Testvorschrift

TECO®
Proinsulin
Human Intakt Proinsulin
ELISA
Testanleitung
Deutsch
Katalog No. TE1012
© 11/2016 | TECOmedical Group, Switzerland
TECO® human Intakt Proinsulin ELISA-Kit
Der Kit enthält folgende Reagenzien und Materialien:
Symbol Bezeichnung Intakt Proinsulin Antikörper-beschichtete Mikrotiterplatte
12 Streifen à 8 Kavitäten (insgesamt 96, einzeln brechbar)
in einem Rahmen, gebrauchsfertig
Format
1 Platte
Blockierungspuffer
gebrauchsfertig
1 x 1,5 ml
Antikörper-HRP-Konjugat
gebrauchsfertig
1 x 11 ml
TMB Substrat
gebrauchsfertig
2 x 15 ml
Waschlösung
10 fach konzentriert
1 x 40 ml
Stopplösung – 0,5 M H2SO4
0,5 M Schwefelsäure, gebrauchsfertig
1 x 15 ml
Standard A
0 pmol/L, lyophilisiert
2 x 3,0 ml
Standard B
lyophilisiert, Konzentration siehe Datenblatt
1 x 1,0 ml
Standard C
lyophilisiert, Konzentration siehe Datenblatt
1 x 1,0 ml
Standard D
lyophilisiert, Konzentration siehe Datenblatt
1 x 1,0 ml
Standard E
lyophilisiert, Konzentration siehe Datenblatt
1 x 1,0 ml
Standard F
lyophilisiert, Konzentration siehe Datenblatt
1 x 1,0 ml
Kontrolle 1
lyophilisiert, Sollwert siehe Datenblatt
1 x 1,0 ml
Kontrolle 2
lyophilisiert, Sollwert siehe Datenblatt
1 x 1,0 ml
Testanleitung
1 Stück
3
Lagerung
Den Kit bei 2-8°C aufbewahren. Nicht einfrieren. Nicht verwendete Reagenzien bei 2–8 °C
aufbewahren.
Verwendungszweck
Der TECO® human Intakt Proinsulin ELISA Kit ist ein „two-site“ sandwich enzyme-linked immunosorbent in-vitro Test für die quantitative Bestimmung von intaktem Proinsulin in humanem
Plasma und Serum.
Klinische Bedeutung
Proinsulin wird in den ß-Zellen der Bauchspeicheldrüse hergestellt und anschließend in Insulin
und C-Peptid gespalten. Bei gesunden Menschen werden im Plasma nur geringe Konzentrationen an intaktem Proinsulin gefunden. Bei Patienten mit Typ-2-Diabetes mellitus und einer
ausgeprägten Insulinresistenz kommt es jedoch durch den gestiegenen Insulinbedarf zu einer
erhöhten Ausschüttung von intaktem Proinsulin, welches relativ schnell abgebaut wird. Intaktes
Proinsulin wird aufgrund einer Vielzahl von verschiedenen Studien und Publikationen als ein
unabhängiger kardiovaskulärer Risikofaktor angesehen. Sowohl das intakte Molekül, als auch
dessen Abbauprodukte hemmen die Fibrinolyse durch Stimulation des Plasminogen-AktivatorInhibitors (PAI-1).
Nüchternwerte von intaktem Proinsulin können in der klinischen Praxis als hochspezifischer
Marker einer klinisch relevanten Insulinresistenz eingesetzt werden. Intaktes Proinsulin ist hilfreich bei der Auswahl einer geeigneten Therapie gegen die Insulinresistenz und als Verlaufsparameter zur Kontrolle der Therapieeffekte auf die Sekretionsstörung der ß-Zellen.
Werden erhöhte Nüchternspiegel an intaktem Proinsulin bei Patienten mit Typ-2-Diabetes
mellitus festgestellt, können diese als insulinresistente Patienten eingestuft und entsprechend
therapiert werden, um das Risiko kardiovaskulärer Folgeschäden zu reduzieren.
Erhöhte Nüchternwerte an intaktem Proinsulin können auch bei Patienten mit einem Insulinom
auftreten. Hierbei handelt es sich um einen gutartigen Tumor des Pankreas, der eine pathologisch erhöhte Ausschüttung an Insulin verursacht.
