VALIDATIEDOSSIER DOSSIER DE VALIDATION SOP/MYC/ANA/09

C O D A - C E R V A-TERVUREN
Leuvensesteenweg 17 - B 3080 Tervuren
PRO/5.4/02/DOC/01/V04
VALIDATIEDOSSIER
DOSSIER DE
VALIDATION
SOP/MYC/ANA/09
Détermination par LC-MS/MS des
aflatoxines B1, B2, G1, G2 et de
l’ochratoxine A dans les épices et dans le
cacao et ses dérivés.
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PRO/5.4/02/DOC02/V01
HISTORIQUE DU DOSSIER DE VALIDATION
SOP/MYC/ANA/09
Date
Phase/Modification
Juillet –
Novembre 2013
Réalisation des analyses de validation selon le mode 3*3*3:
Analyste
Préparateur des
Date
Matrice
LCéchantillons
MS/MS
09/07/2013
Piment et poivre
F. Langenhaeck
C. Thiry
16/07/2013
Piment et poivre
F. Langenhaeck
C. Thiry
23/07/2013
Piment
F. Langenhaeck
C. Thiry
29/07/2013
Poivre
F. Langenhaeck
C. Thiry
01/10/2013
Cacao
F. Langenhaeck
C. Thiry
03/10/2013
Cacao
F. Langenhaeck
C. Thiry
31/10/2013
Cacao
Curcuma,
gingembre, muscade,
chocolat
F. Langenhaeck
C. Thiry
F. Langenhaeck
C. Thiry
07/11/2013
15 octobre 2013
Modification de la méthode d’élution: le gradient est établi en mode binaire plutôt
que quaternaire (cf. annexe 2).
Novembre 2013
Rédaction du dossier de validation.
Février 2014
Mise en application de la SOP/MYC/ANA/09.
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PRO/5.4/02/DOC03/V01
DOMAINE D’APPLICATION
Cette méthode est d’application pour effectuer le contrôle des teneurs en aflatoxines(AF) B1, B2, G1,
G2 et en ochratoxine A (OTA) dans des échantillons d’épices, de cacao et de produits dérivés du
cacao.
CRITERES DE VALIDATION
Les critères suivants, basés sur les limites maximales autorisées, furent considérés pour valider la
méthode (tableau 1):
Tableau 1: Critères de validation
EPICES
Mycotoxine
LMA (µg/kg)
Récupération2 (%)
RSDR2 (%)
5
70 - 110
≤ 2 * la valeur
dérivée de l’équation
d’Horwitz
15
70 - 110
≤ 30
1
AFB1
AFB2
AFG1
AFG2
OTA
CACAO ET PRODUITS DERIVES
Mycotoxine
LMA3 (µg/kg)
Récupération2 (%)
RSDR2
5
70 - 110
≤ 2 * la valeur
dérivée de l’équation
d’Horwitz
15
70 - 110
≤ 30
AFB1
AFB2
AFG1
AFG2
OTA
1
Limite Maximale Autorisée, telle que définie dans 1881/2006/EC (Règlement n°1881/2006 de la
Commission Européenne portant sur la fixation des teneurs maximales pour certains contaminants
dans les denrées alimentaires) et 165/2010/EC (Règlement n°165/2010 de la Commission Européenne
amendant le règlement n°1881/2006 de la Commission Européenne portant sur la fixation des teneurs
maximales pour certains contaminants dans les denrées alimentaires concernant les aflatoxines).
NB: Concernant les AF’s, une LMA est uniquement définie pour AFB1. Dans le cadre de cette
validation, nous appliquons la même LMA à AFB2, AFG1 et AFG2.
2
Taux de récupération et écart-type relatif en conditions de reproductibilité (RSDR) tels que définis
dans l’annexe II de 401/2006/EC (Règlement n°401/2006 de la Commission Européenne portant sur
les critères applicables à la préparation des échantillons et aux méthodes d’analyse utilisées pour le
contrôle officiel des teneurs en mycotoxines des denrées alimentaires).
3
Concernant le cacao et ses dérivés, aucune norme ne fixe de LMA pour les AF’s tandis qu’une LMA
pour l’OTA est en cours de discussion. Il a été décidé dans le cadre de cette validation de considérer
des LMA identiques à celles des épices, càd 5 µg/kg pour les AF’s et 15 µg/kg pour l’OTA.
