感 染 症 学雑 誌 216 第46巻 第6・号 実 験 手 技 シ リー ズ (15) 問 接血 球 凝集 反 応 の手 技 赤 痢へ の応用 例 国立公衆衛 生院 衛生微生物学部 中 間 接 血 球 凝 集 反 応(hemagglutinationtest,HAと 谷 略) は,菌 体 抗 原 を 赤 血 球 表 面 に 吸 着(感 作)し た ものを 菌 体 の代 わ りに 抗 原 と して 用 い る凝 集 反 応 で,赤 痢 菌1)-5) や 大 腸 菌6)7)に対 す る抗 体価 を測 定 す る の に使 わ れ る. HAは 菌 体 凝 集 反 応(ウ て,(i)鋭 敏(ii)迅 ィ ダ ール 反 応 な ど)に 速,(iii)判 定 が容 易,(iv) 感 作 用 抗 原 の 長期 保存 が可 能,(v)多 能,(vi)抑 比 べ 価 抗 原 の作 成 可 制 試 験 で 微 量 抗 原 の検 出 可 能 な どの 特 徴 が あ る.し か しそ の反 面,(i)特 異 性 は 同 じ,(ii)感 作 血 球 の調 整 が や や 煩 雑 で,テ ス トご とに 新 し く作 る 必 要 が あ る.(iii)鋭 敏 す ぎて 結 果 の意 義 づ け がむ ず か 林 太 郎 b. 1. 培 地 と培 養 法 ト リプ チ ケ ー ス ・ソイ寒 天(BBL)に ン(特 級)を5%に 加 え た培 地(斜 面 ま た は平 板)に 菌 を 接 種 し,ジ ャ ーの 中 に 入 れ て ロー ソ ク培 養 に よ り5% CO2下 2. で37℃,18∼24時 また は,1と 間培 養 す る. 同 じ 培 地 を 用 い,30℃ これ らの方 法 を 用 い れ ば 活 性 のあ る多 糖 類 抗 原 が 多 量 得 られ る. c. 抗 原 を抽 出す るた め の菌 の培 養 1. b-1の 培 地 の 入 つ た2∼3本 株 か ら 菌 を 移植 し,b。1ま る. で 培 養 す る. 個 々 の症 例 の感 染 菌 の血 清 学 的 診 断 や 血 清 疫 学 的 調査 研 究 に利 用 で き る.な お マ イ ク ロ タ ィ タ ー法 で の で好気的 に 18∼24時 間培 養 す る. しい 場 合 もあ る な ど,欠 点 とは い え な い ま で も短 所 が あ HAは グ リセ リ 2. の中試験管斜面 に原 た はb-2の いず れ か の 条 件 15枚 の 平板 培 地 に,斜 面 の菌 を綿 棒 な どで濃 厚 に 塗 布 し,1と 同 じ条 件 で24時 間 培 養 す る. 実 施 も可 能 で あ る か ら,将 来 は 自動 化 も期 待 で き る.こ B. 抗 原 分 画 の作 成 こで は 代 表 的 応 用 例 と して,赤 痢 菌に 対 す る抗 体 検 出 の a. 集菌 た め のHAの 1平 板 あた り2.5mlの 滅 菌 生 理 食 塩 液 を 加 え,菌 を コ 手 技 を説 明す る.も ち ろ ん他 の細 菌 感 染 症 ン ラー ジ棒 で 懸濁 させ,駒 込 ピペ ッ トで100∼150mlの に つ い て は,多 少 の 修 正 も必 要 で あ ろ う. I. 血 球 に 感作 す る抗 原 の 作 成 三 角 フ ラス コに 集 め る.全 量 約35mlの 菌 液 と な る. A. 菌 の培 養 b. 菌 液 に 等 量 の0.1NNaOHを a. 菌 株 は 患 者 か らの 新 鮮 分 離株 の 中 か ら選 ぶ か,保 c. これ を 蒸 し器 ま た は常 圧 下 の オ ー トク レー プ で, 100QC,70分 存 株 な らば ス ム ー・ズ形 の菌 株 を 選 ん で 用 い る. 1. ソ ンネ菌,ソ ンネ 菌 は か な らず1相 菌 を 用 い る. 1相 菌 を選 択 す る に は まず,SS寒 ス ム ー ズ形 集 落 を 数 コ選 び,そ 天 平 板 に 菌 を培 養 し, れ らをA-bに 示 す 方法 d. 