発売記念キャンペーン第⼆弾 MagCaptureTM 新規アフィニティー分⼦によるエクソソーム精製キット Exosome Isolation Kit PS 膜表⾯のホスファチジルセリン（PS）に対するアフィニティー法 ホスファチジルセリン（PS）結合分⼦を⽤いて細胞外⼩胞を⾦属イオン依存的に捕捉した後、キレート剤により溶出します。 MagCaptureTM Exosome Isolation Kit PS 新規アフィニティー 精製法採⽤ 特⻑ PSアフィニティー分⼦による回収※ 低バックグラウンド キレート剤により中性条件下でマイルドに溶出 ⾼純度・インタクト エクソソームを単離 ※抗体による従来アフィニティー精製法よりもエクソソームが ⾼収量であることを確認しています。 PSアフィニティー法だと⾼純度エクソソームを 簡単に精製できるね!! 超遠⼼分離不要 マグネティックビーズによる操作性アップ 最適化されたプロトコール ⾼い実験再現性 他の精製⽅法との⽐較 ⽅法 純度 エクソソーム インタクト 回収量 粒⼦の取得 ◎ ■■■ ○ 超遠⼼分離法 △ ■■ ○ ポリマー沈殿法 × ■■■■ ○ 表⾯抗原アフィニティー法（抗体使⽤） ○ ■ × TM MagCapture （PSアフィニティー法） 対象サンプル：細胞培養上清、⾎清、尿など キャンペーン!! 2016年7月1⽇から 9月末まで EDTAやクエン酸などキレート剤処理⾎漿はサンプルとして使⽤することができません。 キットをご購⼊前にご使⽤されるサンプルには⼗分お気をつけください。 コードNo. 293-77601 品名 MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS 容量 希望納⼊価格(円) 10回⽤ 80,000 56,000円 ヒト⾎清から単離したエクソソームの収量⽐較 ヒト⾎清サンプル1mLから本キット、超遠⼼分離法および表⾯抗原に対する抗体アフィニティー法によりエクソソー ムを回収し、ウェスタンブロット（抗CD9抗体、抗CD63抗体）により検出を⾏った。 CD9 CD63 各サンプル量：溶出サンプル15μl＋4×SDSサンプルバッファー5μl レーン1.：超遠⼼分離法 レーン2.：MagCaptureTM レーン3.：A社 Exosome抽出キット（CD9） レーン4.：A社 Exosome抽出キット（CD63） レーン5.：A社 Exosome抽出キット（CD81） レーン6.：A社 Exosome抽出キット（CD9, CD63, CD81, EpCAM抗体ビーズ混合） MagCaptureTMは、超遠⼼分離法や 抗体を⽤いたアフィニティー法よりも エクソソームの回収量が⾼いね!! 従来の沈殿法との性能⽐較実験 実験データ K562（ヒト慢性骨髄性⽩⾎病）細胞培養上清（無⾎清培地または10%Exosome-depleted FBS添加培地） から本 キット、超遠⼼分離法およびポリマー沈殿法を⽤いてエクソソームを回収し、回収量および純度を⽐較した。 MagCaptureTM Exosome Isolation Kit PS 遠⼼分離（10,000×g, 30分間）前処理したK562細胞培養上清（無⾎清培地または10%Exosome-depleted FBS添加培地）1mLからキットプロト コール（反応時間：3時間）に従ってエクソソームを回収した。 超遠⼼分離法 遠⼼分離（10,000×g, 30分間）前処理したK562細胞培養上清サンプル（無⾎清培地または10%Exosome-depleted FBS添加培地）10mLから超 遠⼼分離（110,000×g, 70分間）し、沈殿をTBSで懸濁後、再び超遠⼼分離（110,000×g, 70分間）した沈殿画分を回収した。 ポリマー沈殿法 遠⼼分離（10,000×g, 30分間）前処理したK562細胞培養上清（無⾎清培地または10%Exosome-depleted FBS添加培地）1mLから市販のA社製 品を⽤いて製品プロトコール（静置時間：終夜）に従いエクソソームを回収した。 取得エクソソームの電⼦顕微鏡解析およびNTA(ナノサイト)⽐較 K562細胞培養上清サンプル（無⾎清培地）から本キット、超遠⼼分離法、ポリマー沈殿法によって回収したエクソソーム画分の粒⼦径 をナノサイトLM-10を⽤いて測定した。また、回収したエクソソーム画分(2〜4×1010particles)を終濃度2%パラホルムアルデヒドで固 定化し、電⼦顕微鏡にて解析した。 MagCaptureTM 超遠⼼分離法 ポリマー沈殿法 電⼦顕微鏡画像 データ提供元：⾦沢⼤学 医学系 華⼭教授、⼤阪⼤学 iFReC 中井先⽣ MagCaptureTMは100nm前後の粒⼦がたくさん回収でき、電⼦顕微鏡でも多くの細胞外⼩胞が確認できるね!! K562細胞培養上清（10%FBS添加培地）からの回収量と純度の⽐較 K562細胞培養上清（10%Exosome-depleted FBS添加培地）から本キット、超遠⼼分離法、ポリマー沈殿法で回収したサンプルを 電気泳動した後、銀染⾊およびウェスタンブロット（抗CD63抗体、抗Lamp-1抗体、抗Flotillin-2抗体）により検出を⾏った。 回収量⽐較 純度⽐較 （培養上清150μLに由来する回収量の⽐較） （回収タンパク質量 200ngあたりのマーカータンパク質量の⽐較） Western Blotting Silver Staining CD63 M 1 2 3 1 2 3 Flotillin-2 1 2 3 Western Blotting Silver Staining Lamp-1 1 2 3 (kDa) M 1 2 3 1 CD63 Flotillin-2 2 3 1 2 3 Lamp-1 1 2 3 ＊ ＊ 非特異バンド レーン1.