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PARAMETRES DE VALIDATION
Une validation complète a été réalisée sur le piment rouge, le poivre blanc et la poudre de cacao.
L’applicabilité de cette méthode a ensuite été vérifiée pour des matrices apparentées via l’analyse de
curcuma, de noix de muscade, de gingembre et de chocolat.
1. Validation complète
Sur base de la PRO/5.4/02 (Gestion de la validation des méthodes au CODA-CERVA Tervuren), les
paramètres suivant furent considérés pour valider la méthode:
La fidélité, i.e. la reproductibilité intra-laboratoire;
La récupération;
La limite de décision (CCα) et la capacité de détection (CCβ);
L’incertitude de mesure;
La spécificité analytique;
La robustesse;
La linéarité de l’étalonnage.
Comme mentionné dans la PRO/5.4/02, les calculs de fidélité, de récupération, de limite de décision et
de capacité de détection ont été faits à l’aide du template ‘ValMethTerv’ suite à l’analyse
d’échantillons selon le mode 3*3*3, i.e. 3 répliques du même échantillon spiké à 3 niveaux différents
(0.5 - 1 et 2 fois la LMA + 1 blanc) lors de 3 jours différents (cf. annexe 1).
Concernant la méthode, une description détaillée du mode opératoire ainsi que des paramètres
d’identification et de quantification des analytes est disponible dans la SOP/MYC/ANA/09.
a. Fidélité
La fidélité de la méthode a été estimée au moyen de la reproductibilité intra-laboratoire (RSDRW) qui
prend en compte les variations dues à la réplique (i.e. répétabilité) et au jour, tel qu’expliqué dans la
norme ISO 5725-2 (Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results - Part 2:
basic method for the determination of repeatibility and reproducibility of a standard measurement
method, 1994) et dans l’article de Van Loco et Beernaert (Van Loco, J. & Beernaert, H. (2003). An
alternative method validation strategy for the European Decision 2002/657/EC. Proceedings of Euro
Food Chem XII: Strategies for Safe Food, 1, 91-94) sur lesquels se base le template ‘ValMethTerv’.
Le tableau 2 montre une RSDRW en accord avec les critères de reproductibilité de 401/2006/EC.
b. Récupération
Le taux de récupération de la méthode a été estimé après spiking de l’échantillon sur trois niveaux (0.5
- 1 et 2 fois la LMA). Lorsque l’échantillon était naturellement contaminé, les quantités
intrinsèquement présentes dans l’échantillon étaient soustraites de celles de l’échantillon spiké. Le
pourcentage de récupération est donné par la pente de la droite de régression de la concentration
mesurée dans l’échantillon spiké en fonction de la concentration spikée. Le tableau 2 montre les
pourcentages de récupération obtenus. Ceux-ci sont en accord avec les critères de 401/2006/EC.
c. Limite de décision (CCα) et capacité de détection (CCβ)
Les valeurs de ces deux paramètres ont été calculées par le template ‘ValMethTerv’ sur base de la
norme ISO11843-2 (Capability of detection – Part 1: terms and definition, 2000), tel que décrit dans
Van Loco et Beernaert, 2003. Les valeurs obtenues sont présentées dans le tableau 2.
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Tableau 2: Valeurs de fidélité (RSDRW), récupération, limite de décision et capacité de détection
de la méthode.