4
Literatur
1
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Proinsulin is an independent predictor
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decreased acute insulin response
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3
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Diab Technol Ther 6: 405-412, 2004.
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Intact and total proinsulin: new aspects for diagnosis and treatment of type-2diabetes.
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Fasting intact proinsulin is a highly
specific indicator of insulin resistance
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10Langenfeld M, Forst T, Standl E,
Strotmann HJ, Luebben G, Pahler S,
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IRIS II Study: Sensitivity and Specificity
of Intact Proinsulin, Adiponectin and
the Proinsulin/Adiponectin Ratio as
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Diab. Technol. Ther. 6 (2004) 836-843
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proinsulin.
Clinical Chemistry 44: 7, 1514-1519, 1998.
5
Testprinzip
Der TECO® human Intakt Proinsulin ELISA Kit ist ein sensitiver „two-site“ sandwich enzymelinked immunosorbent assay. Die Mikrotiterplatte ist mit einem monoklonalen Antikörper, spezifisch für die C-Peptid/Insulin A Kettenbindung beschichtet. Dieser Antikörper bindet die intakt
Proinsulin Epitope: des-(31,32)-Proinsulin und split-(32,33)-Proinsulin, nicht aber Insulin, CPeptid oder andere „des“- und „split“-Formen.
Im ersten Schritt werden die Patientenproben mit einer Blockierungspufferlösung inkubiert.
Die Kavitäten werden danach gewaschen um Serum-/Plasmakomponenten zu entfernen. Im
zweiten Inkubationsschritt wird ein enzymmarkierter monoklonaler Proinsulin-Antikörper zugegeben. Dieser Antikörper ist spezifisch für die Insulin β /C-Peptid-Kettenbindung.
Der Antikörper bindet die intakt Proinsulin Epitope: des-(64,65)-Proinsulin und split-(65,66)Proinsulin, nicht aber Insulin, C-Peptide oder andere „des“-und „split“-Formen. Durch die Kombination der beiden monoklonalen Antikörper wird nur intaktes humanes Proinsulin gemessen.
Nicht gebundene enzymmarkierte Proinsulinantikörper werden ausgewaschen und die verbleibende Enzymaktivität nach der Zugabe von TMB gemessen. Die Intensität der Farbentwicklung
ist proportional zur Konzentration des Proinsulins in der Patientenprobe.
Nicht mitgelieferte, benötigte Materialien
• Pipetten für 50 µl, 100 µl, 150 µl und 300 µl
• Messbehälter für die Rekonstitution oder Verdünnung von Reagenzien
• Absaugvorrichtung und Multi-Kanal-Pipette oder automatische
• Waschvorrichtung für ELISA Platten
• Aqua dest
• Vortexmischer
• ELISA-Plattenlesegerät (geeignet für 96-Well-Formate und Messungen
• bei 450 und 405 nm, mit 590-650 nm als Referenzwellenlänge)
• ELISA-Plattenschüttler (400 rpm) (Orbitalschüttler)
• Software für die Auswertung der Ergebnisse
6
Warnhinweise und Vorsichtsmaßnahmen
Dieser Kit ist nur für die in-vitro-Diagnostik geeignet und sollte nur von Fachpersonal durchgeführt werden.
Die Anweisungen sorgfältig befolgen.
Die Verfallsdaten auf den Etiketten und die spezifische Stabilität der rekonstituierten Reagenzien beachten. Weitere ausführlichere Informationen zur Sicherheit befinden sich im „Materials
Safety Data Sheet“.
Material menschlichen Ursprungs, das für die Herstellung des Kits verwendet wurde, wurde
getestet und zeigte keine Reaktion auf HIV1 und 2 sowie HCV-Antikörper und HbsAg. Die
Kitbestandteile sollten dennoch so gehandhabt werden, als seien sie zur Übertragung eines
Infektionserregers fähig.
TECOmedical AG kann nicht für einen eventuellen Verlust oder Schaden haftbar gemacht werden, der durch Nichtbeachtung der Testanleitung entsteht.
