を用いたライブセルイメージング欠点 • 蛍光の褪色が激しい • 一分子単位の可視化は困難蛍光タンパク質(LifeAct Venus)の褪色の様子量子ドット(無機材料)を使用量子ドットを用いた単一分子計測量子ドットを用いたライブセルイメージング • 無機ナノ材料(半導体コア) コア(半導体、セレン化カドミウム) シェル(硫化亜鉛) • 極めて明るく褪色しないポリマー • 安定した蛍光コーティング生体分子 • 一分子単位での標識が可能 15-20nm • 極めてシャープな蛍光スペクトル • 量子ドットの蛍光強度は蛍光タンパク質の数百倍 Qdot® Nanocrystal Technology Overview (http://www.lifetechnologies.com)より引用、改変量子ドットによる蛍光標識の問題点 • 任意の分子への特異的な結合能を持たない • 細胞膜を透過する能力がない細胞タグタンパク質による結合能の獲得エレクトロポレーション法による細胞内導入先行研究: 膜タンパク質の一分子計測(小胞輸送) ビオチン Qdotストレプトアビジントランスフェリン受容体トランスフェリン Qdot-トランスフェリン複合体 • エンドサイトーシスを利用した量子ドットの細胞内への取り込み • 細胞質タンパク質に対しても適用したい第2回・第3回サイエンス・インカレにて同研究室・品川が発表細胞内分子を単一分子計測するにはミオシンＶb遺伝子タグタンパク質による分子との結合エレクトロポレーションによる量子ドット・ベクター導入 HaloTag融合ミオシンVb 発現ベクター(遺伝子) HaloTag 発現遺伝子 HaloTag融合ミオシンVb C末端についた HaloTag またはミオシンVの発現・量子ドットとの結合共焦点レーザー顕微鏡による観察・解析 N末端についた HaloTag ligand- QD655 HaloTag ミオシンVbと量子ドットにタグタンパク質を結合させることにより特異的な結合能を獲得細胞内分子を単一分子計測するには発現ベクタータグタンパク質による分子との結合 HaloTag ligand -QD655 溶液エレクトロポレーションによる量子ドット・ベクター導入ミオシンVの発現・量子ドットとの結合共焦点レーザー顕微鏡による観察・解析細胞質細胞表面に電気パルスをかけることにより細胞膜に微少な穴を空ける細胞内分子を単一分子計測するにはタグタンパク質による分子との結合エレクトロポレーションによる量子ドット・ベクター導入ミオシンVの発現・量子ドットとの結合共焦点レーザー顕微鏡による観察・解析細胞表面に電気パルスをかけることにより細胞膜に微少な穴を空ける細胞内分子を単一分子計測するにはタグタンパク質による分子との結合エレクトロポレーションによる量子ドット・ベクター導入ミオシンVの発現・量子ドットとの結合共焦点レーザー顕微鏡による観察・解析細胞表面に電気パルスをかけることにより細胞膜に微少な穴を空ける細胞内に発現ベクター・量子ドットを導入することができる細胞内分子を単一分子計測するにはタグタンパク質による分子との結合エレクトロポレーションによる量子ドット・ベクター導入ミオシンVの発現・量子ドットとの結合共焦点レーザー顕微鏡による観察・解析 • 一日静置後、細胞の回復と共に細胞内に入ったベクターにより HaloTag融合ミオシンVbが発現細胞内分子を単一分子計測するにはタグタンパク質による分子との結合エレクトロポレーションによる量子ドット・ベクター導入ミオシンVの発現・量子ドットとの結合共焦点レーザー顕微鏡による観察・解析 • 一日静置後、細胞の回復と共に細胞内に入ったベクターにより HaloTag融合ミオシンVbが発現 • 細胞質中のHaloTag ligand-QD655 と結合細胞内分子を単一分子計測するにはタグタンパク質による分子との結合エレクトロポレーションによる量子ドット・ベクター導入共焦点レーザー顕微鏡(OLYMPUS FV-1000) 対物レンズ60倍、2秒ごとに100枚で200秒間撮影輝点追跡ソフトウェアによる解析ミオシンVの発現・量子ドットとの結合輝度輝度共焦点レーザー顕微鏡による観察・解析各輝点の速度、MSDを算出ミオシンVbの単一分子計測 • 顕微鏡による1分子ごとの動態の観察 – 量子ドットのみを導入した細胞 – ミオシンVbN末端にHaloTagが発現する細胞 – ミオシンVbC末端にHaloTagが発現する細胞ベクターなし(量子ドットのみ) • ソフトウェアによる解析 – 各輝点の平均速度 – 各輝点の平均二乗変位 (MSD; Mean Square Displacement) ベクターあり(N末端) ベクターあり(N末端、C末端)の細胞の輝点追跡については、特異的な運動をしているとみられる輝点のみを採用ベクターあり(C末端) 