Panneaux DEKALB/200PPP>>PDF 15/05/01 19:50 Page 1 Le marquage moléculaire Le marquage moléculaire regroupe un ensemble de techniques révélant des différences de séquences d’ADN (acide désoxyribonucléique) entre individus. Les marqueurs moléculaires permettent de détecter ces différences (polymorphisme) dans des régions spécifiques de l’ADN. L’ADN : le support de l’information génétique Transcription Traduction Noyau Expression d’un caractère Gène Plante Cellule Chromosome ADN ARN messager Protéine Exemples de marqueurs moléculaires ■ Les microsatellites Les microsatellites sont des séquences constituées de répétitions en tandem de motifs nucléotidiques. Les plus courants sont CA, CAT, GATA ; le nombre de répétitions de ces motifs varie de quelques unités à plusieurs dizaines. L’analyse d’un marqueur microsatellite permet de révéler ces répétitions. ■ Les SNP (Single Nucleotide Polymorphism) Les marqueurs SNP révèlent des différences d’une seule base dans une séquence d’ADN connue. Identification pour une même séquence d’ADN d’un SNP entre deux variétés Séquence d’ADN cible Microsatellite X monomorphe Microsatellite Y polymorphe Variété 1 TCTCTCTC CATCAT Variété 2 TCTCTCTC CATCATCAT Variété 1 ATCCGCTT AGATCCTA Variété 2 ATCCGCTCAGATCCTA SNP Liens entre génotype / phénotype Le génotype est l’ensemble du patrimoine génétique d’un individu. L’expression du génotype conduit au phénotype. Le phénotype est l’ensemble des caractères observables chez un individu dans un environnement donné. Exemple : couleur de la fleur Variété 1 Variété 2 ADN ADN Gène C Gène C Génotype Phénotype Les marqueurs moléculaires permettent d’augmenter l’efficacité et la précision des techniques d’amélioration des plantes, en intervenant à certaines étapes du processus de sélection. Panneaux DEKALB/200PPP>>PDF 15/05/01 19:51 Page 2 Extraction de l’ADN végétal C’est le procédé qui permet d’isoler l’ADN contenu dans les noyaux cellulaires d’un fragment de tissu végétal (feuilles, graines). Il constitue le matériel de base pour toute analyse de marquage moléculaire. L’automatisation de ce procédé permet l’extraction de l’ADN d’un nombre important d’échantillons par unité de temps. Echantillonnage Broyage Lyse cellulaire par incubation au bain-marie (95° C, 1 h) dans un tampon d’extraction Sels de précipitation (NH4C2H3O2) + alcool Précipitation de l’ADN Centrifugation Eclatement des cellules, l’ADN se libère dans la solution Récupération du surnageant (ADN + protéines) Pelote d’ADN Elimination du culot composé de débris végétaux (membrane…) Centrifugation Lavage Récupération du culot d’ADN après séchage Culot dans un évaporateurd’ADN concentrateur Elimination du surnageant Suspension de l’ADN dans une solution tampon ADN Panneaux DEKALB/200PPP>>PDF 15/05/01 19:52 Page 3 PCR ou amplification de l’ADN L’objectif de cette technique est de multiplier un fragment d’ADN en un grand nombre de copies afin de rendre possible sa visualisation. ADN à amplifier Préparation de la réaction de PCR Préparation robotisée du mélange réactionnel : ■ l’ADN matrice ■ les nucléotides (A, T, C, G) ■ du MgCl2 et de l’H2O ■ les amorces ■ l’enzyme Taq polymérase 1er cycle 94°C Dénaturation 50 à 65°C Hybridation 72°C Elongation Robot : Tecan Amplification de l’ADN Cette amplification par PCR (Polymerase Chain Reaction) est constituée d’une répétition de cycles comportant trois étapes : Dénaturation ■ Dénaturation Séparation des deux brins d’ADN. ■ Hybridation Hybridation Accrochage des amorces sur la séquence cible qui seront le point de départ de la synthèse du nouveau fragment. Une trentaine de cycles d’amplification sont suffisants pour détecter l’ADN amplifié. Thermocycleur : appareil permettant l’obtention des températures nécessaires à chaque cycle d’amplification. 