1. Verwendungszweck: zur in-vitro Diagnostik.
2.Alle Proben als potenziell gefährliches biologisches Material behandeln. Beim Arbeiten mit
diesem Kit und den Proben allgemein gültige Vorsichtsmaßnahmen befolgen.
3.Behälter und ungenutzte Inhaltsstoffe gemäß den Anforderungen bundesweit, landesweit
und örtlich geltender Bestimmungen entsorgen.
4.Die mitgelieferten Reagenzien als eine zusammengehörende Einheit vor dem auf der Verpackung angegebenen Verfallsdatum verwenden.
5.Die Reagenzien des Assays wie angegeben lagern.
6.Die beschichteten Teststreifen nicht verwenden, wenn der Beutel beschädigt ist.
7. Jede Probe als Duplikat testen.
8.Für ein zügiges und effizientes Dosieren von Flüssigkeiten wird der Gebrauch von Mehrkanalpipetten empfohlen.
9.a) 0,5 M Schwefelsäure ist ätzend und kann zu Verbrennungen führen.
b) TMB und Blockierungspuffer vorsichtig handhaben.
Nicht einnehmen. Berührung mit Haut, Augen und Kleidung vermeiden. Bei Berührung mit
Wasser abwaschen. Bei Einnahme einen Arzt konsultieren.
10.Natriumazid wird als Konservierungsstoff verwendet. Der unbeabsichtigte Kontakt mit Pufferlösungen, die Natriumazid enthalten, bzw. deren Einnahme, kann zu Reizungen der Haut,
der Augen oder des Mundes führen. Natriumazid kann in Abflussrohrleitungen aus Blei,
Kupfer oder Messing explosive Metallazide bilden. Zum Beseitigen der Reagenzien mit viel
Wasser nachspülen um Ansammlungen von Aziden zu vermeiden.
7
09/
296
Antikörper-HRP-Konjugat
1 Fläschchen (11 ml) mit humanem Proinsulinantikörper gebunden an Meerrettichperoxidase (HRP). Gebrauchsfertig. Konservierungsmittel: Neomycin und Merthiolat. Lagerung
bei 2–8 °C bis zum Verfallsdatum.
TMB Substrat
2 Fläschchen (15 ml) Tetramethylbenzidin in Citrat-Phosphatpuffer und DMSO.
Gebrauchsfertig. Lagerung bei 2–8 °C bis zum Verfallsdatum.
Waschlösung
1 Fläschchen (40 ml) Puffer mit Tween 20. Konservierungsmittel: Streptomycinsulfat und
Amphotericin. Den Inhalt des Fläschchens mit Aqua dest. auf 400 ml (End-Volumen) auffüllen. Bei 4 °C bleibt die verdünnte Waschlösung 6 Monate stabil. Unverdünnt bei 2–8
°C lagern bis zum Verfallsdatum.
Stopplösung – 0,5 M H2SO4
1 Fläschchen (15 ml) 0,5 M H2SO4. Gebrauchsfertig. Lagerung bei 2–8 °C bis zum
Verfallsdatum.
Vorbereitung und Haltbarkeit der Proben
Zu beachten
Die Blutabnahme muss nüchtern erfolgen um klinische Aussagen treffen zu können.
Probenmaterial
Nüchterne Blutentnahme. Humanes Serum oder Plasma. Aufgrund besserer Stabilität werden
EDTA-Plasma und Heparin-Plasmaproben gegenüber Serumproben bevorzugt.
Plasma
Die Probenentnahme kann in HbA1C–Röhrchen erfolgen. Diese Proben sind stabil bei Raumtemperatur und sollten innerhalb von 48 Stunden zentrifugiert werden. Plasma im Assay einsetzen oder in Aliquotes bei -20 °C lagern. Intaktes Proinsulin ist bei – 20 °C mehr als 2 Jahre
stabil. Mehrmaliges Auftauen und Einfrieren ist zu vermeiden.
Serum
Vollblut innerhalb von 4 Stunden zentrifugieren. Intakt Proinsulin wird durch Proteasen in Serum
abgebaut, Serum nicht länger als 1 Tag bei 2–8 °C aufbewahren. Serum im Assay einsetzen oder
in Aliquotes bei -20 °C lagern.
