岡山医誌(1995) 107, 195∼204 糸球体腎炎におけるβ1インテグリンの発現の変化の検討岡山大学医学部第三内科学教室(指柏谷忠 words: 緒 β1インテグリン,フ受稿) ィブロネクチン, IgA腎症,膜性腎症合体が沈着する機序に,フ言ィブロネクチンと β1 インテグリンの結合が関与する可能性が示唆さインテグリンは細胞膜上に発現し,コンやラミニン,フ田善介教授) 俊 (平成7年3月20日 Key 導:太ラーゲれているが,直ィブロネクチンなどの細胞外 IgA腎マトリックス分子と結合することにより細胞と 30∼40%を細胞外基質の接着に関与する受容体である1)2). IgAを接的な証明はなされていない. 症は,本占め,糸邦では原発性糸球体腎炎の球体メサンギウム領域への主体とする免疫複合体の沈着と,メサンインテグリンは α鎖と β鎖によって構成されるギウム細胞の増殖,メヘテロダイマーであり,共通する β鎖によって特徴とする疾患である.一数種のサブファミリーに分類される2)-9). β1イ係蹄壁への免疫複合体の沈着と糸球体基底膜のンテグリンはコラーゲン,ラ肥厚を特徴とする疾患であり,メサンギウム細ミニン,フィブロサンギウム基質の増加を方膜性腎症は糸球体ネクチン等をリガンドとし,広範な細胞に分布胞の増殖および基質の増加は認められない.糸している.イ球体腎炎の進展過程におけるインテグリンの役ンテグリンは発見当初は細胞と細胞外基質の接着を仲介することにより,組織の割を明らかにする目的で,病態の異なるIgA腎構築に関与する静的な機能を持つと考えられて症及び膜性腎症患者の腎生検組織における β1イいたが,そンテグリンの発現の変化を,その後の研究により,リガンドと結合のリガンドのひすることにより細胞内情報伝達経路を介して細とつであるフィブロネクチンの局在とともに, 胞の遊走や貪食等の機能を誘導することが明ら間接蛍光抗体法および免疫電子顕微鏡を用いてかにされた10)11). 比較検討をおこなった. 腎糸球体はメサンギウム細胞,糸胞,内球体上皮細材料皮細胞及びボウマン嚢上皮細胞からなる細胞成分と,糸球体基底膜,メ 1. サンギウム基質対象 1988年4月及びボウマン嚢基底膜からなる細胞外基質によと方法より1993年3月までの5年間に岡って構成されている.糸球体の細胞外基質は Ⅳ 山大学医学部第三内科学教室および関連病院に型コラーゲン,ラおいて腎生検を施行したIgA腎ミニン,フィブロネクチン, プロテオグリカン等によって構成されており, 組織,膜性腎症患者9例細胞はこれらの基質分子と結合して存在していた対照として, る.糸球体腎炎においては,糸腎の正常部分を用いた.全合体の沈着,メ球体への免疫複サンギウム細胞の増殖とともに症患者22例の腎の腎組織を用いた.ま 5例の腎・尿管腫瘍による摘出例蛍光抗体法による観察をおこない,このうちIgA腎症5例,膜腎症3例,対近年IgA腎ついては免疫電子顕微鏡にて観察をおこなった. 症患者の血中免疫複合体内に, IgA 照としての正常ヒト腎組織4例性基質の増加がおこることが知られている.また, とフィブロネクチンの複合体が存在することがなお,これらの腎組織の組織学的診断は, HE染報告され12), IgA腎色・PAS染症において糸球体に免疫複 195 色・PAM染色・Masson染に色を用い 196 柏谷た光学顕微鏡,電子顕微鏡による観察及びヒト IgG, Clq, IgA, IgM, C3,フィブリノーゲン忠俊表 IgA腎症と膜性腎症患者の糸球体内の抗フィブロネクチン抗体及び抗 β1インテグリン抗体による蛍光染色強度に対するウサギポリクローナル抗体(Cappel Research Products. Durham, USA)を用いた蛍光抗体法によりおこなった。 2. 間接蛍光抗体法腎組織を採取した後に直ちにドライアイスーアセトンで冷却したn-ヘキサンによって急速凍結し,クリオスタットを用いて4μmのを作製した.凍凍結切片 +: 弱陽性 ++: 中等度陽性ン抗体(Telios そしてリン酸緩衝液にて5分ブロネクチン抗体(Advence し, FITC標間ずつ計3回識抗ウサギIgG抗 Products.)にせた後,リ洗浄 Japan)を,二体(Cappel て室温で30分間反応さン酸緩衝液にて5分間ずつ計3回浄し,蛍光顕微鏡(Olympus, Tokyo, 洗弱陽性(+),中 3. 等度陽性(++),強体(Amersham shire, 15nm金 UK), 酸緩衝液(pH 定し,エ K4M 1. -20℃ 取直後に0.05%グルタールアルラホルムアルデヒドを含むリン 7.4)によって4℃ (Chemische Waldkraiburg, にて30分間固 Werke FRG)ににて24時間 ,続なった.ブ CA, Tokyo, 識ヤギ抗 Buckingham コロイド標識ヤギ抗ウサ体(Amersham Co.)を用いた. 果正常腎組織間接蛍光抗体法による検討では,正 Lowi GmbH. 常腎糸球体では, β1インテグリンは,メサンギウム領域, 糸球体係蹄壁,おれた.強よびボウマン嚢上皮に染色さ拡大で観察すると,糸球体係蹄壁が二重線状に観察された.まタノール系列で脱水した後Lowicryl resin Co., 結免疫電子顕微鏡腎組織を,採サギ抗フィ Co., 陽性(+++) 階に評価した. デヒド,0.1%パ USA),ウ次抗体としてFITC標ウサギIgG抗ギIgG抗 Japan) Co., CA, にて観察を行った.