-}\ Methoden zur Anreicherung von Liquorzellen
Methods for Preparation of Cells from Cerebrospinal Fluid (CSF)
- ; R. lehmitz
Labor für Klinische Chemie und Liquorforschung, Nervenklinik, Universität Rostock
Zusammenfassung:
In der Übersicht werden verschiedene Verfahren der Anreicherung von Liquorzellen auf Objektträgern beschrieben und zytologische Vergleichsuntersuchungen zur Zellausbeute und Zelldifferenzierung vorgestellt. Die Bedeutung, die Zellanreicherungsmethoden und morphologische Liquorzytologie unter den aktuell
möglichen Verfahren der Zellcharakterisierung für die Liquorzytodiagnostik haben, wird diskutiert. Als optimale Liquorzellanreicherungsmethode von den in der Übersicht dargestellten Verfahren wird die kombinierte Zentrifugations-SorptionskammerMethode eingeschätzt. Unter Einbeziehung von Polykationen-beschichteten Objektträgern liefert sie Liquorzellpräparate mit für
statistische Berechnungen ausreichender Zellzahl. Die Qualität
der zytologischen Präparate ermöglicht die Zuordnung der Zellen nach den Kriterien, die in mehreren Monographien auf der
Grundlage von Sedimentkammerpräparaten beschrieben wurden. Zelldifferenzierungsergebnisse, die sich aus dem kombinierten Verfahren ergeben, dürften den In-vivo-Verhältnissen am
besten entsprechen. Für alle beschriebenen Techniken gilt, daß
die Verwendung von Polykatipnen-beschichteten Objektträgern
die Zellausbeute verbessert, ihre relativ große Variabilität aber
nicht aufhebt.
Schlüsselwörter:
Liquorzytologie — Zellanreicherungsmethoden — Polykationenbeschichtete Objektträger - Vergleichsuntersuchungen
Summary:
Different methods of enrichment of CSF cells on slides are described and comparative cytological findings of cell recovery and
cell differentiation are presented. The diagnostic importance of
slide preparation techniques with respect to morphological cytology of CSF cells is discussed. The two step centrifugation-sorption chambertechnique givesthe best results concerning cell recovery and cell differentiation. In combination with polycationic
coated slides cell preparations are obtained, which enab'le statisfically sufficient evaluation. The quality of these cell preparations allows cell differentiation according to the criteria documented in recent monographs of CSF cytology. The results of
cell differentiation are regarded to be closest to the in vivo Situation. The cell recovery is improved by use of polycationic slides
in all enrichment techniques described, but the relatively high
variability of cell recovery iiTnbt reduced by polycationic slides.
Cerebrospinal fluid cytology - cell preparation methods - polycationic coated slides - comparison of different techniques.
Die Zytologie besitzt neben der Proteinanalytik für die Liquordiagnostik bei neurologischen Erkrankungen einen erheblichen
Stellenwert (1-5). Neben der morphologischen Charakterisierung der Liquorzellen auf der Grundlage zytologischer und zytochemischer Standardfärbeverfahren werden zunehmend monoklonale Antikörper eingesetzt, um Subpopulationen bzw. Aktivierungszustände von Zellen zu charakterisieren (6-12). Prinzipiell
werden zwei Wege beschritten, um Liquorzellen zu untersuchen,
denn neben den Objektträgertechniken hat auch die Durchflußzytometrie Eingang in die Liquorzytodiagnostik gefunden
(13-16). Es muß berücksichtigt werden, daß der Üquor cerebrospinaiis eine quantitativ zellarme und für Zellen instabile Flüssigkeit ist. Bestrebungen, die Zellanreicherungsverfahren zu op-
timieren bzw. neue zu inaugurieren, sind so alt wie die Liquorzytologie selbst.
