要約本研究開発は、プログラム方式二酸化炭素固定化・有効利用技術開発事業の一テーマとして、経済産業省からの資金をもとに、財団法人地球環境産業技術研究機構（RITE）が実施するものである。本研究開発のテーマである「革新的省エネルギー水素供給ステーション実現のための基盤技術研究（副題）バイオシフト反応による高効率水素製造システム」について、その研究開発目的と内容を記す。水性ガスシフト反応は一酸化炭素の二酸化炭素への酸化に伴う、水の還元による水素の生成反応であり、工業的に重要な水素製造法である。 CO + H2O → CO2 + H2 実際の工業プロセスでは天然ガス由来のメタンを原料にして、高温スチームと共に改質反応を行う。発熱反応であるため、低温条件で反応平衡が水素の生成側に傾いているが、効率よく反応を行うために、350-370℃で第 1 段階の反応を行い、その後、温度を下げて 200-220℃で第 2 段階の反応を行う。このような多段階反応を経た後に、残存する CO をさらに除去するために、さらに以下のようなメタン生成反応を行う。「CO + 3 H2 → CH4 + H2 O」。このように CO の除去のために生成した水素を消費しなくてはならず、本反応はエネルギー消費型の反応であると言える。一部の光合成細菌（Rhodospirillum rubrum、 Rubrivivax gelatinosus）で、本反応を触媒することが報告されている。この生物学的シフト反応(バイオシフト反応）は常温・常圧で進行するため、平衡定数が水素生成反応の制限となることはなく、理論上高い水素収率を得ることができる。しかし、工業的にバイオシフト反応を利用するためには、反応速度の飛躍的な向上が必要であり、このためには基礎的知見の収集が必要とされる。光合成細菌の培養は光依存的な嫌気条件を必要とするため、高密度菌体を用いたリアクター当たりの生産性の高いシフト反応プロセスを構築することは困難とされてきた。そこで本プロジェクトでは、光に依存しない触媒菌体の調製及びバイオシフト反応プロセスの構築を検討することにより、高密度菌体を利用した高生産性バイオプロセスの構築を目指している。本成果報告書は上記技術課題を中心に、平成 17 年度から平成 19 年度までの三ヵ年計画の平成 19 年度に実施した研究の成果についてまとめたものである。以下に内容を要約する。第1章は緒言である。第2章では、ゲノム情報に基づいた水素生成系の機能解明を実施した。これまでの Rhodopseudomonas palustris No. 7株に代わり、本年度は2004年に米国アイオワ大学の Harwoodらによって全ゲノム解読されたR. palustrisCGA009株を用いた。CGA009株の染色体は多数のCODHのサブユニットをコードしており、定量PCR法を用いてこれらの遺伝子がCO誘導時発現していることを確認した。その結果、small subunitのRPA4668がもっとも強く発現した。このことからこれらのCODH遺伝子はバイオシフト活性への関与が示唆さ－1－れた。さらにこれらの遺伝子の機能を確認するため、それぞれの遺伝子の破壊株の作製を行った。その結果、これらCODHの遺伝子破壊株はバイオシフト活性がほとんど残存し、これらのCODH遺伝子はCGA009株のバイオシフト活性に必須ではないことが分かった。しかし、RT-PCRの結果ではCO誘導時に発現していることから、アノテーションされていない別のCODHのバイオシフトへの関与が考えられた。 CODHにリンクしたヒドロゲナーゼがバイオシフト反応には必須である。そこでCGA009 株の染色体上に存在する３つのヒドロゲナーゼ遺伝子がバイオシフト反応に関与しているかどうかを確認するため、それらの遺伝子破壊株の作製を行った。しかし、作製した3つのヒドロゲナーゼ遺伝子破壊株は同様なバイオシフト活性を示した。この結果からこれらのヒドロゲナーゼ遺伝子もCGA009株のバイオシフト活性には必須ではないことが示された。光合成細菌に存在するニトロゲナーゼは、窒素固定であるアンモニア還元の代わりにプロトンを還元することも可能で水素生成機能も有している。従って、COから出てきた電子がニトロゲナーゼに渡り、水素の生成に使われる可能性も考えられる。すなわち、ニトロゲナーゼはバイオシフトへの関与があるかもしれない。この経路を確認するためにニトロゲナーゼ遺伝子の破壊を行った。しかしニトロゲナーゼ遺伝子破壊株もバイオシフト変換活性の変化はなかった。この結果から、今回破壊したニトロゲナーゼ遺伝子は、CGA009 株のバイオシフト活性には関与していないと思われる。他のタイプのニトロゲナーゼが水素生成に関与しているかどうかについてはさらに解析が必要である。第 3 章では、マイクロアレイを用いた水素生成系の解析を実施した。CGA009 株のゲノムは多様な代謝系を持っている。バイオシフト反応に関与する遺伝子群は、基質となる CO によって誘導されることが報告されている。そこで、DNA マイクロアレイによるトランスクリプトーム解析を行い、CO によって発現が増強される遺伝子(群)を網羅的に解析することで、バイオシフト反応に関与する遺伝子を抽出した。その結果、マイクロアレイ解析で多くのバイオシフト反応に関連する遺伝子および転写制御遺伝子が誘導された。今後これらの遺伝子の破壊解析、レポーター遺伝子を用いた発現解析、RNA 抽出による RT-PCR 等の結果を解析することによって CO によるバイオシフト反応の誘導発現の全容が解明されると期待される。第 4 章では、シフト反応における水素生産菌のプロテオーム解析を実施した。R. palusris CGA009 株において CO+Ar ガスによる水素生成誘導に関連する蛋白質を同定するために、 Ar のみおよび Ar:CO=80:20 の割合で混合したガスを通気して菌体を培養し、菌体から蛋白質を抽出した。そして、抽出した蛋白質を二次元電気泳動に供して、網羅的に蛋白質の発現解析を行った。その結果、CO+Ar ガス置換により発現が上昇した蛋白質を約 20 スポット検出した。また、CO+Ar ガス置換により蛋白質発現が減少したスポットも検出された。 CO ガス通気により発現が上昇した蛋白質としては、糖やアミノ酸などのトランスポーター、リポ蛋白質、外膜やペリプラズムに局在するような蛋白質が含まれていた。現時点では、これら膜蛋白質が水素生成にどのように関わっているのか不明であるが、膜蛋白質が CO を含むガスで置換したことによりその発現を上昇させたことは明らかであり興味深い。－2－また、今回の研究で同定された蛋白質の中には、CODH や hydrogenase に相当するものは含まれていなかった。また、CODH や hydrogenase 以外の水素代謝に関わる蛋白質としてあげられているもののうち、RPA0944 (CbbG、glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)に相当する蛋白質 (スポット No. 12)の発現が CO+Ar ガス置換により上昇していることが明らかとなった。また、今後さらに、水素生産活性持続性に関与する蛋白質を検討することが、水素の安定的生産に役立つものと考えられる。第5章は研究のまとめと外部発表、参考文献を示す。