30ème cycle Synthèse de la chaîne nucléotidique par une enzyme, la Taq polymérase. 2ème cycle ■ Elongation Elongation Durée du processus : 1h30 à 2h Panneaux DEKALB/200PPP>>PDF 15/05/01 19:53 Page 4 Visualisation de l’ADN amplifié ou révélation La révélation est l’étape qui consiste à visualiser les fragments d’ADN amplifiés. Deux méthodes sont utilisées au laboratoire. Electrophorèse Système de révélation TaqMan Cette technique est utilisée pour la séparation des fragments amplifiés selon leur taille sur un gel d’agarose ou d’acrylamide dans un champ électrique. Le système Taqman est basé sur une différence au niveau d’un nucléotide dans une séquence d’ADN. Trois étapes sont nécessaires : ■ Hybridation sur l’ADN cible d’une sonde complémentaire portant une molécule fluorescente (le fluorophore). Chaque sonde est spécifique d’une séquence d’ADN donnée. ■ Elongation, au cours de laquelle l’enzyme Taq polymérase libère le fluorophore. ■ Visualisation par excitation et quantification du fluorophore à une longueur d’onde qui lui est propre. Dépôt sur gel d’agarose Cuves d’électrophorèse Variété 1 Variété 2 Fragments d’ADN amplifié Système de révélation SNP Taqman 7900 HT Hybridation Migration sur gel d’agarose Migration des fragments d’ADN selon leurs tailles sur un gel d’électrophorèse soumis à un champ électrique 1 G ACGTAGCCGCTCAGATCCTATTCG TCT CGAG F2 Amorces F Fluorophore Sonde spécifique à la variété 1 F1 1 F2 Lumière ultra-violet 1 ière Lum ence resc Fluo F1 Variété 1 GAATCT ACGTAGCCGCTTAGATCCTATTCG Séquence d'ADN cible Variété 2 ACGTAGCCGCTCAGATCCTATTCG CGAGTC 2 F2 C scence Lumière Fluore Photographie Résultat de la migration Fluorescence Sonde spécifique à la variété 2 Taq polymérase Elongation Révélation L’addition de bromure d’éthidium permet la visualisation des fragments d’ADN après électrophorèse. Cette molécule s’intercale entre les bases de l’ADN et a la propriété d’être fluorescente sous lumière ultraviolette : T TCT CGAA ACGTAGCCGCTTAGATCCTATTCG Séquence d'ADN cible Variété 2 2 Fluorescence F1 2 Variété 1 Lors de la migration sur gel, les fragments d’ADN les plus grands sont retardés par rapport aux plus petits A Lumière Visualisation Echelle de F1 fluorescence pour F1 Variété 1 Variété 2 0 Echelle de fluorescence F2 pour F2 L’information est ensuite stockée sur un serveur, pour être analysée avec des outils statistiques. Panneaux DEKALB/200PPP>>PDF 15/05/01 19:54 Page 5 Description de la variabilité génétique Chaque individu d’une espèce donnée peut être identifié rigoureusement par une empreinte génétique ou “fingerprinting”. Pour établir cette empreinte, une analyse du polymorphisme de l’ADN est conduite avec un ensemble de marqueurs moléculaires (quelques dizaines à quelques centaines). Le profil de chaque individu est observé pour chacun des marqueurs analysés. C’est la combinaison de ces données qui constitue l’empreinte génétique. La comparaison des empreintes génétiques au sein de populations ou groupes d’individus permettra une caractérisation plus poussée de la variabilité génétique, et fournira une meilleure connaissance des relations de parenté entre individus. Caractérisation et structuration de la variabilité génétique Le “fingerprinting” permet au sélectionneur d’optimiser les décisions stratégiques en ce qui concerne la gestion des ressources génétiques : ■ le choix des lignées parentales pour la création d’hybrides ou de populations à sélectionner. Le sélectionneur privilégie les croisements entre deux parents complémentaires et suffisamment éloignés pour