Die Durchflußzytometrie löst z. Z. noch nicht alle Fragen, die an
die Liquorzytodiagnostjk gestellt werden. Für die Charakterisierung von Zellfunktionszuständen (u. a. Aktivierungsgrad) bzw.
die Suche nach diagnostisch relevanten Zellen auf der Grundlage von Zellzyklusuntersuchungen kann ein Durchflußzytometer sicher viel leisten. Die Suche nach Tumorzellen (u. a. bei Leukämien und Lymphomen), die Diagnostik und Verlaufsbeobachtung von Blutgungen in die Liquorräume anhand der Makrophagentätigkeit bzw. die Differenzierung von Entzündungen einschließlich Therapiekontrolle sind zur Zeit noch überwiegend an
die lichtmikroskopische Auswertung von Liquorzellpräparaten
gebunden. Durch Vorbehandlungen der Liquorzellen für die
Durchflußzytometrie (u. a. Zellverluste bei Inkubationen und Waschungen) ist die quantitative Aussage (relative Zellanteile) sicher von den In-vivo-Verhältnissen entfernt, wie es bei Objektträgertechniken mit Zellverlust der Fall ist. Gealterte Liquorzellen
(u. a. bedingt durch Transportzeiten) verändern je nach Zelltyp
ihre Form bzw. Struktur. Damit sind Zellzuordnungen nach dem
Streulichtprinzip (Durchflußzytometer) sicher erschwert, während die Lichtmikroskopie in diesen Fällen noch eher zu Aussagen in der Lage ist. Bei allen Standardisierungsversuchen von
Zellanreicherungstechniken muß immer berücksichtigt werden,
daß neben den methodischen Charakteristika eine Reihe anderer Faktoren die quantitativen und qualitativen zytologischen Ergebnisse beeinflussen (Tab. 1). Über die Wirkung des Liquors
auf die Adhärenz sowie das Migrationsverhalten von Leukozyten
wurde berichtet (17, 18).
Im folgenden werden Varianten von bereits etablierten Verfahren
(Sedimentkammer), neuere Entwicklungen (Sorptionskammer)
und kombinierte Methoden (Zentrifugatioh/Sorptionskammer)
vorgestellt und bewertet. Zellausbeuten und Differenzierungsergebnisse sind vergleichend dargestellt. Zusätzlich wird über die
Wirksamkeit von Polykationen-beschichteten Objekträgern berichtet und ein Test zur Verwendbarkeit von beschichteten Objektträgern beschrieben.
Polykationen als Adhärenzverstärker für Zellen
Zellanreicherungsverfahren, die unter Einbeziehung von Objektträgern ablaufen, nutzen die Eigenschaft von Zellen, an Glasoberflächen zu adhärieren. Mit polykationischen Substanzen
(z. B. Poly-L-Lysin) beschichtete Glasoberflächen führen infolge
elektrostatischer Wechselwirkungen zu einer stabileren Adhärenz von Zellen (19-23). Auch für die Liquorzellpräparation sind
Polykationen (Poly-L-Lysin) eingesetzt worden (24, 25). Allerdings sind die Zellen angereicherter Liquorproben (Zentrifugation) durch störungsfreie Sedimentation aus einem „Tropfen"
Tab. 1: Einflußgrößen, die Adhärenzbereitschaft und damit Ausbeute und Qualität von Liquorzellen bei Objektträgertechniken
modulieren
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
•
9.
10.
Genetisch determinierte Bereitschaft zur Adhärenz.
Aktivierungszustand der Zellen (Antigenstimulation).
Präadhärenz im Transportgefäß (Plaste, Glas).
Präadhärenz bei Vorzentrifugation (Plaste, Glas).
Vorbehandlung der Zellen (Vorfixierung).
Natürliches Milieu der Zellen (u. a. Proteine, Lymphokine).
Zusammensetzung von Zellzuchtmedium-Zusatz.
Methodenbedingtes artifizielles Spreading (Sedimentkammer).
Nachbehandlung der Zellen (Trocken- oder Feuchtfixierung).
Oberfläche der Objektträger (evtl. Polykationen-beschichtet).
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41
auf Pölykationen-beschichtete Objektträger aufgebracht worden.
Ob Ladungsträger auf Objektträgern auch bei Zellanreicherungsverfahren, die nicht durch störungsfreie Sedimentation der Zellen charakterisiert sind (Saugkräfte in Sedimentkammer und
nach Verzögerung auch in Sorptionskammer), die Zeliausbeute
verbessern, war ungeklärt.