Weitere Informationen zur Probenstabilität: Pfützner et al. Clinical and laboratory evaluation of
a new specific ELISA for intact proinsulin. Clin Lab 51: 243-249, 2005.
9
300µl
Ergebnisanalyse
Eine Standardkurve kann erstellt werden, indem die Standardkonzentration auf der x-Achse
(lineare Skala) gegen die Extinktion auf der y-Achse (lineare Skala) gesetzt wird. Die Konzentrationen von intaktem Proinsulin der Patientenseren können dann mit Hilfe der Standardkurve abgelesen werden. Eine 4-Parameter-Methode sollte zur automatischen Datenreduktion
verwendet werden.
Ergebnisse 450 nm
(nur Beispieldaten, nicht für die Berechnung
der tatsächlichen Ergebnisse verwenden)
Standard
Extinktion
bei 450 nm
pmol/l
A
B
C
D
E
F
L-Kontrolle 1
H-Kontrolle 2
0,017
0,232
0,709
1,296
2,776
–
0,896
1,650
0,0
4,5
12,9
25
60
117
16,8 (13,4–20,2)
32,4 (25,9–38,8)
11
Ergebnisse 405 nm
(nur Beispieldaten, nicht für die Berechnung
der tatsächlichen Ergebnisse verwenden)
Standard
Extinktion
bei 405 nm
pmol/l
A
B
C
D
E
F
L-Kontrolle 1
H-Kontrolle 2
0,017
0,085
0,233
0,416
0,997
1,985
0,290
0,540
0,0
4,5
12,9
25
60
117
16,8 (13,4–20,2)
32,4 (25,9–38,8)
Bei jedem Testansatz müssen die Sollwertvorgaben der Kontrollen innerhalb der für jede Charge
angegebenen Toleranzen liegen. Das QC-Protokoll mit den Sollwertvorgaben ist im Kit enthalten.
Wenn diese Anforderungen nicht erfüllt sind, können die Testergebnisse ungenau sein und der
Test sollte wiederholt werden.
12
Referenzwerte
Der angegebene Normalwert für intaktes Proinsulin in EDTAPlasma wurde mit dem Human Intakt Proinsulin ELISA an einem
Kollektiv von gesunden Männern und Frauen ermittelt.
Nüchterne Probanden: ≤11 pmol/l
Mittelwert: 3.99 +/- 1.58 pmol/l (SD),
Median 3,61 pmol/l
Normalkollektiv vs. HOMA-positives Kollektiv
Kollektiv von Nicht-Diabetikern im Vergleich
zu HOMA positivem Kollektiv (HOMA-Score > 2).
Serum - EDTA Plasma
Die Regressionsanalyse für den Plasma/Serum-Vergleich:
Y (Serum-Wert) = 0,89 x X (Plasma-Wert) r = 0,99 (n = 20)
13
Intact Proinsulin – Glukose-Toleranztest
Typ 2 Diabetes ist eine komplexe Erkrankung, die in der Regel mit einer genetischdeterminierten b-Zelldysfunktion, einer (zunächst metabolischen) Insulinresistenz und einer erhöhten
hormonellen Aktivität des viszeralen Fettgewebes einhergeht. Intakt Proinsulin ist ein direkter
Biomarker für die Funktionalität der b-Zellen und ein spezifischer indirekter Marker für eine klinisch relevante Insulinresistenz, wenn die morgendlichen Nüchternwerte erhöht sind (Pfützner
et al., Diabetes Care 2004). In vielen Fällen geht eine b-Zelldysfunktion mit Erhöhung der intakten Nüchtern-Proinsulinspiegel der klinischen Manifestation des Diabetes mit Erhöhung
der Blutzuckerspiegel voraus. Im oralen Glukosetoleranztest, kann dieses Stadium der b-Zelldysfunktion durch die induzierte Belastung der ß-Zellen unter Stressbedingungen sogar noch
früher gesehen werden.