発現ベクターの有無による輝点の動きの違いベクターなし (量子ドットのみ導入) ベクターあり (HaloTag-ミオシンVの N末端に量子ドットが結合) HaloTag融合ミオシンVb発現ベクターを導入した細胞には直線運動を行っている輝点が見られる発現ベクターの有無による輝点の動きの違いベクターなし (量子ドットのみ導入) ベクターあり (HaloTag-ミオシンVの N末端に量子ドットが結合) 他の輝点とは異なる、特異的な運動 HaloTag融合ミオシンVb発現ベクターを導入した細胞には直線運動を行っている輝点が見られる発現ベクターの有無による輝点の動きの違いベクターなし (量子ドットのみ導入) ベクターあり (HaloTag-ミオシンVの N末端に量子ドットが結合) HaloTag融合ミオシンVb発現ベクターを導入した細胞には直線運動を行っている輝点が見られる発現ベクターの有無による輝点の動きの違いベクターありベクターなし (量子ドットのみ導入) (HaloTag-ミオシンVの N末端に量子ドットが結合) 輝点の速度: 0.12 ±0.09 [μm/s] 輝点の速度: 0.13 ±0.09 [μm/s] 2D MSD (μm^2) 6 MSD[μm^2] MSD[μm^2] 2D MSD (μm^2) 4 2 0 0 5 10 時間 [s] 15 6 4 2 0 0 5 10 時間[s] 15 直線運動中のミオシンVbは速く動く各条件における全輝点の累積速度分布 100% ベクターなし累積頻度 80% C末端 60% N末端輝点の速度分布が右へシフト → 速く動いている 40% 20% 0% 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 速度 [μm/s] 条件平均速度 [μm/s] 計測した輝点の数 (データ数) なし 0.104 ± 0.001 156 (2536) N末端 0.207 ± 0.021 8 (85) C末端 0.226 ± 0.020 8 (118) T検定: 輝点群の速度分布について、 N末端・C末端ともにベクターなしの輝点群の速度について有意差ありミオシンVと結びついたと思われる輝点は速く動いているミオシンVbの運動を定量的に評価する各条件における全輝点のMSDの平均 10 9 平均二乗変位 [μm^2] 8 C末端 6 V: 能動輸送速度 D: 拡散係数 C ∶ ノイズ条件能動輸送 7 𝐌𝐒𝐃 𝐧∆𝒕 ≅ 𝑽∆𝒕 𝟐 + 𝟒𝑫∆𝒕+ 𝑪 5 能動輸送速度 [μm/s] なし 0.036 (ほぼ無い) N末端 0.160 C末端 0.192 4 N末端 3 2 拡散のみ 1 ベクターなし 0 0 2 4 6 時間 [s] 8 10 12 “走っている”ミオシンと思われる輝点は解析的にも能動的に移動しているまとめ: 細胞内分子の一分子標識法の確立 • タグタンパク質による結合能の獲得 • エレクトロポレーション法による細胞内導入によって量子ドットによる問題点を克服し細胞質内に存在する任意のタンパク質の一分子標識を成功させたまとめ: モータータンパク質の追跡量子ドットによる一分子計測を行うことによって、ミオシンVbが生細胞内で直線的に“走っている” 様子を観察した数学・物理的な観点からミオシンの運動をより精密に捉えることができた今後の展開 • 計測・解析方法のさらなる改良 – 輝点追跡方法や数学的解析手法の検討 • 様々な実験による生命現象の新しい理解 – 細胞への刺激などによる運動の変化 – 他のタンパク質への適用 New Technology New Concept 量子ドットにHaloTag ligandを結合させる  アミノ基への標識 + Qdot-amine HaloTag succinimidyl ester (O2) ligand HaloTag ligand-Qdot  スルフヒドリル（チオール）基への標識 HaloTag ligand 計測したいタンパク質 HaloTag Modified from www.promega.com and www.lifetechnologies.com 調製したHaloTag ligand-QDのHaloTagとの結合 HaloTag-14-3-3で形質転換した大腸菌の可溶画分ボイル（あり・なし） HaloTag ligand-QDを添加 0.5%アガロースゲルにて電気泳動蛍光検出非変性HaloTag-14-3-3存在下で泳動度の変化 →HaloTag ligand-QDとの結合を反映？それぞれの物質の分子量・サイズ     ミオシンVb: およそ200kDa HaloTag: 25kDa HaloTag ligand: 数百量子ドット(Qdot)のサイズ: 10～20nm (GFPと同程度)