糸球体内の蛍光染色強度を, の3段強陽性結切片を風乾後リン酸緩衝液にて洗浄し,一次抗体にて室温で30分間反応させ, Research +++: たフィブロネクチンは主にメサンギウム領域に染色され,係包埋し,紫外線重合を蹄壁,ボウマン嚢にも弱く染色された(表,図1a, b). いて常温にて24時間おこ免疫電顕による検討では, β1インテグリンのロックをウルトラマイクロトームを発現を示す金コロイド粒子は糸球体上皮細胞お用いて60nmの厚さに薄切して切片を作製した. よび内皮細胞の基底膜面およびメサンギウム細この切片を一次抗体の非特異的反応を防ぐため, 胞膜表面に観察された(図2a).フ前もって0.25% bovine チンは主にメサンギウム基質内に観察された(図を含む0.01Mトリス緩衝液(TBS, serum albumin (BSA) 2b). pH 8.2)に 30分間反応させた後に,一次抗体に室温にて4 時間反応させ, 0.1%BSAを 8.2)を用いて5分 nm金加えたTBS 間ずつ計3回 (pH 洗浄し,次に15 コロイド標識抗ウサギIgG抗体に4時間反応させた後,さらに0.1% BSA添 8.2)にて5分洗浄し, 24時間常温間ずつ計3回加TBS にて乾燥させた後,酢酸ウラニールにて2分クエン酸鉛にて1分 (pH 間, 間二重染色を行い透過電子顕微鏡(日立H 300)により75KVでィブロネク観察をおこなった13). なお,一次抗体としてウサギ抗 β1インテグリ 2. IgA腎症間接蛍光抗体法では, β1インテグリンは,メサンギウム領域,糸球体係蹄壁およびボウマン嚢上皮に染色され,正常糸球体に比べて,拡大したメサンギウム領域に蛍光が強く観察された. フィブロネクチンは拡大したメサンギウム領域に正常糸球体に比して強く染色された(表,図 1c, d).なおIgA腎ギウム領域にIgA(図1e)お症では拡大したメサンよびC3(図1f) が強く染色されている. 透過型電顕による観察ではIgA腎症では増加 β1インテグリンおよびフィブロネクチンの局在したメサンギウム基質内にelectron deposit (EDD)をおり, electron dense deposit dense 認めた(図3). 部分にも局在していた.ま免疫電顕では, β1インテグリンはメサンギウ正常腎およびIgA腎 C3の局在(間 (a):正接するフィブロネクチンは拡大したメサンギウム基質症における β1インテグリン,フィブロネクチンの局在とIgA腎症におけるIgA, 接蛍光抗体法) 常腎糸球体では, β1インテグリンは,メ察される. (EDD)とた上皮細胞および内皮細胞の基底膜面にも存在していた(図4a). ム細胞表面に正常糸球体に比べて多く発現して図1 197 (×400). (b):正ボウマン嚢に観察される. サンギウム領域(矢印),糸球体係蹄壁(小常腎糸球体ではフィブロネクチンはメサンギウム領域(矢 (×400). (c): IgA腎症では β1インテグリンは,メ矢印)に印),係観蹄壁, サンギウム領域,糸球体係蹄壁およびボウマン嚢上皮に観察され,正常糸球体と比較してメサンギウム領域の染色が増強している(矢印), (×400). (d): ギウム領域に強く染色される. 着を認める. (×400). (f): IgA腎 (×400). IgA腎症ではフィブロネクチンは正常糸球体と比べて拡大したメサン (e): IgA腎症では拡大したメサンギウム領域にIgAの症では拡大したメサンギウム領域にC3の沈沈着を認める. (×400). 198 図2 柏谷忠俊金コロイド粒子を用いた免疫電子顕微鏡での正常腎における β1インテグリン,フ (a):正常腎組織では β1インテグリンが主として糸球体上皮細胞,内ィブロネクチンの局在皮細胞の基底膜面およびメサンギウム細胞表面に観察される(矢印) . (b):正常腎組織ではフィブロネクチンは主としてメサンギウム MC:ノサンギウム細胞, MM:メサンギウム基質, Ep:上皮細胞. 基質内に観察される. β1インテグリンおよびフィブロネクチンの局在およびメサンギウム基質内のEDD内にも局在 199 ある細胞外基質の情報を細胞内部へ伝達する機が認められた(図4b). 能をもっている14). β1インテグリンはVLA 3. late antigen)と膜性腎症蛍光抗体法では, β1インテグリンはメサンギン,フも呼ばれ,コラーゲン,ラ (very ミニィブロネクチン等の細胞外基質をリガンウム領域,係蹄壁,ボウマン嚢上皮細胞に存在ドとする.腎組織におけるインテグリンの発現していた.フィブロネクチンは正常腎と同様にに関しては,これまでにいくつかの報告がある. 主にメサンギウム領域に存在していた.正球体と比較して,両常糸 Kerjaschkiら者の蛍光染色強度には変化皮細胞,内皮細胞,メサンギウム細胞,ボウマン嚢上皮細胞に存在することを報告した15). Kor 免疫電顕では β1インテグリンはメサンギウム皮細胞および内皮細胞の基底膜面に存在していた.フトの腎組織を用いた免疫組織学的検討により, β1インテグリンが糸球体上は認められなかった(表). 細胞表面,上は,ヒ honenらィブロネクチンは正常腎とはさらに詳細に検討し, VLA-1 β1)がメサンギウム細胞に, VLA-3 (α1 (α3β1)が同様にメサンギウム基質に存在していたが,上糸球体上皮細胞,ボ皮下のEDD内面に, αVβ3インテグリンが糸球体上皮細胞,内には局在が認められなかった. 考皮細胞,メ察ウマン嚢上皮細胞の基底膜サンギウム細胞,ボウマン嚢上皮細胞に発現していることを報告した16)17).