Misst man intakt Proinsulin zusammen mit den Glukosewerten nach 0 h, 1 h und 2 h ermöglichen die Ergebnisse eine Abschätzung des Schweregrades der b-Zelldysfunktion unabhängig von den beobachteten Glukosewerten und damit unabhängig von der Manifestation der
Erkrankung. Gesunde Personen zeigen zu jedem Zeitpunkt Werte < 20 pmol/L. Ein Wert >
20 pmol/L nach 1h oder 2h zeigt eine progressive funktionelle Erschöpfung der b-Zelle unter
Glukosebelastung bei Prädiabetikern und Diabetikern an. Aufgrund der multiplen Phänotypen
der Erkrankung und vor allem auch im Spätstadium der Erkrankung mit massiver Zerstörung
der b-Zellen können normale Proinsulinspiegel während des OGTT auch bei manifester Diabeteserkrankung gesehen werden.
Glukose
Glukose [mg/dL]
250
200
150
Normal
100
Prediabetes
50
Diabetes
0
0
60
120
Zeit [min]
intact proinsulin [pmol/L]
intact proinsulin
35
30
25
20
15
10
5
0
Normal
Prediabetes
Diabetes
0
60
Zeit [min]
14
120
Gesunde Probanden
Glukose
Zeit nach Glukosegabe (Minuten)
Mittelwert (mg/dL)
SD
Bereich (mg/dL)
0
93,6
7,5
81–104
60
140,2
29,4
104.4–178
120
89,7
23,9
67–140
0
3,1
1,9
0,401–7,609
60
10,3
6,8
1,958–19,68
120
10,2
5,2
4,135–17,79
0
102,0
9,3
92–122
60
168,1
56,9
74–243
120
149,4
33,8
93,6–186
0
6,6
4,1
1,82–13,65
60
22,6
8,1
10,15–39,27
120
27,8
5,9
21,23–35,90
0
121,3
19,8
97-162
60
230,4
50,8
164-320
120
212,7
34,1
181-290
0
7,74
7,2
2,47-25,14
60
27,71
5,6
5,54-39,43
120
29,28
6,5
3,94-43,81
Intaktes Proinsulin
Zeit nach Glukosegabe (Minuten)
Mittelwert (pmol/l)
SD
Bereich (pmol/l)
Prädiabetes
Glukose
Zeit nach Glukosegabe (Minuten)
Mittelwert (mg/dL)
SD
Bereich (mg/dL)
Intaktes Proinsulin
Zeit nach Glukosegabe (Minuten)
Mittelwert (pmol/l)
SD
Bereich (pmol/l)
Diabetes
Glukose
Zeit nach Glukosegabe (Minuten)
Mittelwert (mg/dL)
SD
Bereich (mg/dL)
Intaktes Proinsulin
Zeit nach Glukosegabe (Minuten)
Mittelwert (pmol/l)
SD
Bereich (pmol/l)
15
Verdünnungstest in Plasma und Serum
Serum
Probe
Verdünnungsfaktor
erwartet Ergebnis Wiederf.
pmol/l
pmol/l
(%)
Plasma
Probe
Verdünnungsfaktor
erwartet Ergebnis Wiederf.
pmol/l
pmol/l
(%)
Serum 1
1
2
4
3,98
1,99
1,00
3,98
1,93
0,99
100,00
97,00
99,50
Plasma 1
1
2
4
51,50
25,55
12,78
51,10
29,44
15,78
100,00
115,20
123,50
Serum 2
1
2
4
13,34
6,67
3,34
13,34
6,97
3,90
100,00
104,50
116,90
Plasma 2
1
2
4
54,13
27,07
13,53
54,13
29,87
15,97
100,00
110,40
118,00
Serum 3
1
2
4
3,68
1,84
0,92
3,68
1,84
0,93
100,00
100,00
101,10
Plasma 3
1
2
4
47,15
23,58
11,79
47,15
26,63
15,01
100,00
113,00
127,30
Serum 4
1
2
4
4,62
2,31
1,16
4,62
2,58
1,31
100,00
111,70
113,40
Plasma 4
1
2
4
36,85
18,43
9,21
36,85
19,64
11,37
100,00
106,60
123,40
Serum 5
1
2
4
5,01
2,51
1,25
5,01
2,52
1,45
100,00
100,60
115,80
Plasma 5
1
2
4
38,38
19,19
9,60
38,38
21,30
11,31
100,00
111,00
117,90
Interferenzen
Patientenproben können humane anti-Maus-Antikörper (HAMAs) enthalten, die zu inkorrekten
Ergebnisse führen können. Um Interferenzen durch HAMAs zu minimieren, wird im Test ein
HAMA-Blockierungspuffer verwendet. Eine unvollständige Eliminierung der HAMA Interferenz
bei allen Patientenproben kann nicht ausgeschlossen werden. Intakt Proinsulin Resultate, die
nicht mit den klinischen Diagnosen und der Patientenhistorie übereinstimmen, sollten überprüft
werden. Proben von LADA-Patienten können sehr hohe Konzentrationen an HAMAs und anderen nicht-spezifischen Antikörper enthalten.