la production d’hybrides performants. ■ la constitution de collections variétales assurant la conservation de ressources génétiques à long terme. Variétés 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 350 pb 300 pb 250 pb 200 pb Marqueur 215 pb Mon 358 160 pb 150 pb 100 pb 50 pb Marqueur de poids moléculaire (fragments de taille connue) Variétés A B C Marqueur 1 Marqueur 2 Marqueur 3 Marqueur 4 Etablissement d’une matrice de lecture Variétés A B C Marqueur 1 1 1 1 Marqueur 2 1 1 0 Marqueur 3 0 1 0 Marqueur 4 1 0 1 Calcul des % de similarité entre individus Représentation graphique (dendrogramme) Deux types de représentation graphique de la variabilité génétique Graphique ACP Dendrogramme Analyse en Composantes Principales A B A C C A est plus proche de C que de B B Représentation graphique (ACP) Panneaux DEKALB/200PPP>>PDF 15/05/01 19:55 Page 6 La Sélection Assistée par Marqueurs (S.A.M) C’est une stratégie qui améliore l’efficacité des processus de sélection (progrès génétique par unité de temps) pour la création de variétés hautement performantes. Par l’utilisation des marqueurs moléculaires, qui permettent l’étiquetage de régions chromosomiques favorables à l’expression de caractères d’intérêt, la sélection assistée par marqueurs rend possible la construction des meilleures combinaisons de gènes. Deux étapes principales : ■ Identification des régions d’ADN impliquées dans l’expression des caractères complexes (rendement, précocité de maturation) : analyse des corrélations marqueurs-caractères. ■ Recombinaison des individus les plus complémentaires pour l’accumulation de ces régions favorables. Utilisation de la SAM pour l’obtention de nouvelles variétés “élites” Exemple d’un marqueur informatif : Test statistique au marqueur X Différence des effets sur le rendement Développement d’une population en ségrégation Nb Recombiner les caractéristiques apportées par les 2 parents Parent 1 BB AA Rendement Parent 2 Supériorité de la forme A au marqueur X Essais aux champs Analyse des corrélations Marqueurscaractères Parent 1 Parent 2 Individus GénotypageMarqueur X AA BB AB AA BB BB AA AB BB AB Sélection et intercroisement Augmentation de la fréquence des gènes favorables Nouvelle population Initiation d’un nouveau cycle Analyse aux marqueurs informatifs Sélection des individus ayant accumulé le plus de régions chromosomiques favorables Créer la meilleure combinaison : Chromosomes 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Région favorable Parent 1 112 111 109 Résultats 108 attendus 107 105 104 103 101 Rendement 100 99 en Qx/ha Gain de rendement : + 7 % en moyenne Meilleur hybride (parent) Sélection phénotypique Région favorable Parent 2 Sélection assistée par marqueurs Expérience DEKALB de Sélection Récurrente Assistée par Marqueurs sur 43 populations de maïs Profil de l’individu idéal Panneaux DEKALB/200PPP>>PDF 15/05/01 19:57 Page 7 Les conversions assistées par marqueurs Certains caractères monogéniques présentent un intérêt majeur pour l’amélioration des variétés et leur réussite commerciale sur le marché : résistance à des maladies, qualité d’huile, transgènes (ex : Maïs Bt). Une fois identifiés, ces gènes portés par une plante appelée donneuse, peuvent être transmis par croisement à toute autre plante receveuse. Dans un deuxième temps, une succession de rétrocroisements (Back cross) avec le parent receveur est réalisée afin d’éliminer les portions d’ADN provenant du donneur à l’exception du gène d’intérêt. L’efficacité de ce processus est améliorée par l’utilisation de marqueurs moléculaires bien répartis sur le génôme (marqueurs cartographiés). Plante donneuse Marqueur moléculaire