蛍光分子検出のためのマイクロチャネル内 全反射照明用デバイス 立命館大学 理工学部 マイクロ機械システム工学科 講師 横川 隆司 Nam Cao Hoai Le, Dzung Viet Dao, Thien Duy Nguyen John Wells, Susumu Sugiyama Ritsumeikan Univ., Sugiyama Lab. & Yokokawa Lab. 全反射（エバネッセント）照明について • 屈折率の異なる界面で入射光を全反射させて生じる全反射 （エバネッセント）場を用いておこなう照明法 – 生体分子検出：ガラスと水溶液界面での全反射を利用 – 高SN比検出：励起深さが数100 nmのため低バックグラウンド⇔落射蛍光 c θ c = sin −1 (n1 / n2 ) λ0 2 2 2 −1 / 2 [ 染み出し深さ z p = n2 sin θ − n1 ] 4π 臨界角 励起強度 I = I 0 exp(− z / z p ) Huang et al. J. Micromech. Microeng. 15 (2005) 2235–2242 Ritsumeikan Univ., Sugiyama Lab. & Yokokawa Lab. 従来の全反射照明法 プリズム型全反射照明 対物レンズ型全反射照明 •倒立顕微鏡に後付することが容易 •低NA、低倍率の対物レンズが使用可能 •高解像度、１分子蛍光観察向き •油浸対物レンズ利用のため短WD •全反射照明のために励起レーザのアライメント が必要 •プリズム部が大きくサンプル導入部の設計自由 度が低い •レーザ光源を用いることがほとんどで高価 •オイルの自家蛍光がある プリズム型 •レーザ光のレンズ内導入、アライメントが必要 •レーザ光源を用いることがほとんどで高価 •高NAの対物レンズも非常に高価 対物レンズ型 www.olympusmicro.com Ritsumeikan Univ., Sugiyama Lab. & Yokokawa Lab. 全反射照明の応用 • ライフサイエンス分野 – 抗原抗体反応検出 – DNA検出 • 基礎理学分野 – 蛍光１分子トラッキング – 膜タンパク質トラッキング • 各種化学センサ – pH, VOC, SPR, 湿度センサなど • 流体工学分野 – マイクロチャネル壁面での流動現象の可視化 Ritsumeikan Univ., Sugiyama Lab. & Yokokawa Lab. マルチカラー全反射照明技術 • 二種類以上の励起光により同時に全反射照明を行うこと で、複数の蛍光分子を可視化する技術 – 複数の励起光を同時かつ同一場で全反射させる – 得られた複数の蛍光は光学的に分離して可視化 • 用途に合わせてカスタマイズしたマルチカラー全反射照 明システムが提案されている θ c = sin −1 (n1 / n2 ) λ z p = 0 n22 sin 2 θ − n12 4π [ ] −1 / 2 I = I 0 exp(− z / z p ) c Ritsumeikan Univ., Sugiyama Lab. & Yokokawa Lab. 対物レンズ型マルチカラー全反射照明システム（１） • • • 四波長（442, 543, 514, 633 nm）で 同時励起するシステム 倒立、油浸対物レンズ（60倍） 細胞骨格（微小管）に従った小胞輸 送、融合の可視化を実現 Jan Schmoranzer’s Ph.D thesis Rockefeller Univ., USA Ritsumeikan Univ., Sugiyama Lab. & Yokokawa Lab. 対物レンズ型マルチカラー全反射照明システム（２） • • 二波長（488, 594 nm）で同時励起するシステム 倒立、油浸対物レンズ（100倍） • 細胞膜内の二種類の蛍光分子 （Alexa633とGFP）の局在化を 同時に可視化 JST and Kusumi Lab Kyoto Univ., Japan Ritsumeikan Univ., Sugiyama Lab. & Yokokawa Lab. プリズム型マルチカラー全反射照明システム（１） • • • • 二波長（488, 532 nm）で同時励起するシステム DNAマイクロアレイに応用 正立、油浸対物レンズ（100倍） プローブDNA（Fluorescein）とターゲットDNA（Cy3）のハイブ リを可視化 Kang Lab Chonbuk Natl. Univ., Korea Ritsumeikan Univ., Sugiyama Lab. & Yokokawa Lab. プリズム型マルチカラー全反射照明システム（２） • • 二波長（442, 514 nm）で同時励起するシステム 細胞全体を観察、正立、対物レンズ（60倍） • インスリン刺激による細胞応答を 二種類の蛍光分子（CFPとYFP） により同時に可視化 www.stke.org/cgi/content/full/sigtrans;2003/169/pl4 Ritsumeikan Univ., Sugiyama Lab. & Yokokawa Lab. 