Kreuzreaktionen
Für die genannten Konzentrationen der folgenden Peptide wurden keine Kreuzreaktionen gemessen:
Humanes Insulin
Humane C-Peptide
Proinsulin, des-(31,32)
Proinsulin, split-(32,33)
Proinsulin, des-(64,65)*
Proinsulin, split-(65,66)
< 10 000 pmol/L
50 000 pmol/L
< 200 pmol/L
5000 pmol/L
200 pmol/L
1000 pmol/L
* liegt in Serum- und Plasmaproben nicht vor
Bemerkung
Die Daten, die in dieser Anleitung aufgeführt sind, dienen nur zur Illustration. Jedes Labor sollte
eigene Normal- und pathologische Bereiche für intaktes Proinsulin gemäss GLP-Richtlinien
ermitteln und festlegen.
17
Notizen
18
Notizen
19
TECO® human Intakt Proinsulin
Testdurchführung – Kurzbeschreibung
· Proben und Reagenzien auf RT bringen. Proben durchmischen.
· Proinsulin 0-Standard : 2 Flaschen lyophil. 0-Standard mit je 3 ml Aqua dest auflösen.
·B
lockierungspuffer-Gebrauchslösung vorbereiten: 1 Teil Blockierungspuffer plus 4 Teile
0-Standard : z.B. 1,2 ml Blockierungspuffer + 4,8 ml Proinsulin 0-Standard mischen
(Aufbewahren bei -20°C)
· Waschlösung vorbereiten: 1 Flasche (40 ml) konzentrierter Waschpuffer
bis auf 400 ml
Endvolumen mit Aqua dest auffüllen.
· Lyophilisierte Standard bis und Kontrollen + mit je 1 ml Aqua dest rekonstituieren.
benötigte Teststreifen
vorbereiten
50 µl Blockierungspuffer-Gebrauchslösung in alle Kavitäten pipettieren
50 µl Standards
bis
Kontrollen
+
und Proben pipettieren
60 min bei 20–25 °C auf einem Plattenschüttler bei 400 rpm inkubieren
Absaugen und 3 x mit 300 µl Waschpuffer waschen, absaugen und auf saugfähiger
Unterlage ausklopfen
100 µl Antikörper-HRP-Konjugat
in alle Kavitäten pipettieren.
60 min bei 20–25 °C auf einem Plattenschüttler bei 400 rpm inkubieren
Absaugen und 3 x mit 300 µl Waschlösung waschen, absaugen und auf saugfähiger
Unterlage ausklopfen
150 µl TMB Substrat
in alle Kavitäten pipettieren.
15-25 min bei 20 – 25° C auf einem Plattenschüttler bei 400 rpm inkubieren
100 µl Stopplösung
in alle Kavitäten pipettieren und 5 Sekunden schütteln
Extinktion bei 450 nm bestimmen, Standard bis
Extinktion bei 405 nm bestimmen, Standard bis
(Quantifizierungssoftware, 4-Parameter:
y = (A-D)/(1+(x/C)^B)+D) Referenzwellenlänge 590–650 nm)
Bitte lesen Sie die Testanleitung bevor Sie mit der Kurzbeschreibung arbeiten.

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