cartographié Plante receveuse Caractère d’intérêt Chromosome 1 2 3 1 2 3 Elimination des descendants n’ayant pas le caractère d’intérêt F1 Sélection des individus génétiquement les plus proches de la lignée receveuse et possédant le caractère d’intérêt 1 2 3 1 2 3 Back Cross 1 1 2 3 1 2 3 Back Cross 2 1 2 3 Efficacité comparée de la conversion assistée par marqueurs avec la conversion traditionnelle Par sélection classique, 6 rétrocroisements sont nécessaires pour obtenir un retour vers le parent receveur de 97 % alors qu’avec les marqueurs moléculaires 2 rétrocroisements seulement suffisent. La conversion assistée par marqueurs permet un gain de temps de 2 à 3 ans. % de récupération du parent récurrent Conversion assistée par marqueurs 100 97 Conversion traditionnelle 90 80 70 Nombre de rétrocroisements 60 1 2 3 4 5 6 Panneaux DEKALB/200PPP>>PDF 15/05/01 19:57 Page 8 Les marqueurs diagnostics Il s’agit de marqueurs moléculaires liés à des caractères à déterminisme simple (monogénique), comme la résistance à certaines maladies (mildiou). Une fois la liaison génétique établie entre le gène et le marqueur, il devient très facile de suivre et contrôler la présence de ce gène chez n’importe quel individu sans avoir recours à l’observation phénotypique du caractère. Détermination du phénotype à l’aide d’un marqueur diagnostic Variété A Gène de résistance au mildiou Variété B Forme résistante Forme sensible ADN Marqueur diagnostic (résistance) Marqueur diagnostic (sensibilité) PCR Electrophorèse Les marqueurs diagnostics permettent de déterminer le phénotype de la plante dès le stade précoce Plante 1 Plante 2 résistante résistante Plante 3 Plante 4 Plante 5 Plante 6 sensible résistante sensible résistante La disponibilité d’un marqueur lié à un gène majeur (marqueur diagnostic) est une aide précieuse pour le sélectionneur. Comme un fragment de feuille suffit à obtenir l’ADN nécessaire pour établir l’empreinte génétique d’une plante, un tri précoce peut être établi dès le début de la croissance des plantes. Ceci permet un gain de temps et d’argent, car il n’est plus nécessaire d’attendre le stade adulte pour observer le phénotype. Panneaux DEKALB/200PPP>>PDF 15/05/01 19:58 Page 9 Détection d’OGM dans le contrôle qualité Aujourd’hui, la biologie moléculaire permet de contrôler certains paramètres de qualité des semences, de leur conception à leur commercialisation. Monsanto a d’ores et déjà mis en place un système de contrôle, dont les capacités sont uniques en Europe, pour éliminer tout risque de présence fortuite d’OGM dans les variétés conventionnelles (un OGM est une plante dans laquelle la présence d’un nouveau gène, lui confère un nouveau caractère). On recherche la présence de ce gène dans un échantillon représentatif (semence ou tissu végétal) de 3 manières possibles. Echantillon végétal Détection du gène Exemples : • gène Bt • gène Roundup Ready Test ADN Détection de la protéine Détection du nouveau caractère Exemples : • toxine anti-insecte • enzyme de résistance au Roundup Exemples : plante résistante • à la pyrale • au Roundup Test ELISA Détection immunologique de la protéine Extraction Test biologique Exemples : libération d’insectes, pulvérisation de pesticide PCR Quantitative Révélation et identification du gène Différentes analyses des résultats Qualitative La détection d’OGM est une technique utilisée : ■ actuellement pour mesurer la teneur en OGM dans les semences conventionnelles. ■ à l’avenir et dans les pays où les OGM sont commercialisés, garantir la présence et la pureté des nouveaux gènes dans les semences génétiquement modifiées.
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