槇野らは, インテグリンは細胞膜貫通蛋白であり,細胞正常ヒト糸球体における β1インテグリンの発現内のテイリン,ビンキュリン, α アクチニンなどを蛍光抗体法を用いて検討し,ほぼ同様の結果の物質を介して細胞骨格に結合しており,組織を報告している18)19).今回の免疫電顕による検討構築に重要な役割を果たすとともに細胞表面にの結果,正図3 IgA腎症患者の糸球体の電子顕微鏡像 IgA腎症ではメサンギウム基質内にelectron 上皮細胞, Ed:内皮細胞, US:尿路腔, dense CL:血 depositを管内腔, D: 常ヒト腎組織では糸球体のメサンギ認める. electron MC:メ dense サンギウム細胞, Ep: deposit. 200 図4 柏谷忠俊金コロイド粒子を用いた免疫電子顕微鏡でのIgA腎症における β1インテグリン,フィブロネクチンの局在 (a): IgA腎症では β1インテグリンはメサンギウム細胞表面に正常糸球体に比べて多く発現し, electron dense depositと接する部分に局在している(矢印) . (b): IgA腎症ではフィブロネクチンは拡大したメサンギウム基質およびメサンギウム基質内のelectron dense deposit内部に局在が認められる. MC:メサンギウム細胞, MM:メサンギウム基質. Ep:上皮細胞, GBM:糸球体基底膜, D: electron dense deposit . β1インテグリンおよびフィブロネクチンの局在ウム細胞,糸球体上皮細胞,内皮細胞及びボウ 201 ンの発現に変化は認められなかった.免疫電顕マン嚢上皮細胞の細胞膜の細胞外基質に接するによっても β1インテグリンの発現の変化は認め部位に β1インテグリンの発現が認められ,これられず,上らの細胞に発現するインテグリンは組織中におィブロネクチンの存在は認めなかった.まいて細胞外基質と結合していると考えられた . これまでの報告でも膜性腎症の免疫複合体内に IgA腎症患者の糸球体には,メサンギウム領皮下に沈着した免疫複合体内にはフた, 細胞外基質成分が含まれているという報告はな域への免疫複合体の沈着とメサンギウム細胞のい.従増殖およびメサンギウム基質の増加が認められ着に β1インテグリンが関与する可能性は少ないる.今と考えられた. 回の検討の結果, IgA腎症患者の糸球体って,膜性腎症における免疫複合体の沈ではメサンギウム細胞における β1インテグリンの発現の増加を認め,免結疫電顕により,免疫複合体と接するメサンギウム細胞の細胞膜表面に IgA腎論症と膜性腎症の発症,進展におけるイ β1インテグリンが発現していることが確認されンテグリンの役割を明らかにするために β1インた.最テグリンとそのリガンドであるフィブロネクチ近IgA腎症患者の血液中にIgAとフィプロネクチンの複合体が存在することが報告さンの発現を間接蛍光抗体法および免疫電子顕微れている12).またBarnesら鏡にて検討した. β1インテグリンは正常糸球体は, in vitroにおいて培養メサンギウム細胞が血小板由来のフィではメサンギウム細胞,糸グロネクチンに反応して遊走し,合成RGDペ細胞,そプチドを用いてインテグリンとフィブロネクチされた.メンの結合を阻害することにより,この遊走が阻を示すIgA腎止されることを示した20).またCosioらロネクチンはメサンギウム基質に発現が増加し, は,培養メサンギウム細胞がフィブロネクチンをコー球体上皮細胞,内皮してボウマン嚢上皮細胞の表面に観察またEDD周サンギウム細胞の増殖と基質の増加症では β1インテグリンとフィブ囲に β1インテグリンの局在がみらトしたビーズを α5β1インテグリンを介して貪食れた.膜することを示した21).これらのin vitroにおけ異はみられなかった.以上の結果より β1インテる結果と,今回の我々の結果から, IgA-フグリンは糸球体の構築を維持する役割を果たすィブ性腎症では正常腎と比較して局在に差ロネクチン複合体がメサンギウム細胞の β1インとともに, IgA腎テグリンを介してメサンギウム細胞と結合してメサンギウム細胞の増殖,基糸球体のメサンギウム領域に沈着することが示役割を果たしていることが示唆された. 症における免疫複合体の沈着, 質の増加に重要な唆された.また沈着したフィブロネクチンと β1 インテグリンの結合によって,メ胞の遊走が促進され,メサンギウム細サンギウム細胞による免疫複合体の貪食がおこる可能性が示された. 膜性腎症は糸球体上皮細胞と基底膜の間への免疫複合体の沈着を特徴とする疾患であり,IgA 腎症に見られるようなメサンギウム細胞増殖や基質の増加は認められない.膜性腎症患者の糸球体では,正常糸球体に比較して β1インテグリ文 1) Hynes RO: Integrins: 導,御校閲を賜りました恩師太田善介教授に深甚の謝意を捧げますと共に,終始懇切な御指導,御鞭撻を頂きました槇野博史助教授,四方賢一講師に深謝致します. なお本論文の要旨は第34回日本腎臓学会総会(岡山)および第35回日本腎臓学会総会(横浜)にて発表した. 献 A family of cell surface receptors. 2) Ruoslahti E and Pierschbacher (1987) 238, 491-497. 