Neben Poly-L-Lysin hat sich auch Pöly-dimethyl-didHyl-ammO'
niumchlorid (PDDA) für die Verbesserung der Adhärenz von Zellen als geeignet erwiesen (26). PDDA (MG ca. 100000) ist als
wäßrige Lösung eingesetzt worden (0,4-1,0 g/l). Die Beschichtung der Objektträger erfolgt durch Einstellen in PDDA-Lösung
(45 min), anschließendes Spülen mit aqua bidest (5 min) und
Lufttrocknung. Über verbesserte Zellausbeuten durch Einsatz
von PDDA-beschichteten Objektträgern in Zellanreicherungsverfahren wurde berichtet (27-29).
Zu den Lagerungsmöglichkeiten von beschichteten Objektträgern gibt es verschiedene Angaben (staubfrei bei Raumtemperatur, luftdicht bei -20 °C), Angaben zum Verwendungszeitraum
sind nicht genau definiert (25, 26). Daher wurde ein Beschichtungstest entwickelt zur Überprüfung der Qualität der Beschichtung bzw. der Erhaltung der Funktionsfähigkeit nach Lagerung
(30). Indikatorzellen in diesem Test sind gewaschene Humanerythrozyten, die auf PDDA-beschichteten Objektträgern zur Adhärenz gebracht und anschließend einem Überspülstreß ausgesetzt werden (Kontrollen sind-unbeschichtete Objektträger). Das
Feuchtpräparat wird anschließend hinsichtlich Morphologie und
Quantität der Erythrozyten beurteilt. Erythrozyten auf beschichteten Objektträgern behalten ihre runde Form und sind in größerer Zahl vorhanden, auf unbeschichteten Objektträgern überwiegen spindelförmig ausgezogene Erythrozyten und Stechapfelformen. PDDA-beschichtete Objektträger dürfen nicht länger als 20.
Tage gelagert werden, da später das typische Beschichtungsbild
nicht mehr nachzuweisen ist. Bei Einhaltung der experimentellen Bedingungen sind die Ergebnisse sehr gut reproduzierbar
(Details siehe 30).
Vergleichende Untersuchungen mit der Sedimentkammer
Die Liquorzellanreicherung mit der Sedimentkammer (31) hat
weite Verbreitung gefunden. Den Wert der Methode belegen
mehrere Monographien (1, 3, 4). Alle Modifikationen des Verfahrens (4, 32—37) liefern qualitativ gute Liquorzellbilder, der Zellverlust liegt jedoch in Bereichen von 60-90%. Zellverluste betreffen vor allem die Lymphozyten (1, 4, 34, 38, 39), denen hinsichtlich ihrer quantitativen Populationsverteilung diagnostische
Relevanz zukommt. Die Hauptursache für den Zellverlust beim
Sedimentkammer-Verfahren ist das Absaugprinzip über Filterpapier. Durch inkonstante Druckübertragung vom Hebelsystem
(Modifikationen u. a. mit Schraub- oder Federverschluß) auf den
zylindrischen Glastubus sind zusätzliche Zellverluste möglich,
da als Folge der Zutritt des Liquors zum Filterpapier nicht standardisiert ist. Mit Veränderungen der Form des Sedimentationstubus und des oberen Gummiaufnahmeteils (Abb. 1) wird eine
direkte Druckübertragung vom Gummiteil auf den Tubus gewährleistet. Vergleichsuntersuchungen der Variante II mit dem
zylindrischen Tubus belegen die Wirksamkeit der methodischen
Veränderung. Variante II ergibt eine Verdopplung der Zellausbeute (Hauptzuwachs durch Lymphozyten), allerdings werden
Figur 1
Figur 2
Abb. 1: Sedimentkammer - Gummitubus mit Glas. 1 - Sedimentationsröhrchen, 2 - Gummitubus; 3 - Liquor, 4 - Filterpapier, 5 - Objektträger. Pfeilrichtung = Druckrichtung.
42
Bisherige Vorionte
-1
Abb. 2: Sorptionskammervarianten.