従来のシングル・マルチカラー全反射照明法の問題点 プリズム型全反射照明 対物レンズ型全反射照明 •全反射照明のために励起レーザのアライメント が必要 •プリズム部が大きくサンプル導入部の設計自由 度が低い •レーザ光源を用いることがほとんどで高価 •油浸対物レンズ利用のため短WD • •オイルの自家蛍光がある •レーザ光のレンズ内導入、アライメントが必要 •レーザ光源を用いることがほとんどで高価 •高NAの対物レンズも非常に高価 マルチカラー全反射照明システム – 商品化が不十分 – アライメントがより困難 – MicroTASなどへの統合が困難 プリズム型 対物レンズ型 これらの問題点を克服するマイクロデバイスの提案 Ritsumeikan Univ., Sugiyama Lab. & Yokokawa Lab. 倒立顕微鏡を用いた観察システム Optical fibers: Blue and Green lasers Fiber stoppers Microlenses Flow‐cell Prism Objective lens and filters CCD camera Ritsumeikan Univ., Sugiyama Lab. & Yokokawa Lab. 正立顕微鏡を用いた観察システム CCD camera Filters Flow‐cell Objective lens Optical fibers: Blue and Green lasers Ritsumeikan Univ., Sugiyama Lab. & Yokokawa Lab. 製作結果：シリコンモールド SEM micrograph of high‐ lighted region Photograph of Si mold Ritsumeikan Univ., Sugiyama Lab. & Yokokawa Lab. 製作結果：PDMSデバイス 20 mm 10 mm SEM micrograph of high‐ lighted region Photograph of PDMS dual‐color TIR‐ based chip Ritsumeikan Univ., Sugiyama Lab. & Yokokawa Lab. 製作結果：デバイスベース厚さt1の制御性 設定パラメータ – ガラス厚さt2=0.17 mm – プリズム厚さt3=270 μm – プリズムの長さl=8043 μm • シミュレーションよりt1=600 μmとするためにPDMS 3.5 ml をモールドに流し込む 1200 Base thickness t1 (μm) • 1000 800 600 400 200 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 PDMS Volume (ml) Ritsumeikan Univ., Sugiyama Lab. & Yokokawa Lab. 倒立顕微鏡を用いた場合のシステム (a) Mirror 4 Mirror 1 Laser diode, 50mW, 473nm Laser diode, 2mW, 543nm Single mode fiber, core/cladding = 9.2μm /125μm Coupling lens, 10X, Coupling lens, 10X, NA = 0.25 NA = 0.25 Dual-color TIR-based Chip Mirror 3 Mirror 2 (b) Objective 10X or 60X Dual-view EMCCD Camera Computer Ritsumeikan Univ., Sugiyama Lab. & Yokokawa Lab. デュアルビューを用いたシステムの評価 Fluorescent emission 異なる蛍光波長を分離してCCD面に分割して投影するシステム Band Adsorption BA 510IF • • 同時励起：B励起（473 nm）とG励起（543 nm） 対象の分子： Dragon Green (480/520)とNile Red (552/580) – NR、DG共に473 nmに吸収を持つ – DGの蛍光は両方のフィルタを透過 – NRの蛍光は585/40 nmのみ透過 Adjustable Aperture Dual‐View Filter Cube Adjustable Mirror Collimating Lens Dichroic Filter 560 nm, Polarizing PS Adjustable Mirror Fixed Mirror Emission Filter ET 585/40 nm Emission Filter ET 515/30 nm Imaging Lens Images are projected side by side on CCD Em DG Ex DG Ex NR Em NR Ritsumeikan Univ., Sugiyama Lab. & Yokokawa Lab. 