間 加 熱 す る. 乳 白色 に な つ た 液 を 冷 却 後,1NHCIでpH7.0 に 修 正 す る. e. セ ロ フ ァ ンチ ュ ー ブに 液 を 入 れ,精 製 水 に 対 し, で寒 天斜 面 に培 養 す る.こ れ ら の培 養 菌 株 の 中 か ら,ソ 24時 間氷 室 内で 透 析 す る.こ ンネ菌1相 抗 原 血 清 に強 く凝 集 し,500倍 る. ア ク リフ ラ ビ ン溶 液 に凝 集 しな い も のを 選 定 し,原 株 とす る. 2. フ レキ シ ネ ル菌 お よび そ の他 の菌,ス ム ーズ 形 集 加 え る. の 間数回精製水を交換 す f. 透 析 内液 を遠 心 管 に 移 し,高 rpm30分 速 遠 心 器 で8,000 間 遠 心 し,上 清 を 集 め る.通 常 の遠 心 器 な らば 落 を 作 り,そ れ ぞ れ の 菌 に対 す る 因子 血 清 に 強 く凝 集 3,000∼4,000rpmで30分 し,500倍 障 の な い 程 度 の 上 清 が得 られれ ば よい. ぶ. ア ク リフ ラ ビ ン溶 液 に 凝 集 しな い もの を 選 9. 間 遠 心 し,次 の操 作 の ろ過 に 支 上 清 を0.45μ の メ ンブ ラ ソ フィ ル タ ー 〔HA(日 昭 和47年6月20日 本 ミ リ ポ ア,リ 217 ミ テ ッ ド)〕 を 用 い て ろ 過 す る.こ の操 h.後 述IVの C. 方 法 で こ の 抗 原 分 画 を ,標 凍 結 保 存 す る.も リー ザ ー で し凍 結 乾 燥 が で き れ ば,標 重 量 単 位 で の 換 算 が 可 能 で あ る.い 準化の際に ずれの方法で保存 し 期 間 安 定 で あ る. (注)用 長 さ14cmの B-cの 乳 白 色 液1.Omlを こ の カ ラ ム に 通 す .こ らか じめ10倍 リ ス 緩 衝 食 塩 液,H-A-a参 ら,全 量 約8mlの 照)を1.Oml入 れ た メス フ つ の 精 製 水 を カ ラ ムに 注 入 しな が 精 製 水 を 通 し,抗 原を十分に洗浄流 後 に メ ス フ ラ ス コ の 目 盛 りの10mlに 達す る ま で 正 確 に 水 を 加 え る. 5. に 希 釈 され た も の で あ る. 使 用す る血 液 a. 血 液 銀 行 か ら で き る だ け 新 鮮 な0型(な の 保 存 ヒ ト血 液 を 購 入 し て 用 い る.こ ク エ ン 酸 ナ ト リ ウ ム0.89,塩 た つ て か ら,一 応 試 験 採 血 し 分 に 高 い値 に達 して い た ら全 採 血 して,血 清 を 分 離 保 存 す る.菌 種 に よ り注 射量 や 間 隔,回 数 を 加 減 す る こ と も必要 で あ る. 菌 体 凝 集反 応 に よる凝 集素 価 の測 定 免 疫 注 射 に 用 い た の と同 じ菌 液 を抗 原 と し,試 採 血 清 C. を加えて 球 を 洗 浄 す る.こ イ ド菌 に 対 す る免 疫 血 清 で は 高 く, 位 の 力価 が 得 られ る.こ れ に 対 し,ソ ンネ菌 や 志 賀 菌 に 対 して は2,560倍 程 度 の もの し か 得 られ な い こ とが 多 い.そ れ で も菌 体 凝 集 素 価 に 比 較 す る と,一 部 の菌 型(た IV. とえば フ レキ シ ネル 菌3型)を の高 値 を 示 す のが 通 常 で あ る. 感作用抗原の標準化 Iで 作 成 した抗 原 を赤 血 球 に 感 作 す る際 の最 適 量 を 決 光 純 薬)6.059,0.2MHC1210 製水 に 溶 か す. 血 球 沈 査 を 正 確 に 一 定 量 は か り,こ 以 上 あ れ ば 対 照 血 清 と して 使 用 して よい.