PIMENT
Niveau de
spike (µg/kg)
AFB1
AFB2
AFG1
AFG2
OTA
2.5
5
10
2.5
5
10
2.5
5
10
2.5
5
10
7.5
15
30
Limite de decision
CCα (µg/kg)
Capacité de
détection CCβ
(µg/kg)
89
6.3
7.5
86
6.0
7.0
93
6.0
6.9
85
6.2
7.5
89
19.4
23.8
Limite de decision
CCα (µg/kg)
Capacité de
détection CCβ
(µg/kg)
88
6.8
8.7
86
6.9
8.8
92
7.4
9.8
95
7.1
9.3
87
22.5
30.2
Limite de decision
CCα (µg/kg)
Capacité de
détection CCβ
(µg/kg)
6.2
7.4
RSDRW Récupération
(%)
(%)
24
9
11
8
10
9
18
10
8
16
8
12
12
17
13
POIVRE
AFB1
AFB2
AFG1
AFG2
OTA
Niveau de
spike (µg/kg)
RSD
(%)
2.5
5
10
2.5
5
10
2.5
5
10
2.5
5
10
7.5
15
30
11
11
18
16
14
18
16
13
22
13
17
22
17
17
26
Récupération
(%)
CACAO
AFB1
AFB2
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Niveau de
spike (µg/kg)
RSD
(%)
2.5
5
10
2.5
12
11
11
14
Récupération
(%)
89
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AFG1
AFG2
OTA
5
10
2.5
5
10
2.5
5
10
7.5
15
13
11
11
10
7
20
18
9
24
28
30
15
86
6.3
7.5
92
5.6
6.6
80
6.3
7.6
95
20.7
26.5
d. Incertitude de mesure
L’incertitude (u) de mesure de la méthode a été estimée en considérant les incertitudes sur la
reproductibilité et sur la récupération:
u = √(ureprod2 + urécup2) = 19%
avec ureprod = moyenne quadratique des RSDRW = 15%
urécup = moyenne des biais = 11%
L’incertitude étendue (U) s’obtient en multipliant l’incertitude par un facteur d’élargissement k=2:
U = 2u = 38%
Finalement, l’incertitude de mesure de la méthode est arrondie à 40% pour garantir un facteur de
sécurité lié à d’éventuelles incertitudes non prises en compte dans le calcul ci-dessus.
e. Spécificité analytique
La spécificité de la méthode a été vérifiée au moyen de l’analyse d’un blanc solvant, d’un blanc
procédure et d’échantillons non spikés de chacune des matrices testées. La présence de pics
interférents a été monitorée aux temps de rétention des analytes d’intérêt. Dans les blancs solvant et
procédure, aucun pic n’a été détecté. Dans les échantillons non spikés, aucun pic interférent n’a été
détecté i.e. si l’échantillon était naturellement contaminé (e.g. AFB1 et OTA dans le piment), l’identité
du pic détecté a été confirmée au moyen des rapports ioniques de l’analyte de manière à s’ssurer qu’il
ne s’agit pas d’une interférence.
f.
Robustesse
La simplicité de la méthode d’extraction (peu de manipulations et absence de purification) limite les
sources de variation au cours de cette étape. En ce qui concerne les variations dues à l’équipement
analytique, la plupart de celles-ci (volume d’injection, effet matrice, etc...) sont efficacement
compensées par l’ajout systématique d’une quantité constante de standards internes 13C dans les
calibrants et les échantillons.
g. Linéarité
Les coefficients de détermination (R2) obtenus pour les courbes d’étalonnage sur 6 niveaux de
concentration (C1 → C6, tableau 3) étaient systématiquement supérieurs à 0.98, démontrant pour
chaque toxine et matrice la linéarité des résultats par rapport à la concentration (tableau 3).
Tableau 3: Concentrations utilisées pour la droite d’étalonnage.
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AFB1, AFB2, AFG1, AFG2
(µg/kg)
OTA
(µg/kg)
0.1
0.5
1
5
10
25
0.3
1.5
3
15
30
75
C1
C2
C3
C4
C5
C6
2. Calibration
Pour la validation complète, 6 points de calibration furent réalisés. Néanmoins, pour des raisons
pratiques, la méthode finale n’en comportera que 4. Nous avons donc vérifié la linéarité de la courbe et
la récupération obtenues avec 4 points de calibration (C2, C3, C4 et C5) (tableau 4).
Tableau 4: Comparaison du taux de récupération obtenu avec une calibration en 4 ou 6 points.
Récupération (%)
Calibration 6 points
Récupération (%)
Calibration 4 points
PIMENT
AFB1
AFB2
AFG1
AFG2
OTA
89
86
93
85
89
89
86
95
85
81
POIVRE
AFB1
AFB2
AFG1
AFG2
OTA
88
86
92
95
87
84
86
88
93
81
CACAO
AFB1
AFB2
AFG1
AFG2
OTA
89
86
92
80
95
92
88
94
83
94
Les coefficients de détermination (R2) obtenus pour les courbes d’étalonnage sur 4 niveaux de
concentration étaient systématiquement supérieurs à 0.97.