－3－ Summary Research Institute of Innovative Technology for the Earth (RITE) is running this project as one of the themes for “the Programmed Methods CO2 Fixation and Effective Utilization Technology Development” which supported by the Ministry of Economy, Trade and Industry (METI). This chapter summarizes the objective and comments of this R&D project called “Development of High-efficiency Hydrogen Production using A Biological Water Gas Shift Reaction”. The water-gas shift reaction, in which carbon monoxide is oxidized to carbon dioxide while simultaneously water is reduced to hydrogen, is used to produce hydrogen from synthesis gas. CO + H2O → CO2 + H2 The reaction is exothermic, which means the reaction equilibrium shifts to the right and favors the formation of the hydrogen and CO2 at lower temperature. At higher temperatures, the equilibrium shifts to the left, limiting complete conversion of CO to H2. The reaction is the basis of the industrial H2 produced in the world from methane (CH4 ) in natural gas through steam-methane reforming. Although the equilibrium favors formation of products at lower temperature, the reaction kinetics is faster at elevated temperatures. For this reason, the catalytic water-gas shift reaction is initially carried out in a high-temperature shift (HTS) reactor at 350-370℃. To achieve higher conversions of CO to H2, the gas leaving the HTS reactor is cooled to 200-220℃ and passed through a low-temperature shift (LTS) reactor. Subsequently the remaining CO is removed followed by a methanation reaction. CO + 3 H2 → CH4 + H2O Because the CO consumed part of the hydrogen product during the methanation reaction, H2 production system using the methanation steps would include a LTS rector to convert as much CO to H2 possible before methanation. Otherwise, large amount of the product H2 would be consumed during methanation. Few organisms, photosynthetic bacterium Rhodospirillum rubrum and Rubrivivax gelatinosus that can perform this water-gas shift reaction have been reported. One significant advantage of the biologically-based water gas shift reaction is their ability to operate at ambient temperature. Because the reaction occurs at ambient temperature, the reaction is not equilibrium-limited (at 25℃, K EQ~5×104). The advantages of low operating temperature and lack of equilibrium limitation make the biological shift reaction a promising alternative for large scale H2 production to conventional shift technologies. However, much work needs to be done to develop this promising technology. For commercially viable hydrogen production using biological process, it is necessary to overcome low volumetric hydrogen productivity, attributed to the low cell density of the biocatalyst. It is difficult to utilize high density culture for the microbial process －4－ because cell growth of photosynthetic bacteria is limited by light energy conversion efficiency. To improve biological water-gas shift reaction for producing biomass-derived hydrogen, our research focuses on developing a bioprocess in which light illumination is independent on cell growth and water-gas shift reaction using the photosynthetic bacterium Rhodopseudomonas palustris No. 7 as the biological catalyst. This project has two different goals: a near-term goal to investigate the utility of the biological process for high-efficiency H2 production as an alternative to conventional shift technology, and long-term goal to develop robust biocatalyst for commercial viability. Chapter 1: Introduction Chapter 2: Clarifying the genes responsible for the water-gas shift reaction in CGA009 We have studied R. palustris No. 7 to improve water-gas shift activity. However, its genome has not been determined and the genes for water-gas shift reaction not identified. R. palustris CGA009 shows as much water-gas shift activity as R. palustris No. 7 and its complete genome was determined by Harwood. From this year we started using