凝 集 素 価 は 菌 の血 清 型 に よつ て 異 な るが, 除 い て は,2∼16倍 6H200.19,CaCl2・2H200.029,tris(hydroxymeth- な る よ うに,精 加 方 法 で 測 定す る. 凝集素価 容 易 に5,120∼10,240倍 のTBSを く りか え す.TBS〔Tris(hydroxymethyl) に 入 れ て10%(V/V)の D. フ レキ シ ネル 菌,ボ 定 化 さ せ る. aminomethanebuEeredsaline:NaCl7.59,MgCl2・ ml〕 を 全 量1,000m1に い ずれで も 血 球 凝 集 反 応 に よ る凝 集 素価 の測 定 血 球 凝 集 素 価 が2,560倍 の 血 液 に3容 希 釈 血 清0.2ml) 釈 血 清0.5mI)の Bで 用 い た 血 清 に つ い て,IVの 室 に 保 存 す れ ば 約1 間 遠 心 し,血 yl)-aminomethane(和 原0.5ml+希 果 は 肉眼 で 読 み取 る.- 球 が 使 え る. 試 験 の 直 前 に,1容 え,1,800rpmで3分 b.aの て 凝 集 素 価 を 測 定 し,十 の保存血 血 球 浮 遊 液 の作 成 の 操 作 を3回 次 第 に 増 量 しな が ら静脈 内 に注 射 す よい が,反 応 は50℃ の水 浴 中 で1夜 静 置 して行 な い,結 ド ウ糖2.059, 自 家 製 の 血 液 を 使 う と き は,Alsever液 数 日 間 氷 室 中 に 保 存 し て,安 a. のわ りで,0.5ml,1.0ml,2.0ml, 4.0ml,4.0mlと る べ くな 化 ナ ト リ ウ ム0.429,精 加 え られ て い て,氷 月 間 は 溶 血 が 起 ら ず,血 B. 4日 ご とに 週2回 また は(抗 は 通 常 新 鮮 な 血 液 に 等 量 のAlsever液(ブ b. ルマリ ン加 生 理 食 塩 液 に 赤 痢 菌 を 約109/ml〔O.D.(650mμ)= 測 定 す る.反 応 液 量 は(抗 原0.2ml十 A. 製 水100ml)が ウサ ギ を 用 い る.ま ず 注 射 前 に試 疫 用 の 赤 痢 菌液 は0.3%ホ と免 疫 完 了 後 の血 清 両 方 に つ い て常 法 に よ り凝 集 素 価 を 正常人血球の調整 らRhつ 体 重2.5∼3.0kgの B. こ の 方 法 で 得 られ る 抗 原 液 は,10倍 II. 免疫法 る.最 終 注 射 か ら7∼10日 一 度 に1mlず 照)を 調 製 す る と き, 0.4∼0.45〕 に 浮遊 した もの を用 い る.こ の菌 液 を3∼ 濃 厚 なTBS(ト ラ ス コ 中 に 集 め る. 出 さ せ る.最 manerythrocytes(ASHE)〕(IV参 験 採 血 して お く.免 れ に よ つ て 荷 電 粒 子 は す べ て 除 去 され る. 4. 対 照 に用 い る ウサ ギ免 疫 血 清 の 作 成 抗 原 で 感 作 した 赤 血 球 浮 遊 液 〔antigensensitizedhu- A. 直径約 イ オ ン交 換 樹 脂 カ ラ ム を 作 る. 流 出 す る 液 を,あ III. て 使 う.市 販 の 免疫 血 清 を使 用 して も よい. の 方 法 を 行 な つ て も よ い. 1.AmberliteMB3(FisherChemicalCo.)で 3. 希釈 して 凝 集 反 応 の 対 照 抗 原 が標 準 化 され て い るか ど うか を 試 す た め の対 照 と し 具 が 備 わ つ て い る 実 験 室 で は,B-d∼B-9の 操 作 の 代 わ りに,次 2. 