Sorptionstubus (t
9), Präsorber (2l
Zelle (3), Objektträger (4, 7), Haftring
(6, B), Tubuswand
(10),
Tubuslumen
(11).
Neue Variante!
Tab. 2: Zelldifferenzierungsergebnisse im Liquor cerebrospinalis
unter Verwendung von zwei Sedimentkammer-Varianten (Leukozytenzahl der Liquores von 1-5 Mpt/l)
Sedimentkammer
(bisherige Variante)
(n =40)
Sedimentkammer
(Variante II)
(n = 40)
Lymphozyten Monozyten Lymphozyten Monozyten
(rel.%)
(rel. %)
(rel. %)
(rel. %)
S.D.
34,2
21,7
61,5
24,2
42,0
23,8
53,9
25,6
t-Test (gepaart): P < 0,01
P < 0,002
Zellausbeuten von 15% nicht überschritten (36). Obwohl die
Zellausbeute nur in relativ geringem Umfang erhöht wurde, unterschieden sich die mittleren Differenzierungsergebnisse für
Lymphozyten und Monozyten signifikant (Tab. 2).
Vergleichende Untersuchungen mit der Sedimentkammer unter
Verwendung von Polykationen-beschichteten Objektträgern haben gezeigt, daß die Polykationenbeschichtung zu einer Erhöhung der mittleren Zellausbeute von 4,0% (kleinster Wert: 0,4%,
größter Wert: 10,5%, n = 78) auf 9,5% (kleinster Wert: 1,6%,
größter Wert: 34,5%, n = 78) führt und gleichzeitig die Differenzierungsergebnisse signifikant verändert werden (27, 28). In Tabelle 3 sind Ergebnisse zur Zelldifferenzierung dargestellt. Methodische und statistische Details sind den Mitteilungen zu entnehmen (27, 28).
Vergleichende Untersuchungen mit der Sorptionskammer
Das Prinzip der Sorptionssedimentation besteht darin, daß die
Porosität der Kammerwandung eines Sedimentationstubus aus
saugfähigem Material (u. a. Keramik) mit Verzögerung freigegeben wird (Abb. 2). Zeitlich begrenzter Sorptionsstop wird erreicht durch einen festen Präsorber, mit dem die Sorptionskammer ausgekleidet ist, bzw. durch eine Präsorptionsflüssigkeit, die
die Kammerwand partiell sättigt (38, 40, 41). Als feste Präsorber
sind Polyacrylate, die bei physiologischem pH-Wert flüssigkeitsdurchlässig werden, sehr gut geeignet (unveröffentlichte Ergebnisse). Die Präsorption mit Flüssigkeit (Zellzuchtmedien) hat sich
jedoch bisher durchgesetzt (Abb. 2, Figur 2), da es technologisch ·
nicht gelungen ist, eine Präsorberschicht so aufzutragen, daß
standardisierte Laufzeiten der Kammersysteme entstehen. Die
Vorsättigung der Sorptionskammer kann sowohl von innen als
auch von außen erfolgen (29, 41). Alle Sorptionskammerergebnisse, die in dieser Übersicht dargestellt sind, wurden mit Kammern erstellt, die durch Präsorptionsflüssigj<eit vorgesättigt wurden.
Lab.med. 15: 42 (1991)
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Mit der Sorptionskammer erhaltene zytologische Präparate sind
von guter Qualität (38, 40, 42). Vergleichende Untersuchungen
ergaben, daß die Sorptionskammer gegenüber der Sedimentkammer eine höhere Zellausbeute liefert, und daß auch gleichzeitig die Differenzierungsergebnisse beeinflußt werden (29, 38,
43). Die Zellausbeute mit der Sprptionskammer ist auf das Dreifache gesteigert, Differenzierungsergebnisse verschieben sich
signifikant zugunsten der Lymphozyten (Tab. 4),
Werden sowohl für das Sedimentkammerverfahren als auch die
Sorptionskammer PDDA-beschichtete Objektträger eingesetzt,
wird der Unterschied in der Zellausbeüte noch deutlicher (Tab.