： MagCaptureTM レーン2.： 超遠⼼分離法 レーン3.： ポリマー沈殿法（ A社製品） MagCaptureTMは、エクソソーム回収率が⾼くて 夾雑タンパク質が最も少ないから、 純度と回収量のバランスが⼀番いいわね!! 良くある質問Q&A 実験データ Q1：本キットは抗体を使⽤していますか？ 使⽤していません。⾦属イオン存在下でホスファチジルセリン（PS）に結合するタンパク 質を使⽤しています。 Q2：本キットの操作時間は？ サンプル前処理が約 1 時間、キット⼯程は 3 時間 30 分です（Exosome Capture のビーズへの固定化が約 15 分間、サ ンプルとの反応が 3 時間、エクソソームの洗浄溶出が 約 15分）。 Q3：どのようなサンプルから精製できますか？ 細胞培養上清、⾎清、尿から回収した実績があります。キレート剤（EDTA およびクエン酸）処理⾎漿からは、原理的に 回収することができません。 Q4：1 回あたりのエクソソームの取得量は？ サンプルの種類や量により⼤きく異なりますが、当社実績で5mlのK562培養上清から 1 回の単離でタンパク質量にして最 ⼤ 30μg 程度（BCA 法で測定）、粒⼦数にして 1〜2×1010 の粒⼦（NanoSight LM10 で測定）が回収できています。 また、健常⼈プール⾎清 1mL から 5×109 程度の粒⼦（NanoSight LM10 で測定）が回収できています。 Q5：精製に⽤いるサンプルの最低必要量は？ 安定的にビーズとサンプルを混合するために、ローテーターを⽤いて反応を⾏う場合は 500μL以上、チューブミキサーを ⽤いて反応を⾏う場合は 100μL以上のサンプルを⽤いて下さい。これより少ない量のサンプルを⽤いる場合はTBSを加え て最低必要量以上としてから Exosome Capture 固定化ビーズと反応させてください。 Q6：多量のサンプルから回収できますか？ 濃縮することにより対応できます。細胞培養上清の場合、50mLまでのサンプルに対応できます。遠⼼分離前処理済みの 上清50mLを1mLまで限外濾過濃縮してください。（推奨フィルター：ザルトリウス社 VivaSpin20、分画分⼦量 100K、 メーカーコード： VS2041）。⾎清サンプルは濃縮できないため、使⽤できるのは 10ｍLまでです。ただし1mL以上の⾎ 清は回収効率が低下するため、使⽤後の磁気ビーズを⽤いて精製を繰り返すことをお奨めします。 Q7：Exosome Capture を固定化した使⽤後の磁気ビーズのリサイクルは可能ですか？ 可能です。サンプル中のエクソソームを効率よく回収できるよう、4 回まで繰り返し使⽤できるプロトコールを設定して います。キット添付バッファー類は5回使⽤できる量（通常使⽤1回、再⽣利⽤4回）が含まれています。1mL以上の容量 のサンプルから回収を⾏う場合や濃縮サンプルから回収する場合にお奨めします。同じサンプルから精製を繰り返すこと で回収効率を上げることができます。詳しくは取扱説明書をご参照ください。 その他のQ&Aは弊社HPをご参照ください。 http://www.wakochem.co.jp/siyaku/product/life/magcapture_qa/index.htm 細胞培養上清・⾎清 前処理プロトコール サンプル（細胞培養上清） 300xg, 5min 沈殿 ※2 Exosome＋Large Evsを取得 したい場合には、1,200×g上清を精 製に使⽤してください。 上清※1 （細胞） 1,200xg, 20min 沈殿 上清※2 （細胞断⽚） ※3 Exosomeを取得したい場合には、10,000×g 上清を精製に使⽤してください。 10,000xg, 30min ※1 ⾎清サンプルの場合にはここから 前処理を開始してください。 （300xg 遠⼼分離処理は不要です。） 沈殿 上清※3 （Large EVs） 精製ステップ （10,000xg 上清） 濃縮（オプション※4 ） 〜50mL（1,200×g上清または10,000×g上清） 限外濾過濃縮 （VivaSpin20 分画分⼦量100K） 精製ステップ （1,200xg 上清） 1mL ※4 濃縮ステップは⼤容量 （〜50mL）の細胞培養上清 サンプルから精製する場合の オプションです 精製ステップ （〜50倍濃縮） MagCaptureTM Exosome Isolation Kit PS 操作フロー サンプル前処理 ビーズ準備 （15min） 細胞培養上清 上記前処理プロトコールをご 参照下さい。 アフィニティー反応 (180min〜) 洗浄 溶出 （15min） ⾎清・尿 Streptavidin Biotin-labeled Magnetic Beads Exosome Capture 遠⼼分離 固定化 濃縮（オプション） + Exosome Binding Enhancer(x500) Exosome Elution Buffer Reaction Tubes Washing Buffer + Exosome Binding Enhancer(x500) 精製完了 ●本文に記載しております試薬は、試験・研究用にのみ使用されるもので、「医薬品」、「食品」、「生活用品」などとして使用できません。 ●希望納入価格には消費税等が含まれておりません。 ●希望納入価格は予告なく変更する場合がございますがご了承下さい。 ●掲載内容は、2015年11月時点での情報です。上記以外の法律及び最新情報は、siyaku.com (http://www.siyaku.com/) をご参照下さい。 1 6 6 0 5 技 01J
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