一 部 を さ ら にTBSで1%に に 用 い る. 5℃ 以 下 の 冷 蔵 庫 に 保 存 す る か ま た は,フ 0.9cm× 10%NHEの し,正 常 人 血 球 液(1%NHE)と 準 化 す る. 保 存 て も,長 E)・ この液 は赤 血 球 に 抗 原 を 感 作 す るの に 使 用 す る. c. 作 に よ つ て 透 明 な 液 が 得 ら れ る. れ をTBS 血 球 浮 遊 液 と す る(10%NH め る た め の操 作 で あ る.ウ サ ギ免 疫 血 清(皿)を 用いて 本 操 作 に よつ て血 球 凝 集 素 価 を 測 り,2,560∼20,480倍 の範 囲 の 値 が得 られ た時,血 球 感 作 に用 い た抗 原 液 の最 感 染 症 学 雑誌 218 高 希 釈 倍 数 の 希 釈抗 原液 を実 際 に使 用 す る. 抗原感作 a. 抗 原 希 釈TBSで1:5,10,20,40,80の5 h. 0.5mlの10%NHEを 小 試 験 管 に 取 り,こ れ に 各 混 合 液 を よ く振 りまぜ,37℃ の 水 浴 中 で2時 間保 d. TBSで3回 e. この よ うに して抗 原 で 感作 し た人 赤 血 球(ASH 洗 浄す る. 沈 査 に5.0mlのTBSを 加 え,1%ASHEと 試験 の実施 9本 の小 試 験 管 を1列 に 立 て る. b. 別 の小 試 験 管 を 用 い て ウサ ギ 免疫 血 清 を56℃,30 分 間非 働 化 し,TBSで1:40に うす め る(血 清0.1ml (ii) TBS十1%NHE (iii) TBS十ASHE 釈 血 清4.0ml). 第2管 以 下 の8本 の 小試 験 管 に2.0mlのTBSを に 作 つ た1:40希 釈 血 清 を 第2管 に 加 え る. e. 以 下倍 数 希 釈 液 を第9管 f. 各抗 原 希 釈液 ご とに9本 の小 試 験 管 列 を 作 る.合 まで 作 る. k. 反 応 が 終 つ た ら静 か に試 験 管 台を 取 り出 し,凝 集 状 態 を 観 察 記 録 す る.+,-の 判 定 規 準 はV-Eを 参照 以上 の方 法 で 実 施 した 例 を 表1に 示 す. 反応 の実 施 方法 A. 正常 人血 球(NHE)の a. 各 検 査 血 清 ご とに 対 照 と して1%NHE0.2mlを 1:4希 b. 釈 血 清0.2mlに 準 備 と使 用 加 え る. 同 様 にTBS0.2mlに1%NHE0.2mlを 加え 対 照 とす る.こ れ は 検 査 血 清 の 数 に 関 係 な く,同 じ血 球 とな る. つ を5組 の それ ぞれ の試 験 管 表1. *こ 自発 凝 集 を 起 さな い こ とを 確 め る 対 照 で あ る. V. 各 希 釈 血 清0.2mlず 血 清 に ヒ ト血 球 凝 集 素 が な い こ とを確 め る対 す る. 加 え る. 9. つ 加 え て 対 照 とす る., 釈 血 清 十1%NHE で2時 間 保 温 す る 。 a. 計5組 1:40希 た は, j. 試 験 管 台 ご と よ く振 と うした の ち,37℃ の 水 浴 中 清 浄 な もの を 用 い る. 第1管 と同 じ も 注 し,他 の2管 に はTBSを0.2mlず 照,(ii),(iii)は 本 反 応 に 使 用す る 小試 験 管 は,他 の血 清 反 応 と同 様 に d. 釈 血 清(上 記 血 清 希 釈 列 の 第1管 (i)は +TBS3.9ml=1:40希 つ 全 部 の試 験 管 に加 え る. つ 分 注す る.こ れ らに は 次 の よ うに1%NHEま (i) す る. c. には1:40希 ASHEをO.2m1ず 温 す る.そ の 間,と き どき振 りまぜ る. B. ASHEを0.2mlず の)を0.2m1分 抗 原 希 釈 液 を0.5m至 加 え る. E)の まで の血 清希 釈 列 が5組 i . 