R. palustris CGA009 instead of R. palustris No. 7 to isolate genes responsible for the water-gas shift reaction. R. palustris CGA009 has two isozymes of small subunits, two isozymes of medium subunits, and three isozymes of large subunits. RT-PCR analysis indicated that these genes were expressed in the CO-induced cells. In order to confirm whether the CODH genes are involved in the water-gas shift reaction, we constructed a series of disruption mutants. These mutants retained the water-gas shift reaction activity, indicating that these genes may not responsible for the water-gas reaction in R. palustris CGA009. Water-gas shift reaction requires two enzymes, CODH and hydrogenase. R. palustris CGA009 has several hydrogenase genes. In order to confirm whether they are involved in the water-gas shift reaction, we constructed three mutants. Three disruption mutants didn’t loss the water-gas reaction activity, indicating that they are not involved in the hydrogen evolution in R. palustris CGA009. Nitrogenase is the enzyme used by some organisms to fix atmospheric nitrogen gas with evolution of hydrogen gas. There is a possibility that electrons used for hydrogen evolution comes from CO. In order to confirm whether nitrogenase is involved in the water-gas shift reaction, we disrupted the nidrogenase gene of R. palustris CGA009. Three disruption mutants didn’t loss the water-gas reaction activity, indicating that they are not involved in the hydrogen evolution in R. palustris CGA009. Chapter 3: Microarray analysis of water-gas shift reaction mechanism R. palustris CGA009 is among the most metabolically versatile bacteria known. Its complete genome has been determined by Harwood. The genes for the water-gas shift reaction have been reported to be induced by CO gas. We tried to identify regulation genes and water-gas shift reaction related genes using microarray. With CO induction, several hydrogenases and regulators were up-regulated. The relationship with water-gas shift reaction should be further －5－ studied. Chapter 4: Proteome analysis It is known that CGA009 has the ability to produce hydrogen induced by CO gas. However, the molecular mechanism of hydrogen synthesis of R. palusris has not been completely studied. The genome sequencing of this strain has already been completed and it is expected that molecular mechanism analysis of hydrogen synthesis wil be well performed. Proteins induced by CO gas atmosphere were analyzed by two-dimensional electrophoresis (2DE) and identified. CGA009 was anaerobically cultivated in van Niel’s medium. When OD reached 0.5, cells were washed by PNSB-MM medium twice. After the supernatant was removed by centrifugation, the cells were re-suspended with 15mL PNSB-MM medium Hydrogen synthesis was induced by (20% CO + 80% Ar) atmosphere. As a control experiment, culture under Ar (100%) was also performed. Hydrogen production was realized only under (20% CO + 80% Ar) atmosphere. As a result of 2DE, intensities of more than twenty spots on the 2D-gel increased, compared with data of control experiments, while intensity of one spot decreased. The proteins which showed significant change of intensities were identified by LC/MS/MS. CODH and hydrogenase were not among the identified proteins, which were already reported as proteins related to hydrogen synthesis induced by CO gas. The protein encoded by RPA0944 (CbbG、glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) was among the upregulated ones (spot No. 12), suggesting that it might be involved in hydrogen synthesis. －6－