3. Application de la méthode aux matrices apparentées
L’applicabilité de la méthode à d’autres matrices a été vérifiée au moyen de la détermination du taux
de récupération après un spiking au niveau intermédiaire (LMA) sur le curcuma, la noix de muscade,
le gingembre et la poudre de cacao. Le tableau 5 montre des pourcentages de récupération qui sont en
accord avec les critères de validation de la norme 401/2006/EC, exepté pour OTA dans le gingembre
qui montre une valeur légèrement plus basse que la limite inférieure permise par la norme, i.e. 66%.
Cela provient probablement du fait que l’échantillon était déjà naturellement contaminé à environ 8
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µg/kg d’OTA, ce qui peut interférer dans la détection d’un spiking à 15 µg/kg pour peu que
l’échantillon ne soit pas parfaitement homogène.
Tableau 5: Taux de récupération obtenus sur des matrices apparentées.
AFB1
AFB2
AFG1
AFG2
Niveau de
spike
(µg/kg)
5
5
5
5
Récupération
CURCUMA
(%)
95
88
89
78
Récupération
MUSCADE
(%)
86
87
89
93
Récupération
GINGEMBRE
(%)
72
104
87
107
OTA
15
83
83
66
Récupération
CHOCOLAT
(%)
74
75
81
85
95
VERIFICATION DE LA VALIDITE DE LA METHODE: RINGTESTS (CONTROLES DE
3EME LIGNE)
Le tableau 6 présente les valeurs obtenues pour différents essais interlaboratoires concernant les
épices.
Tableau 6: Résultats obtenus aux ring tests.
Date
Valeur
mesurée
(µg/kg)
Intervalle de
tolérance autour
de la valeur
mesurée, i.e.
±40% (µg/kg)
Zscore1
Organisateur
Matrice
Analyte
Valeur de
référence
(µg/kg)
Bipea 021031
Piment
AFB1
7.9
7.8
4.7 – 10.9
-0.05
2.9
32.7
11.0
52.2
19.6
3.1
6.2
1.2
2.9
26.8
3.6
36
15
61.4
22
4.1
9.7
1.4
4.8
22.5
2.2 – 5.0
21.6 – 50.4
9.0 – 21.0
36.8 – 86.0
13.2 – 30.8
2.5 – 5.7
5.8 – 13.6
0.8 – 2.0
2.9 – 6.7
13.5 – 31.5
0.82
0.45
0.83
0.69
0.50
1.5
2.5
0.5
2.8
-0.7
Mars
2013
AFB2
AFG1
AFG2
Total AF’s
OTA
Mars
Noix de
AFB1
DLA-10
2013
muscade Total AF’s
Août
DLA-14
Mélange
AFB1
2013
d’épices Total AF’s
OTA
1
Valeur fournie par l’organisateur du ring test.
Les deux valeurs obtenues pour les AF’s totales aux tests DLA sont légèrement trop élevées par
rapport aux valeurs de référence. Cela peut être du au fait que les valeurs des AF’s individuelles dans
ces échantillons étaient très basses, entrainant qu’une légère surestimation de chacune d’entre elle a eu
un impact important sur leur somme. Par ailleurs, les deux résultats incriminés concernent des valeurs
très inférieures aux normes de teneurs maximales fixées, ces résultats ne remettent donc pas en cause
l’efficacité de la méthode pour détecter des teneurs supérieures aux normes. En dehors de ces deux
résultats, tous les z-scores obtenus se situent entre -2 et 2, qui sont les valeurs généralement acceptées
comme garantissant la performance de la méthode. Enfin, toutes les valeurs de référence sont
comprises endéans l’intervalle de tolérance défini autour de nos valeurs mesurées.