5). Die beschichteten Objektträger verbessern auch die Ergebnisse der Sorptionskammer (Tab. 5). Bemerkenswert ist, daß die
Differenzierungsergebnisse für die Sedimentkamrherpräparate
im Mittel die Sorptionskammerwerte erreichen (Tab. 6). Bedingt
durch die Polykationenbeschichtung führt die Erhöhung der Zellausbeute in der Sedimentkammer zu dieser Angleichung der
Werte, was bei einer mittleren Zellausbeute von 10% nicht unbedingt zu erwarten war.
Tab. 3: Mittlere Zelldifferenzierungsergebnisse von Sedimentkammerpräparaten unter Verwendung von u n beschichteten und
PDDA-beschichteten Objektträgern (Leukozytenzahl der Liquores
von 1-14 Mpt/l)
Gruppe
Sedimentkammer
unbeschichtete
Objektträger
Lymphozyten
(rel. %)
X
Gesamte
Stichprobe
S.D.
(n = 81)
Multiple
Sklerose
S.D.
(n = 8)
Vertebragene X
Reizzustände
(n = 26)
S.D.
Tab. 5: Minlere Liquorzellausbeute (Prozent vom Wert des Wahlergebnisses mit der Fuchs-Rosenthal-Kammer [± 100%]) mit
der Sedimentkammer und der Sorptionskammer unter Verwendung von PDDA-beschichteten Objektträgern (Leukozytenzahl
der Liquores von 1-5 Mpt/l)
Sedimentkammer
(1 ml Liquor)
beschichtete
Objektträger
(n = 46)
Sorptionskammer
(0,2 ml Liquor)
unbeschichtete
Objektträger
(n = 46)
Sorptionskammer
(0,2 ml Liquor)
beschichtete
Objektträger
(n = 46)
9,1
5,7
2,0/25,4
24,1
19,2
4,0/58,5
45,4
25,9
12,3/82,5
X
S.D.
R
t-Test (Student) bzw. t-Test (Welch): P < 0,001
R: Angabe zur Variationsbreite (niedrigster Wert/höchster Wert)
Verglichen wurde die Zellausbeute (Prozent) mit der Sedimentkammer (Objektträger beschichtet) und der Sorptionskammer (Objektträger beschichtet)
sowie die Zellausbeute (Prozent) zwischen den Sorptionskammerwerten.
Tab. 6: Mittlere Zelldifferenzierungsergebnisse von Sedimentkammer- und Sorptionskammerpräparaten unter Verwendung
von Polykationen-beschichteten. Objektträgern (Leukozytenzahl
der Liquores von 1-10 Mpt/l)
Sedimentkammer
(1 ml Liquor)
beschichtete
Objektträger
(n = 54)
Sedimentkammer
beschichtete Objektträger
- Monozyten
(rel.%)
Lymphozyten
(rel.%)
Monozyten
(rel. %)
40
53
50
44
22
60
24
39
22
76
22
20
21
33
22
62
18
47
19
' 52
19
21
19
• 18
.
Lymphozyten Monozyten Lymphozyten Monozyten
(rel.%)
(rel.%)
(rel.%)
(rel.%)
57,8
20,8
S.D.
Lymphe·· stimul.* Mono- Granulo- Lymphozyten Lympho· zyten zyten zyten
zyten
(rel.%) (rel.%) (rel.%) (rel.%) (rel.%)
Tab. 4: Zellausbeute und Zelldifferenzierung mit der Sorptionskammer im Vergleich zum Sedimentkammer-Verfahren (Leukozytenzahl der Liquores von 1-5 Mpt/l)
Gesamt- Lymphozellzahl
zyten
auf Objekt- (rel.%)
träger
(absolut)
X
S.D.
1H
154
29,0
13,0
. Sorptionskammer
(1 ml Liquor) '
(n = 30)
67,4
12,8
506
455
46,3
17,6
36,8
20,5
59,8
21,6
Zentrifugations-SorptionskammerVerfahren
beschichtete
Objektträger
Sedimentkammer
unbeschichtete
Objektträger
Verglichen wurden jeweils die Relativprozente einer Zellart innerhalb der Patientengruppen.