別 に3本 の 小 試 験管 を 用意 す る.そ の うち の1管 段 階 の 希釈 液 を作 る. c. か ら第9管 第6号 で き あ が る. A. b. に 分 注 す る.第1管 第46巻 の 例 で は 抗 原 希 釈 に1:10が フ レ キ シ ネ ル 菌2aの 最 適 量 で あ る.1:5希 液 を用 い る検 査 ごと に1管 行 なえ ば よい. 感 作 用 抗 原 の 標 準 化(例) 釈 抗 原 の 方 が こ れ よ り高 い 値 を 示 し て い る が, 凝 集 素 価 が 高 い と き は あ ま り濃 い 抗 原 を 使 用 し な い 方 が よ い.血 球 が 溶 血 し や す くな つ た りす る. 昭 和47年6月20日 219 表2. c. ASHEを フ レキ シ ネル菌2a感 染 患 者 血 清 の間 接 血 球 凝 集 反 応 に よ る凝 集 素 価測 定 例 作 成 す るの に 必 要 な10%NHEの 量に つ い て は次 項Bを 参 照 して 決 め る.最 少 必 要 量 の30∼50 B. ASHEの 準備 と使 用 a. 各 検 査 血 清 あ た り全 量 と して1.8mlのASHEが c. IVで あ らか じめ 決 め た,最 適 希 釈倍 数 に従 つ て う c. 所 要 量 の10%NHEと 等 量 の 抗 原液 を混 合 す る. d. 混 合 液 を37℃,2時 間 水 浴 中 に 保 温 し,そ の 間 と 血球を洗浄す る.最 後 の 遠 心 で沈 殿 した血 球 を メス ピペ ッ トで 正 確 に a. 検 査 血 清0,15mlを 希 釈 す る. 小 試 験 管 に と り,56℃ 釈 つ て 第2管 で30分 を1列 お 別 の1本 釈 血 清(第1管)の に 加 え,他 注 し て お く(V-A-aに ま で す ん だ ら,余 e. に 並 べ,TBSを0.2mlず に はASHEの 対照 用として 分 注 し て お く. 1:4希 9管 き どき振 りまぜ る. 検査血清の希釈 TBSO.2mlを d. す め た 抗 原 液 を 所 要 量 準 備 す る. C. 清0.15ml+T8SO.45m1=1:4希 小 試 験 管8本 つ 分 注 す る.な 混 合 した もの1管 を 作 り,対 照 とす る. な る よ うにTBSで え て1:4 血 清0.6ml). 必 要 で あ る.ほ か に 検 査 ご とに0.2mlをTBS0.2mlと 測 りと り,1%に 希 釈 す る. 非 働 化 が す ん だ らTBSを0.45ml加 に 希 釈 す る(血 e. 抗 原 感作 が 終 つ た ら,TBSで3回 時 に 対 照 と して 使 うウサ ギ 免 疫血 清 を 非 働 化 し,1:40に b. %位 多 い 目に準 備 す る. b. 間 非 働 化 す る.同 の0.2m1を う ち か ら0.2mlを と 別 の対 照 用 試験 管 に分 使 用 す る).以 下 倍 数 希 釈 し て,第 分 な0.2mlを 捨 て る. ウ サ ギ 免 疫 血 清 に つ い て もIVの 方 法 で1列 の希 釈 列 を 作 る. D. 血 球 の添 加 と保 温 a. ASHEを0.2mlず 第9管 ま で に 加 え る.ま つ,血 たTBSを 清 希 釈 列 の 第1管 か ら 分 注 した 対 照 管 の う 220 感染 症 学雑 誌 ち の1管 に も,0.2ml加 b. 1%NHEを TBSを c. c. え る. 別 に用 意 した1:4希 釈 血 清 お よび 含 む 試験 管 の それ ぞれ に,0.2m1ず 検 査 血 清,対 照 血 清,お つ 加 え る. よび対 照 試 験 管 に所 定 の 血 球 液 を 加 え 終 つ た ら,試 験 管 台 ご と よ く振 りまぜ,37 E. HA試 a. 