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PRO/5.4/02/DOC04/V01
FACTEURS QUI INFLUENCENT L’EXACTITUDE ET LA FIABILITE DES
ESSAIS - SOP 09
1. Equipement et matériel de laboratoire
Type
d’équipement/matériel
Facteur
Influence sur
le résultat
Contrôle
Entretien annuel + checklist
(annexe 3 de la
SOP/MYC/ANA/09) +
injection des QC
LC-MS/MS
Fonctionnement
général
Haute
Injecteur du LC-MS/MS
Variations dans le
volume d’injection
Haute
Micropipettes
Variations dans le
volume de
prélèvement
Haute
Entretien annuel et calibrage
2x/an
Dispensette pour bouteille de
la solution d’extraction
acqueuse
Variations dans le
volume de
prélèvement
Faible
/
Dispensette pour bouteille de
la solution d’extraction
organique
Variations dans le
volume de
prélèvement
Haute
Entretien annuel et calibrage
2x/an
Balance
Variations dans le
poids pesé
Haute
Calibrage 2x/an et contrôle
quotidien d’un poids étalon
Haute
Contrôle quotidien de la
température
Haute
Procédure précise de nettoyage
Haute
Entretien régulier + contrôle
quotidien de la résistivité et du
contenu organique.
Frigos et congélateurs
Verrerie
Système de purification de
l’eau
Variations de la
température
Nettoyage
insuffisant ou
inapproprié
Fonctionnement
général
13
C standards internes
2. Echantillons et produits
Composant
Facteur
Influence sur
le résultat
Contrôle
Solvants/solutions/sels
d’extraction
Qualité
Faible
Qualité au minimum analytique
Eau
Qualité
Haute
Renouvelée tous les 2 jours
Solvants/solutions/tampons
pour la LC-MS/MS
Qualité
Haute
Qualité au minimum HPLC +
contrôle de la durée de
conservation des solutions.
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Echantillon
Effet matrice
Haute
Echantillon
Hétérogénéité
Haute
Echantillon
Interférences
Haute
Etalons
Variation de la
concentration
Haute
13
C standards internes
Prélèvement de 5g
d’échantillon
Checklist (annexe 3 de la
SOP/MYC/ANA/09)
Comparaison régulière avec des
solutions certifiées
3. Principe de la méthode
Méthode
Influence sur le
résultat
Contrôle
QuEChERS modifié
Faible
Méthode simple et rapide ne devant pas
entrainer de complication pour autant que la
SOP soit rigoureusement suivie.
4. Milieu ambiant
Etape
Facteur
Influence sur
le résultat
Contrôle
Extraction
Général
Faible
/
Préparation des solutions
d’extractions/LC
Général
Faible
/
Séparation LC
Température
Haute
Analyse MS
Température
Haute
Appareil placé dans une pièce
thermostatisée + four pour
colonne
Appareil placé dans une pièce
thermostatisée
5. Personnel
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Etape
Influence sur le
résultat
Extraction
Haute
Analyse
Haute
Contrôle
Formation adéquate du préparateur à la
méthode.
Formation et expérience adéquate de
l’analyste avec l’appareil et la méthode.
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ANNEXES
Annexe 1 : Exemple (OTA dans le piment) du calcul de la fidélité, de la récupération, de la limite de
décision, de la capacité de détection et de l’incertitude de mesure à l’aide du template ‘ValMethTerv’.
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Annexe 2 : Vérification de la fiabilité de la méthode d’élution en mode binaire plutôt que quaternaire,
application à un échantillon de contrôle de 3ème ligne.
Tableau 8: Résultats obtenus aux ring tests.
Valeur mesurée,
élution
quaternaire
(µg/kg)
Valeur
mesurée,
élution binaire
(µg/kg)
Intervalle de tolérance
(± 40%) autour de la
valeur mesurée en
mode binaire (µg/kg)
Echantillon
Analyte
Valeur de
référence
(µg/kg)
Piment
enrichi en
AFs et OTA
(Bipea)
AFB1
7.9
7.8
6.4
3.8 – 9.0
AFB2
2.9
3.6
3.0
1.8 – 4.2
AFG1
32.7
36
30.4
18.2 – 72.6
AFG2
Total
AF’s
OTA
11.0
15
12.1
7.3 – 16.9
52.2
61.4
51.9
31.1 – 72.7
19.6
22
15.2
9.1 – 21.3
La valeur de référence de l’échantillon est bien comprise dans l’intervalle de tolérance de la valeur
mesurée en mode binaire, démontrant que ce changement n’influence pas les résultats.
