Karbolfuchsin Originalrezept nach ZIEHL: 10 ml einer gesättigten alkoholischen Lösung von basischem Fuchsin (Magenta; C. I. Nr. 42510) werden mit 90ml einer 5%igen Phenollösung (4,5g Phenol + 85,5ml Wasser) vermischt. Für die Sättigung des Ethylalkohols sind pro 10 ml etwa 0,8 g erforderlich (mindestens zwei Stunden rühren!), in der Praxis haben sich 0,5 g Fuchsin als ausreichend erwiesen. Modifikation nach BON: 1 1%ige Lösung von Fuchsin in 5%igem Phenol, d. h., 95ml Wasser, 5 g Phenol krist., 1 g Fuchsin basisch. Karbolfuchsin wird zur spezifischen Anfärbung der säureresistenten Inkrustationen an den Primordialhyphen bestimmter Russula-Arten (Gruppe Incrustatae: olivascens, rosea, turci) verwendet. Zu diesem Zweck gibt man auf einen Objektträger 1-2 Tropfen Karbolfuchsin und läßt den Radialschnitt aus der obersten Schicht der Huthaut (Epikutis) 5-10 Minuten darin liegen. Der Objektträger bleibt während dieser Zeit zugedeckt. Man saugt mit Filterpapier das Karbolfuchsin ab, gibt zwei Tropfen Wasser zu, saugt wieder ab und wäscht ein zweites Mal mit Wasser. Nun tropft man etwas verdünnte Salzsäure (S. 21) auf das Präparat und läßt eine Minute einwirken. Nach nochmaligem Absaugen mit Filterpapier wird ein Tropfen Wasser zugefügt und das Deckglas aufgelegt. Unter dem Mikroskop erscheint der Schnitt mehr oder weniger entfärbt, die Inkrustationen der Primordialhyphen bleiben aber purpurrot. Säureresistente Inkrustationen an den Primordialhyphen (zylindrische Hyphen der Hutdeckschicht) von Russula turci, nach der Färbung mit Karbolfuchsin. Vergrößerung ca. 790:1. Karminessigsäure Unter Karminessigsäure versteht man eine Lösung von Karminsäure in 50%iger Essigsäure. Leider ist die Karminessigsäure des Handels meist zu schwach, so daß man gezwungen sein kann, sich diese selbst herzustellen, wozu allerdings ein Kölbchen mit Rückflußkühler (oder ein Steigrohr) und eine Heizung (Brenner) erforderlich sind: Ca. 5 g des käuflichen Karmins (C. I. 75 470; getrocknete weibliche Insekten von Coccus cacti L., Cochenille-Laus, etwa 10% Karminsäure enthaltend) werden in 100ml 50%iger Essigsäure (50ml Eisessig + 50 ml Wasser) mindestens zwei Stunden am Rückfluß gekocht. Nach dem Stehenlassen über Nacht wird abfiltriert oder - in Ermangelung einer Filtereinrichtung die überstehende klare, rote Lösung vom Bodensatz abgegossen. Karminessigsäure färbt die Zellkerne verschiedener Pilze (z. B. der Gattung Mycena) direkt an, wird aber hauptsächlich zur Sichtbarmachung der "karminophilen" oder "siderophilen Granulation" in den Basidien verschiedener Arten, z. B. der Gattungen Lyophyllum (Bild 10), Tephrocybe, Calocybe, verwendet. Nach KUHNER & ROMAGNESI (1953) bzw. BRESINSKY (1976) ist folgende Methode sehr einfach und gelingt nach unserer Erfahrung meistens: Man gibt 1-2 Tropfen Karminessigsäure auf einen Objektträger, bringt hierein ein Lamellenfragment und erhitzt mit dem Gasfeuerzeug, bis keine Flüssigkeit mehr vorhanden ist. Nun überführt man das Pilzfragment in einen Tropfen frischer Karminessigsäure auf einem neuen Objektträger, erhitzt wieder und taucht kurz (5-10 Sekunden) einen Eisennagel (oder Eisendraht - nicht vernickelt oder aus anderem Material!) in die noch heiße Flüssigkeit. Nach dem schnellen Erkalten betrachtet man entweder in frischer Karminessigsäure oder in Chloralhydrat/Wasser (1:1). Bei positiver Reaktion, d. h. wenn die Basidien siderophil sind, zeigt sich in ihrem Innern eine schwarze Körnelung (Granulation). Nach CLEMENCON (1981) kann die Reaktion in der Kälte durchgeführt werden, wenn man das Objekt vorher mit einer Eisenbeize vorbehandelt. Die früher ver wendete Schwermetallbeize ist wegen der großen Giftigkeit nicht zu empfehlen. Siderophile Granulation in den Basidien von Lyophyllum favrei, Färbung mit Karminessigsäure nach vorheriger Eisenchloridbeize (CLEMENCON). Vergrößerung ca. 1200 :1. Eisenbeize: Eisen-III-chlorid 10 g (Fecl3) Eisessig (Essigsäure 