反 応 が 終 つ た ら,静 験 の判 定 とき は,管 底 の 中心 に 日の丸 の旗 の る.軽 く振 つ て み る と,反 応 前 の血 球 液 と同 様 に な る. 対 照 試 験 管 で は す べ て この 像 を 呈 す るは ず で あ る.ま た 陰 性 血 清 で は,第1管 か ら第9管 まで 同 一 の 像 を 呈 す る. 非 凝 集 血 球 の 一 部 がcの よ うに 管 底 中 心 に た ま り,そ の上 部 周 辺 に凝 集 した 血 球 の薄 い 環 状 帯 が み られ か に 台 を 水 浴 中 よ り取 り出 す.判 定 に適 当 な 明 る さ の電 燈 を 準 備 して お く. b. 各管 の反 応 の陽 性,陰 性 は血 球 が 管 底 に 作 るパ タ る とき は,(±)と 判 定 す る.こ れ は 陰 性 とみ な し,陽 性 管 に 数 え な い. 患 者 血 清 に つ い て の 例 を,表2に ー ンに よつ て 判定 す る.そ の た めに は下 か ら管 底 を 見 る か,ま た は 凹 面 鏡 に写 して読 み取 る.す べ て の感 作 血 球 が 完 全 凝 集 を示 した もの の み を(+)と 判 定 す る. 完 全 凝 集 のパ タ ー ンに も次 の よ うな い くつ か の像 が あ るが,す べ て(+)と 1. 記 録 す る. 血 球 が 管 底 の曲 面 部 全 体 に 一様 に 広 が っ て 薄 い膜 状 に 附 着 し,そ の上 縁 が 不 ぞ ろ い に なつ て い る. 2. 凝 集 が 強 い 場 合 は,血 球 の膜 が 折 り重 な つ た よ う に な る. 3. ザ ラザ ラ した感 じの膜 の塊 りの よ うに 見 え る完 全 な凝 集 塊が,管 底 に沈 ん で い る. 以 上 の パ タ ー ソは いず れ も完 全 凝 集 した 場 合 で あ る が,確 第6号 赤 い 円 形 部 の よ うに,凝 集 して い な い血 球 が沈 殿 して い d. ℃ の水 浴 中 で2時 間 反 応 させ る. 陰 性(-)の 第46巻 め る 意 味 で 試 験 管 を軽 くた た くか,振 るか して み る と(丁 度 サ ル モ ネ ラのH凝 集 反 応 を み る と きの よ う に),凝 集 の 状 態 が よ くわ か る. 文 献 1) Chun, D. and Park, B.: 82, 1956. 2) 中 谷 林 太 郎: 3) Yamada, C.: 77, 1960. 4) 宮 田 義 人, 山 茂 彦: 示 す. 日 細 菌 誌, J. Infect. Dis., 98: 12: 35, 1957. Japan. J. Med. Sci. Biol., 13: 北 浦 敏 行, 日 伝 染 会 誌, 平 方 達 二, 43: 中村 稔, 杉 217, 1969. 5) Takasaka, M., Honjo, S., Imaizumi, K., Ogawa, H., Nakaya, R., Nakamura, A. and Mise, K.: Japan. J. Med. Sci. Biol., 22: 389, 1969. 6) Young, V.M., Sochard, M.R., and Gillem, H.C.: Proc. Soc. Exp. Biol. and Med., 105: 635, 1960. 7) Young, V.M., Sochard, M.R., and Gillem, H.C.: Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 105: 638, 1960.
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