レドックス応答性タンパク質解析試薬 -SulfoBiotics- PEG-PCMal 1. タンパク質の SH 基数が目視で確認できる 2. ウエスタンブロット時のバンドがクリアー 3. 約 5 kDa のバンドシフト幅で明瞭に SH 基数を判定 新製品 測定原理 タンパク質のチオール基修飾は、代表的な翻訳後修飾の一つであり、生体内のレドックス変化に応答して生じます。チオー ル基の翻訳後修飾によるタンパク質の機能制御を理解するためには、個々のチオール基の酸化還元状態を検出することが必要 不可欠です。 -SulfoBiotics- PEG-PCMal は、タンパク質中のチオール基の数を電気泳動を用いたゲルシフトアッセイ法によって可視化す るための試薬です。マレイミド基を有する PEG-PCMal はタンパク質のチオール基と結合し、1 分子の PEG-PCMal が結合す ることで、ラベル化されたタンパク質は約 5 kDa 増加したバンドとして分離・検出されます。一般的に、PEG-Maleimide が ゲルシフトアッセイ法に用いられていますが、ウエスタンブロット解析の際に、タンパク質にラベル化された PEG 鎖が原 因でメンブレンへの転写効率や抗体認識能の低下を引き起こすことが知られています。本試薬は、光切断可能な PC（photo cleavable）リンカーを有するため、電気泳動後のゲルに UV 光を照射することで、ラベル化されたタンパク質から PEG 鎖を 切り離すことができます。そのため、PEG 鎖の影響を受けることなく、目的タンパク質をウエスタンブロットで検出するこ とが可能です。 図 1 PEG-PCMal によるチオールの修飾および分離・転写イメージ 図 2 PEG-PCMal の構造 図 3 電気泳動によるタンパク SH 基数の可視化 測定例① :GAPDH （kDa） 129 91 SH 基数 -SH×3 -SH×2 70 54 42 Lane 1. GAPDH Lane 2. GAPDH, ラベル化 33 1 DTT（Dithiothreitol) で還元処理した GAPDH（36 kDa、 SH 基数 3）に PEG-PCMal を用いて、チオール基をラ ベル化した後、電気泳動を行ない CBB 染色で検出した。 PEG-PCMal で GAPDH をラベル化することで、チオール 基の数に応じたバンドが検出された。 ※ GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 2 図 4 GAPDH タンパク質のレドックス状態の可視化 URL http://www.dojindo.co.jp/ E-mail [email protected] 測定例③ : 植物細胞 測定例② : 動物細胞 （kDa） 129 91 70 54 42 SH 基数 -SH×5 33 28 16 10 1 2 1 2 図 5 HeLa 細胞中 TRX(Thioredoxin) の レドックス状態の可視化 -SulfoBiotics- 1. AMS でラベル化 2. PEG-PCMal でラベル化 1 2 図 6 シロイヌナズナ中の光応答性タンパク質の レドックス状態の可視化 HeLa 細胞の細胞溶解液を調製し、PEG-PCMal 溶液を添加 により、細胞中のタンパク質をラベル化した。ラベル化後の サンプルをゲル電気泳動した後、ゲルに UV 光を照射して、 ウエスタンブロット解析を行なった。 （左図 :CBB 染色 , 右 図 : 抗 TRX 抗体を用いたウエスタンブロット） 品 R : 還元体 O : 酸化体 Lane 1. TRX Lane 2. TRX, ラベル化 一次抗体 : ウサギ抗 TRX 抗体 二次抗体 : ペルオキシダーゼ標識 ヤギ抗ウサギ抗体 検出方法 : 化学発光法 名 PEG-PCMal シロイヌナズナの葉を用いて PEG-PCMal で試料中のタ ンパク質をラベル化して後処理をした後、電気泳動を行っ た。電気泳動後のゲルに光切断のため UV 光を照射して ウエスタンブロットにより解析した。汎用されている低 分子ラベル化剤 AMS（4-acetamido-4’-maleimidylstilbene2,2’-disulfonic acid）[ 写真左 ] と比較して、PEG-PCMal で標識したタンパク質はバンドシフトが大きく、より分 離されることを確認した [ 写真右 ]。 容 量 希望納入価格 1 mg × 1 ￥8,000 1 mg × 10 ￥50,000 コード メーカーコード - SB20 関連製品 SH 基標識に必要な試薬が全て揃ったキット！！！ -SulfoBiotics- Protein Redox State Monitoring Kit Plus 《Protein SHifter Plus を用いたウエスタンブロット》 本キットには標識試薬、反応バッファー、細胞溶 解用バッファー等が揃っているため、解析した いタンパク質を準備するだけですぐに標識でき る。また標識剤には分子量約 15 kDa の ProteinSHifter Plus を 使 用 し て お り、PEG-PCMal と 同 様に光切断可能なためウエスタンブロット解析に も適用できる。 品 -SulfoBiotics- 名 Protein Redox State Monitoring Kit Plus -SH×3 -SH×2 -SH×1 1. GADPH のみ 2. GAPDH 光切断なし 3. GAPDH 光切断あり Protein-SHifter Plus で ラ ベ ル 化 し た GAPDH を電気泳動にて分離後、光切断す ることで未処理のタンパク質 ( レーン 1） と転写効率が同等であることを確認した。 1 2 3 図 7 GAPDH 中のチオール基数確認 容 量 希望納入価格 コード メーカーコード 5 samples ￥23,000 ￥50,000 340-91741 SB12 20 samples 1）記載価格は本体価格のみで、消費税等は含まれておりません。 2) 記載価格はこのパンフレット編集時 (2016 年 8 月 ) における希望納入価格です。予告無しに変更する場合がございますのでご注意ください。 3）試験・研究用のみに使用するものです。医療用その他の目的には使用できません。 国内販売元 URL www.wako-chem.co.jp フリーダイヤル 0120-052-099 フリーファックス 0120-052-806 開発元 委託製造元・国内問い合わせ先 株式会社 同仁化学研究所 FAX 096-286-1525 TEL 096-286-1515（代表） 30 W Gude Dr. Suite 260, Rockville, MD 20850, USA URL www.dojindo.com Email [email protected] URL http://www.dojindo.co.jp/ E-mail ドージン・イースト（東京） FAX 03-3578-9650 TEL 03-3578-9651（代表） [email protected]
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