最後に稿を終えるにあたり,本研究に際して御指 Cell (1987) 48, 549-554. MD: New perspectives in cell adhesion: RGD and integrins. Science 202 3) 柏 Helmer ME, cell (1987) 4) Kramer 5) Staatz and Chem and use 8) in 105, Lanquino 9) human R, with a Carter family: Characterization molecular collagen WG weight of five β subunit. receptor and Santoro on SA: adhesion of cells Wayner laminin multiple processing 360, J distinct Biol Chem human melanoma cells. J of The membrane platelets to glycoprotein collagen. J Cell Biol cell unique adhesion α and receptors common for collagen β subunits. and J Cell Biol HD, JL, E: of WT a Engvall E Biol (1989) 109, F: Laminin and Ruoslahti E: Endothelial cells 2455-2462. receptor Allen and on platelets isolation receptor. Yamada in cell 109, Identification fibronectin and Roles mediates J Cell Ruoslahti Chen (1989) Goodwin WG, Hogervorst expected SS, antibodies: family and and properties Biol Carter in the integrin 487-489. MD J Cell E, receptor. PW Yamada monoclonal receptor KR, (1988) SK, Gresham integrin Identification Modderman organization. 11) protein 130,000 Mg++-dependent fibrosarcoma Pierschbacher Akiyama EA, the WG: as A, Nature with Wayner Gehlsen glycoprotein 10) of mediates Carter α2 β1 integrins Sonennberg Pytela Identification VLA 1873-1884. LR, VLA-6. The common 1917-1924. EA fibronectin 7) with 俊 4686-4688. SM, complex 108, (1987) L: a N: 264, Rajpara (VLA-2) (1989) Schwartz each Marks (1989) W, Wayner and 忠 3300-3309. RH Ia-IIa C heterodimers 262, Biol 6) Huang surface 谷 KM: adhesion, Cell Analysis migration. of a (1985) 140Kd 40, of fibronectin matrix assembly cell surface 191-198. receptor and function cytoskeletal 863-875. PM, Anderson DC Arg-Gly-Asp-stimulated and Brown neutrophil EJ: A novel phagocytosis. member J Cell the Biol integrin (1989) 108, 1935-1943. 12) Cederpholm in 13) BO, patients Makino Wieslander with H, 14) 15) 17) Circulating Proc Haramoto T, Versatility, Acad Shikata matrices microscopy. complexes Natl K, Invest modulation, USA K, signaling in and 68, 85, Ota nephropathy (1993) IgA (1988) Hironaka in diabetic Lab containing Sci Z and fibronectin 4865-4870. and revealed Yashpal by high SK: resolution 45-55. cell adhesion. Cell A, Hillemanns P (1992) 69, 11 . Kerjaschi A 16) Integrins: G: extracellular immunoelectron RO: -25 of Bygren nephropathy. Y, changes and Hynes IgA Yamasaki Ultrastructural scanning J and primary D, Ojha β1-integrin for Ylanne J, M, and kidney. adult cally M, Susani recepter Korhonen Korhonen PP, Horvat fibronectin Laitinen Lab