Mono· Gesamt- Lymphozyten
zellzahl
zyten
(rel.%) auf Objekt - (rel.%)
träger
(absolut)
36,2
18,6
Tab. 7: Liquorzelldifferenzierungsergebnisse mit dem Zentrifugations-Sorptionskammer-Verfahren
(beschichtete
Objekträger)
und der Sedimentkammer (u n beschichtete Objektträger)
t-Test (gepaart): f_<_0,05
P < 0,001
Sedimentkammer
(t ml Liquor)
(n = 30)
Sorptionskammer
(0,2 ml Liquor)
beschichtete
Objektträger
(n = 54)
stimul.* Mono- Granulo·
Lympho· zyten zyten
zyten
(rel.%) (rel.%) (rel.%)
a) n = 14, Zellzahl: 1-5 Mpt/l, Protein: 80-350 mg/l
S.D.
38,8
15,5
61,2
15,6.
-
- -' 75,7
15,8
-
24,3
15,9
b) n = 15, entzündliche Erkrankungen unterschiedlicher Genese,
Zellzahl: 5-50 Mpt/i, Protein: 140-1 700 mg/l
Monozyten
(rel.%)
S.D.
52,8
17,8
S.D.
22,0
18,3
52,6
24,8
1,2
0,6
24,2
30,6
59,7
28,3
2,9
2,6
c) n = 10, abakterielle Meningitis (subakute Phase),
Zellzahl: 50-500 Mpt/l, Protein: 370-1 560 mg/l
51,0 - 4,0
23,0 % 6,7
34,1 .
. 16,7
10,9
17,4
79,9
18,6
6,6
8,0
d) n = 10, Meningitis purulenta (akute Phase),
Zellzahl: 150-6400 Mpt/l, Protein: 162-7080 mg/l
t-Test (Student) bzw. t-Test (Welch): P< 0,002
P< 0,001
Verglichen wurden jeweils die Relativprozente einer Zellart sowie die Gesamtzellzahl auf den Objektträgern.
S.D.
3,6
2,3
0,2
0,4
11,7
12,7
84,5
14,0
6,2
3,7
1,2
2,1
15,1
16,9
22,3
28,7
5,6
3,1
7,9
18,0
8,8
10,9
83,4
15,3
* stimulierte Lymphozyten
Lab.med. 15:43(1991)
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43
Vergleichende Untersuchungen mit dem
Zentrifugations-Sorptionskammer-Verfahren
Über Liquorzellanreicherung durch Kombination von schonender Vorzentrifugation mit anschließender Zytozenlrifugation ist
berichtet worden (44-46). Wir nutzen ein kombiniertes Verfahren (Zentrifugation/Sorptionskammer), um mehrere zytologisehe Präparate erstellen zu können (47). Der Liquor wird zunächst zentrifugiert (15 min, 200 x g), der zellfreie Überstand bis
auf ca. 200 \ abgehoben, und anschließend erfolgt nach Zusatz
von 50 Zellzuchtmedium (Zusatz von HEPES und Albumin) die
Resuspendierung der Zellen. Eine vorbereitete Sorptionskammer (Präsorption) wird dann mit 250 Liquorzellsuspension beschickt. Die verwendeten Objektträger sind mit PDDA beschichtet (Details siehe 47).
Vergleichende liquorzytologische Ergebnisse (ZentrifugationsSorptionskammer-Verfahren/Standard-Sedimentkammer-Methode
mit unbeschichteten Objektträgern) aus der Klinik für Kinderheilkunde der Universität Rostock sind in Tabelle 7 dargestellt. Die
Werte des Abschnittes a zeigen, daß sich das Verhältnis von
Lymphozyten zu Monozyten umkehrt. Auch die Ergebnisse in
Abschnitt b und c belegen die Verschiebung (Erhöhung) der Zellrelationen zugunsten der Lymphozyten. Granulozytenwerte sind
im Mittel kaum beeinflußt. Bei Liquores, deren Granulozytenanteil größer als 70% ist, sind die Lymphozyten- und Monozytenwerte erwartungsgemäß nur wenig verändert ("Abschnitt d). Fehlinterpretationen einer Meningitis purulenta sind bedingt durch
den hohen Anteil von Granulozyten nicht möglich, bei Vorliegen
eines „ bunten "Zellbildes führte der Einsatz des ZentrifugationsSorptionskammer-Verfahrens zu einer besseren Erkennung des
Stadiums der Erkrankung bzw. der Therapieeinflüsse.