(fichiers : ‘NOV_PFP_TOTAL_XEVO.PRO / 131118_Piment_bipea.qld’ et
‘131118_Piment_bipea.pdf’)
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Annexe 3 : Liste des documents reprenant les résultats bruts issus de TargetLynx.
Matrice
Répétition
Résultats Target Lynx
Piment
1
JUL_PFP_TOTAL_XEVO.PRO /
130711_Results_valid_spices1.qld
130711_Results_valid_spices1.pdf
2
JUL_PFP_TOTAL_XEVO.PRO /
130716_Results_valid_spices2.qld
130716_Results_valid_spices2.pdf
3
JUL_PFP_TOTAL_XEVO.PRO /
130725_Results_valid_spices3
(chili).qld
130725_Results_valid_spices3
(chili).pdf
1
JUL_PFP_TOTAL_XEVO.PRO /
130711_Results_valid_spices1.qld
130711_Results_valid_spices1.pdf
2
JUL_PFP_TOTAL_XEVO.PRO /
130716_Results_valid_spices2.qld
130716_Results_valid_spices2.pdf
3
JUL_PFP_TOTAL_XEVO.PRO /
130729_Results_valid_spices3
(pepper).qld
130729_Results_valid_spices3
(pepper).pdf
Poivre
Cacao
1
2
Résultats format pdf
OCT_PFP_TOTAL_XEVO.PRO /
20131001_Results_valid_cacao_1.q 20131001_Results_valid_cacao_1.pdf
ld
OCT_PFP_TOTAL_XEVO.PRO /
20131004_Valid cacao 2.pdf
20131004_Valid cacao 2.qld
3
OCT_PFP_TOTAL_XEVO.PRO /
20131031_Valid cacao 3.qld
20131031_Valid cacao 3.pdf
/
NOV_PFP_TOTAL_XEVO.PRO /
131107_Results_valid_matrices
_annexes.qld
131107_Results_valid_matrices
_annexes.pdf
DLA 102013
(muscade)
/
MAR_PFP_TOTAL_XEVO.PRO /
130326_Piment-BIPEA_MuscDLA.qld
130326_Piment-BIPEA_MuscDLA.pdf
Bipea 021031
(piment)
/
MAR_PFP_TOTAL_XEVO.PRO /
130326_Piment-BIPEA_MuscDLA.qld
130326_Piment-BIPEA_MuscDLA.pdf
DLA 142013 (mix
épices)
/
JUL_PFP_TOTAL_XEVO.PRO /
130723_DLA.qld
130723_DLA_mix_spices.pdf
Matrices
apparentées
11/02/14
of 15
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C O D A - C E R V AA-TERVUREN
Annexe 4 : Liste des fiches ‘ValMethTerv’ ayant servis aux calculs.
Matrice
Mycotoxine
Fiche
Piment
AFB1
ValMethTerv_v1-711 CHILI AFB1.xlsx
AFB2
ValMethTerv_v1-711 CHILI AFB2.xlsx
AFG1
ValMethTerv_v1-711 CHILI AFG1.xlsx
AFG2
ValMethTerv_v1-711 CHILI AFG2.xlsx
OTA
ValMethTerv_v1-711 CHILI OTA.xlsx
AFB1
ValMethTerv_v1-711 PEPPER AFB1.xlsx
AFB2
ValMethTerv_v1-711 PEPPER AFB2.xlsx
AFG1
ValMethTerv_v1-711 PEPPER AFG1.xlsx
AFG2
ValMethTerv_v1-711 PEPPER AFG2.xlsx
OTA
ValMethTerv_v1-711 PEPPER OTA.xlsx
AFB1
ValMethTerv_v1-711 CACAO AFB1.xlsx
AFB2
ValMethTerv_v1-711 CACAO AFB2.xlsx
AFG1
ValMethTerv_v1-711 CACAO AFG1.xlsx
AFG2
ValMethTerv_v1-711 CACAO AFG2.xlsx
OTA
ValMethTerv_v1-711 CACAO OTA.xlsx
Poivre
Cacao
11/02/14
of 15
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