スライドタイプ

３年後期
分子生物学
第9回
H28.11.28 高露
中間試験の点数について
前期の中間試験（25点満点）、定期試験（25点満
点）、後期（25点満点）の中間試験の合計点（75点
満点）を記載しています。
遺伝子の機能解析法
講義内容のポイント
・遺伝子多型の検出
ハプロタイプとは
SNPに適した検出法（3種類）
マイクロサテライト多型の検出
・DNAの塩基配列の解析法
マクサム・ギルバート法
サンガー法
次世代シークエンサー
教科書p133〜
遺伝子多型の検出
ヒトゲノムの塩基配列は、各人で約0.1%の違いがある。
多様性を生じる
（特定の病気や病気の素因、薬剤の感受性のと関連する）
ヒトの染色体は、親から子へ遺伝するときSNPを含めてある特定の遺伝
子の組み合わせ（ハプロタイプ）は大きな塊として遺伝する
近隣のSNPは一連のセットで遺伝するため、その組みわせを調べることは疾患の
原因遺伝子の特定につながる
遺伝子多型の検出
ハプロタイプマップを利用して特定の疾患の原因遺伝子をクローニングする。
SNP1(C/T)およびSNP2(T/C)は、健常人、患者ともに認められる。
SNP3-SNP4の組み合わせがA-Gは患者にしか認められない。
この場合は、AとGのSNP変異により、この遺伝子の機能が失われ、発症したと予想され
る。
サザンブロット法（RFLPの検出）
RFLPの検出（restriction fragment length polymorphism)
RFLP:SNPが制限酵素の認識DNA配列上に生じ、制限酵素認識配列が新た
に生じたり、あるいは消失することで制限酵素処理でDNA断片の長さが変化
する。
サザンブロット法
①制限酵素でDNAを断片化す
る。
②アガロースゲル電気泳動で
DNA断片を大きさにより分離す
る。
③分離したDNA断片を変性させ、
ニトロセルロース膜へ移しとる。
④標識したDNAプローブとハイ
ブリダイゼーションさせる。
⑤オートラジオグラフィーで検
出させる。
RFLP以外のSNPの検出
・ほとんどのSNPは、制限酵素の切断部位とは無関係に生じることが多い。
・SNPは相同染色体の両方（父・母）で調べる。SNPは下記の3パターンが存在す
る。
パターン1
C/C
パターン2
C/T
パターン3
T/T
C
G
C
G
C
G
T
A
T
A
T
A
父由来
母由来
父由来
母由来
父由来
母由来
タックマンPCR法
SNPに対応するプローブを２種類用意する
蛍光2
蛍光1
蛍光2
蛍光1
蛍光2
蛍光1
蛍光2
蛍光1
蛍光1
赤のみ検出されればC/C 赤と青が検出されればC/T 青のみ検出されればT/T
リアルタイムPCR法による定量
・タックマンプローブ法
配列特異的な1つのプローブを使って増幅するPCR産物量を測定する方法。
Q:消光物質
プライマー
Q
R
R:蛍光物質
Q
R
DNAポリメラーゼ
R
R
Q
Q
タックマンPCR法以外の検出
・DNAチップ
断片化したDNAとチップ上のオリゴヌクレオチドを反応させる。SNP部位には、
蛍光色素で標識した塩基を反応させる。
・DNAシークエンス
ゲノムDNAから目的遺伝子の領域をPCRで増幅を行い、DNAシークエンス
解析から得られた塩基配列を比較することでSNPを特定する方法
マイクロサテライト多型の検出
SNP以外の染色体DNAに見られる差異として、反復配列の反復回数の差がある。
マイクロサテライトDNA領域をPCRにて増幅後、電気泳動で検出することで比較で
きる。
DNAの塩基配列の解析法
マクサム・ギルバート法（化学法）
サンガー法（酵素法）
マクサム・ギルバート法
①一本鎖DNAの末端を32Pで標識し、
4種の塩基特異的な化学反応で限定
的に分解する（右図）
例：グアニンで分解する場合
ジメチル硫酸ナトリウムにより塩基のメチル化が生
じる。アルカリ条件下で加水分解すると切断される。
5’-ATCGATTCTCGG-3’
3’-TAGCTAAGAGCC-5’
②分解物をポリアクリルアミドゲル電
気泳動で分離する。
③オートラジオグラフィーで解析する。
サンガー法
①解析対象の一本鎖DNAの3’末端
に結合するプライマーを32Pで標識し、
DNA合成反応を行う。
その際、dNTP以外に、2’,3’ージデ
オキシリボヌクレオチド三リン酸を加
える。
②サンガー(Sanger)法
サンガー法
5’-GCATATTGCAGTCCA-3’
3’-CGTATAACGTCAGGT-5’
1本鎖に変性
標識したプライマー
鋳型DNA
5’-GCAT-3’
3’-CGTATAACGTCAGGT-5’
PCR反応＋ddNTP
（どれか1種類のddNTPを加えて合成反応を行う。）
ddATP
5’-GCATA-3’
5’-GCATATTGCA-3’
5’-GCATATTGCAGTCCA-3’
ddGTP
5’-GCATATTG-3’
5’-GCATATTGCAG-3’
ddTTP
5’-GCATAT-3’
5’-GCATATT-3’
5’-GCATATTGCAGT-3’
ddCTP
5’-GCATATTGC-3’
5’-GCATATTGCAGTC-3’
5’-GCATATTGCAGTCC-3’
4種類ddNTPの反応から得られた生成物をポリアクリルアミドゲ
ルにて電気泳動する。
サンガー法
3’
③オートラジオグラフィーで解析する。
5’-GCATATTGCAGTCCA-3’
3’-CGTATAACGTCAGGT-5’
5’
ATTGCAGTCCA・・・・
②PCR生成物をポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動で分離する。
次世代シークエンサー法
サンガー法では、１回で解析できる塩基配列数に限りがある（１−９６のDNA断片）。
解析処理能力が向上し、一度に数千万から数億の塩基配列を解析できるよ
うになる。
次世代シークエンサー法の原理（パイロシークエンシング法）
鋳型DNA断片に相補的
なDNAの合成を行う。そ
の際、生成されたピロリ
ン酸が酵素反応により
ATPを合成する。その
ATPとルシフェリンの反
応により生じる発光を検
出する方法
テーラーメイド医療（個別化医療）の発展に貢献

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