Weitere vergleichende Differenzierungsergebnisse aus Liquores
von Erwachsenen gehen aus Tabelle 8 hervor. Sowohl für das
Zentrifugations-Sorptionskammer-Verfahren als auch die Sedimentkammer-Methode wurden hier PDDA-beschichtete Objektträger genutzt. In Liquores mit normalen Zellzahlen (Abschnitt a)
ergaben sich mit dem kombinierten Verfahren im Mittel signifikant höhere Lymphozytenwerte. Dieser Effekt ließ sich auch bei
Liquores mit pathologischen Zellzahlen nachweisen, war allerdings nicht mehr signifikant. Bedingt durch die Verwendung von
PDDA-beschichteten Objektträgern auch im SedimentkammerVerfahren differieren die Zellrelationen zwischen beiden Methoden nicht so stark, wie dies in der Studie mit den Kinderliquores
der Fall war, in der die Sedimentkammer nach Standard (ohne
Objektträgerbeschichtung) eingesetzt wurde. Die mittlere quantitative Zellausbeute in der Sedimentkammer (PDDA-Objektträger) betrug 7,1 % (kleinster Wert: 1,5%, größter Wert: 18,1 %, n =
50). Im Zentrifugations-Sorptionskammer-Verfahren ergaben
sich für den Zentrifugationsschritt eine Wiederfindungsrate (Mittelwert) von 66,1 % (kleinster Wert: 39,1 %, größter Wert: 93,2%,
Tab. 8: Liquorzelldifferenzierungsergebnisse mit dem Zentrifugations-Sorptionskammer-Verfahren (beschichtete Objektträger)
und der Sedimentkammer (beschichtete Objektträger)
Zentrifugations-Sorptionskammer:
Verfahren
beschichtete
Objektträger
Sedimentkammer
beschichtete
Objektträger
Lympho- stimul.* Mono- Granulo- Lymphozyten Lympho- zyten zyten zyten
zyten
(rel.%) (rel.%) (rel.%) (rel.%) (rel.%)
x
S.D.
x
S.D.
a)n = 30,Zellzahl:1-5Mpt/l
52.7
20,9
0,7
1,2
38,8
21,3
' 1,2
3,8
b) n = 17, Zellzahl: 6-116 Mpt/l
61,9
23,6
2,6
4,3
21,2
10,4
16,9 · 18,1
t-Test nach Student: P < 0,01
* stimulierte Lymphozyten
44
stimul.* Mono- GranuloLympho- zyten zyten
zyten
(rel.%) (rel.%) (rel.%)
66,4
17,8
0,2
4,3
71,4
18,5
3,7
4,2
(
31,4
1,3
17,8 . 3,3
- ·
15,8
14,1
6,4
12,4
n « 24), für die Zellausbeute in der Sorptionskammer ein Mittelwert von 35,4% (kleinster Wert: 18,7%, größter Wert: 65,8%, n
= 24). Für beide methodischen Schritte zusammen läßt sich im
Mittel eine Wiederfindung von ca. 25% kalkulieren. Auf den Objektträgern (Sorptionskammer) war das Zellangebot im Mittel
um den Faktor 7 höher (Variationsbreite: 3-15).
Das Zentrifugations-Sorptionskammer-Verfahren unter Einbeziehung von Polykationen-beschichteten Objektträgern kann von
den in der Übersicht vorgestellten Objektträgertechniken als optimale Methode angesehen werden. Die Vorzentrifugation der Liquorprobe (mehrere Milliliter) bedingt, daß trotz geringerer Zellausbeute (ca. 25%) ein höheres quantitatives Zellangebot auf
den Objektträgern vorliegt als bei der Einschritt-Sorptionskammer-Methode (0,2-1,0 ml Liquor, ca. 35% Zellausbeute). Zelldifferenzierungsergebnisse, die aus dem kombinierten Verfahren
resultieren, dürften den In-vivo-Verhältnissen am nähesten kommen.