100%) Wasser 45 g (ml) Vorgehen: Auf einen Objektträger einen großen Topfen Eisenbeize bringen und das Lamellenfragment hineingeben. Bei Frischmaterial 2-3 Minuten darin lassen (Exsikkatenmaterial vorher mit konzentriertem Ammoniak 3-5 Minuten aufquellen und nur 1-2 Minuten in der Eisenbeize belassen) und dann abtupfen. Das gebeizte Pilzfragment auf einen neuen Objektträger in 1-2 Tropfen Karminessigsäure überführen und 2-3 Minuten darin liegen lassen, überschüssige Karminessigsäure mit Filterpapier absaugen und in Chloralhydrat/Wasser (1:1) mikroskopieren. Baumwollblau (Anilinblau, Methylblau; Cotton Blue, bleu coton; C. I. Nr. 42 755) Folgende Lösungen werden sowohl zum gleichzeitigen Anfärben und Aufquellen als auch zur Untersuchung von Frischmaterial verwendet: a) 0,05 g Baumwollblau in 30 ml Milchsäure (80-85%) b) 0,5 g Baumwollblau in 100 ml Lactophenol (S. 23). Andere Lösungsmittelgemische, wie z. B. Phenol/Essigsäure/Wasser (GAMS et al. 1980) geben ebenfalls gute Färbungen. Nach zweistündigem Rühren oder Schütteln läßt man einen Tag stehen und filtriert dann. Werden die Sporen von Arten verschiedener Gattungen (z. B. Boletus, Cystolepiota, Hygrophoropsis, Lepiota, Lepista, Rhodocybe) durch Baumwollblau intensiv blau gefärbt, bezeichnet man Choiromyces meandriformis. Asci mit warzigen Ascosporen in verschiedenen Entwicklungstadien. Quetschpräparat in Baumwollblau/Milchsäure (1130:1). sie als cyanophil, bleiben sie ungefärbt (z. B. Arten der Gattung Amanita), so nennt man sie acyanophil. Manchmal lassen sich auch nur die Ornamentationen (Warzen, Stacheln, Grate) anfärben, die Sporen selbst hingegen nicht, z. B. bei Arten der Gattung Ramaria (Clavariaceae, Aphyllophorales), aber auch bei den Discomyceten wie Aleuria, Scutellinia (Pezizales). Seltener sind auch andere Teile eines Fruchtkörpers, wie Hyphen, Basidien usw. cyanophil. Für den Ungeübten ist die Unterscheidung oft sehr schwierig, ob cyanophil oder nicht, da ja meist das Zellplasma angefärbt wird und so eine Cyanophilie vortäuscht. Guten Einstieg in das Problem bieten Amanita-Sporen, bei denen man deutlich den Unterschied zwischen angefärbtem Protoplasma und ungefärbter Sporenwand sehen kann, wegen des Öltropfens gut erkenntlich. Amyloide Basidiosporen Metachromatische Basidiosporen Wie bereits ausführlich besprochen, werden die Zellwände von Sporen, die in MELZERS Reagenz oder Lugolscher Lösung blau, blaugrau, blauviolett oder blauschwarz gefärbt werden, als amyloid bezeichnet. Die amyloide Reaktion kann vielfach schon makroskopisch festgestellt werden: Wenn z. B. eine Schicht Sporenpulver (von Aussporung) mit MELZERS Reagenz benetzt wird, färbt sich dieses blaugrau bis blauschwarz. (Neben den Sporen können auch andere Elemente (Hyphen, Zystiden) eine amyloide Reaktion zeigen). Zellwände von Basidiosporen, die bei der Behandlung z. B. mit Brillantkresylblau verschiedenartige Färbung annehmen, nennt man metachromatisch. So haben z.B. die Basidiosporen von Arten der Gattungen Macrolepiota, Leucocoprinus, Leucoagaricus nach der Einfärbung mit Brillantkresylblau eine äußere, dunkelblau bis schwarze, und eine innere, purpurrote Sporenwand. (Neben den Basidiosporen können sich auch andere Elemente [Hyphen, Randhaare] metachromatisch färben.) Macrolepioto procera (SING. (Großer Schirmling) (Bild unten) Die reifen Basidiosporen sind ellipsoidisch bis breitoval, glatt, dickwandig, in Brillantkresylblau metachromatisch. Sie haben einen deutlichen Keimporus, sowie einen lateralen Appendix. Das Sporenpulver ist weiß. Aleurodiscus disciformis.Amyloide Basidiosporen. Sporenpräparat in MELZERS Reagenz. Vergrößerung ca. 1050 :1 Macrolepiota procara. Metachromatische Basidiosporen. Sporenpräparat in Brillantkresylblau. Vergroßerung ca. 2000:1 Dextrionide Basidiosporen Macrolepiota rhacodes. Dextrinoide Basidiosporen. Quetschpräparat von der Hymenialschicht in MELZERS Reagenz. Vergrößerung ca. 1100:1