Invest Ylanne expressed M, J, Binder in human L and (1990) Laitinen in distinct R, segments kidney Virtanen 62, L S, Hovorka glomeruli. I: Distribution Am of J Pathol β1 and and (1989) Pytela 134, β3 integrins R: 481-489 in human . fetal 616-625. and Virtanen I: of developing The and α1-6 subunit adult human of integrins nephron. are J Cell characteristi Biol (1990) 111, 1245-1254. 18) Makino H, vitronectin 19) 20) Makino H, in the renal Barnes J products. Shikata receptor Shikata K, K, Am Hevey J Pathol Jpn KA: S, Wada glomerulus. Morioka glomerulus. and Morioka in the S, J Nephrol Glomerular (1991) 138, J and Connect Wada J and (1993) mesangial 859-866. Ota Z: Tissue Ota 35, Localization (1992) Z: 23, Expression of fibronectin receptor and 71-76. of the VLA family of integrins 19-21. cell migration. Responce to platelet secretory β1インテグリンおよびフィブロネクチンの局在 21) Cosio FG, Sedmak kidney and human DD and Nahman mesangial NS Jr: Cellular receptors for matrix proteins in normal cells. Kidney Int (1990) 38, 886-895. 203 human 204 柏 Expression of β1 谷 integrin 忠 and in patients fibronectin with of Internal University Okayama Integrins are cells nents and we β1 integrin, an in indirect endothelial of IgA nephropathy may play nephropathy. an adhesion examined the To the glomeruli cells expressed and in the of IgA and immunoelectron surface epithelial proliferation and of cells, of the fibronectin, and mesangial cells in the which glomerulus and increase study control area matrix and a in increase. also extracellular ligand using glomerular normal in is glomer of nephropathy mesangial mesangial the compo of membranous cells, in interaction cellular progression microscopic of increased and composed in nephropathy the adhesion is integrins β1 integrin was mesangial of and construction mediate glomerulus role capsullar fibronectin mesangial role proliferation on Bowman's and showing important with study was β1 integrin of patients Z. Ota) which renal the expression in Prof. The clarify Medicine, Medical School, molecules matrix. matrix. β1 integrin expression immunecomplex, of immunofluorescence antibodies. cells, family extracellular extracellular ulonephritis, by a and glomeruli 700, Japan (Director: between the KASHITANI Department Okayama in glomerulonephritis Tadatoshi Third 俊 in the specific epithelial glomeruli. The patients with β1 integrin deposition matrix of in IgA