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5. KULCZYCKI, J.: Atlas cytologiczny plynu mozgowo rdzeniowego. Panstwowy Zaklad
Wydawnictw Lekarskich Warszawa (1988).
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7. GUSEO, A.: Rapid determination of CSF lymphocyte subsets by labeled microspheres. J. Neuroimmunol. 13, 117-122 (1986).
8. COAKHAM, H. B., GARSON, J. A., BROWNELL, B., ALLAN, P. M., HARPER, E. l..
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Anschrift des Verfassers:
Dr. rer. nat. Reinhard Lehmitz
Universität Rostock
Nervenklinik
Labor für Klinische Chemie und Liquorforschung
Gehlsheimer Straße 20
0-2540 Rostock 40
Zellmorphologie und Zellausbeute bei einer neuen
Zytozentrifugentechnik mit gleichzeitiger Gewinnung von
zellfreiem Überstand
Cytomorphology and Cell Yield in a New; Cytocentrifugal Technique.Allowing the Collection of the Cell-free
Supernatant
'
G. Schwarz
Hettich-Zentrifugeh, Forschungs- und Entwicklungsabteilung, Tuttlingen
Zusammenfassung:
Es wird eine neue Zytozentrifugentechnik für die Herstellung
von mikroskopischen üquorzell-Präparaten vorgestellt. Mit Hilfe
einer Zyto-Kammer, die eine Dichtung zwischen der Zyto-Kammer und dem Objektträger besitzt werden die Zellen direkt auf
den Objektträger aufzentrifugiert Der zellfreie Überstand bleibt
nach der Zentrifugation erhalten und kann für chemische Analysen benutzt werden. Die feuchte Einzelzell-Schicht wird durch
eine zentrifugale Trocknung für 'die Romanowsky-Giemsa-Färbung präpariert. Dies .geschieht unmittelbar nach der Zellsedimentation und dem Entfernen des größten Teils der Überstandsflüssigkeit mittels einer Pipette. Auf diesem Weg können viele
der üblichen Zellschädigungen und Trocknungsartefakte vermieden werden. Die Zellen liegen gut ausgebreitet auf dem Objektträger vor. Bei niedriger Zellkonzentration fand sich eine verstärkte Zellausbreitung der Lymphozyten. Proben mit einer höheren Zellzahl ergeben meist sehr gute Präparate. Schwieriger
ist es, zell· und eiweißarme Proben zu guten zytologischen Präparaten zu verarbeiten. In solchen Fällen hilft die Zugabe von
Albumin. Diese zweistufige Methode ergibt Zellausbeuten bis zu
90%.
Summary:
A new cytocentrifugal technique is presented for the preparation
of miCroscopical slides of cerebrospinal fluid cells. With the help
of a cyto-chamber having a sealing between the cyto-chamber
and the slide the cells are sedimented directly onto the slide via
centrifugation. The cell free supernatant is still present after the
centrifugation and can be used for chemical analysis. After the
Sedimentation and removing of'the most supernatant fluid by a
pipette the wet cell monolayer is prepared for RomanowskyGiemsa-staining by a drying centrifugation step. In this way
many of the injurious changes of the cells and drying artefacts
may be avoided. The cells are well flattened on the slide. With lower cell concentration it was found an enlargement of the lymphocytes. Samples having a higher cell count can be prepared
with high quality. Some difficulties may occur with samples
showing a Iow cell count and a Iow protein content. In this cases
we could improve the results by the adding of albumin. This two
step procedure leads to a cell yield of up to 90%.
Schlüsselwörter:
Liquor cerebrospinalis - Zytozentrifugation - Zentrifugale
Trocknung - Lympnozyten - Monozyten
Keywords:
Cerebrospinal fluid - cytocentrifugation - centrifugal drying lymphocytes - monocytes
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Download Date | 3/29/16 11:51 AM
Lab.med. 15: 45(1991)
45
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