二種類の蛍光ビーズの同時可視化（全反射デバイス） Dragon Greenビーズ (480/520, dia.=500 nm)⇒Gチャネル側（515/30）で検出 Nile Redビーズ (552/580, dia.=500 nm)⇒Bチャネル側（585/40）で検出 B励起（473 nm） ET 585/40 nm ET 515/30 nm G励起（543 nm） ET 585/40 nm ET 515/30 nm B, G同時励起 ET 585/40 nm ET 515/30 nm 20 μm 20 μm 20 μm 20 μm DG bead Em DG NR bead Ex DG Ex NR Em NR 10 μm Overlay Ritsumeikan Univ., Sugiyama Lab. & Yokokawa Lab. 二種類の蛍光ビーズの個別可視化（全反射デバイス） B励起のみ (473 nm, 10 mW) ET 585/40 nm ET 515/30 nm G励起のみ (543 nm, 1.2 mW) ET 585/40 nm ET 515/30 nm B, G同時励起 ET 585/40 nm ET 515/30 nm DGビーズ 500nm (480/520) 20 μm ET 585/40 nm ET 515/30 nm 20 μm ET 585/40 nm ET 515/30 nm 20 μm ET 585/40 nm ET 515/30 nm NRビーズ 500 nm (552/580) 20 μm 20 μm 20 μm Ritsumeikan Univ., Sugiyama Lab. & Yokokawa Lab. 二種類のビーズの個別可視化（落射蛍光） B励起のみ (BP 460‐495, BA 510IF, DM505) G励起のみ (BP 530‐550, BA 575IF, DM570) ET 585/40 nm ET 515/30 nm ET 585/40 nm ET 515/30 nm DGビーズ 500nm (480/520) 20 μm Note B励起ではGチャネル 側に見える G励起ではBA575IFに より吸収され見えない 20 μm ET 585/40 nm ET 515/30 nm ET 585/40 nm ET 515/30 nm NRビーズ 500 nm (552/580) B、G励起共に蛍光ビ ーズが観察される Ex DG Em DG 20 μm 20 μm Ritsumeikan Univ., Sugiyama Lab. & Yokokawa Lab. 二種類のビーズのブラウン運動 二波長励起全反射照明デバイス 落射蛍光観察 B励起(BP 460‐495, BA 510IF, DM505) Ritsumeikan Univ., Sugiyama Lab. & Yokokawa Lab. シングル・マルチカラー同時励起全反射照明デバイスの応用 • 現有デバイスの即時応用について – 基礎研究：蛍光１分子、膜タンパク質トラッキングなど – ライフサイエンス分野 • 抗原抗体反応（ELISA）検出 • DNA検出 – 流体工学分野 • マイクロ・ナノチャネル壁面での流動現象の可視化 • 現有デバイスの改変、改良による応用について – 従来型TIRシステムの小型化 • 市販システムの簡便化、低廉化⇔従来品の性能とのトレードオフ – 各種センサ • pH, VOC, SPR, 湿度センサなど – 流体工学分野 • マイクロ・ナノPIVシステムへの応用 Ritsumeikan Univ., Sugiyama Lab. & Yokokawa Lab. 実用化に向けた課題 • 用途に応じたデバイス構成の変更 • 用途に応じた光源の選択 • 光学系の高精度化：レンズ形状の変更、表面処理など • 各顕微鏡と用途に対応したデバイスのパッケージング • 高精度、高効率でデバイスを作成できるプロセスへの変 更：PMMAのホットエンボス利用など Ritsumeikan Univ., Sugiyama Lab. & Yokokawa Lab. 本技術に関する知的財産権 • 発明の名称 – 蛍光顕微鏡用全反射バイオチップ及びその製法、並びに蛍光 顕微鏡用全反射バイオチップアセンブリ • 出願番号 – 特願2008‐119836 • 出願人 – 学校法人立命館 • 発明者 – 杉山 進、横川 隆司、ジョン シー ウェルズ – ズン ベト ダオ、ナム カオ ホワイ レ • お問い合わせ先 – – – – 立命館大学理工リサーチオフィス 近藤 光行 ＴＥＬ：077‐561‐2802(ext.6550) ＦＡＸ：077‐561‐2811 E‐mail：[email protected] Ritsumeikan Univ., Sugiyama Lab. & Yokokawa Lab.
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