Targeted Induction of Ceramide Degradation Leads to Improved Systemic Metabolism and Reduced Hepatic Steatosis セラミド分解の標的導入は全身の代謝を改善し、脂肪肝を減らす Jonathan Y. Xia, William L. Holland, Christine M. Kusminski, Kai Sun, Ankit X. Sharma, Mackenzie J. Pearson, Angelica J. Sifuentes, Jeffrey G. McDonald, Ruth Gordillo, Philipp E. Scherer Cell Metabolism Volume 22, Issue 2, Pages 266-278 (August 2015) DOI: 10.1016/j.cmet.2015.06.007 背景 セラミドとインスリン抵抗性 ・ げっ歯類において、肝臓や血漿セラミド量の増加は肝臓機能不全およびインスリン 抵抗性、脂肪蓄積を起こす (Ichi et al., 2007; Xia et al., 2014; Yetukuri et al., 2007) ・ 肥満が引き起こすインスリン抵抗性はセラミドによって誘導され、その標的は肝臓 である (Holland et al., 2007) ・ C16セラミドはインスリンの作用を強く阻害する (Raichur et al., 2014; Turpin et al., 2014) ・ 酸性セラミダーゼを過剰発現させたC2C12培養細胞では飽和脂肪酸によるインス リン作用の阻害を防ぐ (Chavez et al., 2003) スフィンゴイド塩基 OH セラミド HO OH HO NH O R n NH セラミダーゼ n ＋ OH O R 脂肪酸 肝臓の脂質代謝やインスリン感受性に対するセラミド量の影響を調べるため 組織特異的にセラミダーゼを過剰発現させる遺伝子を導入したマウスを用いて 脂質量やインスリンシグナル伝達を評価した。 酸性セラミダーゼを肝臓特異的に過剰発現するマウス Alb-AC Fig.S1 Tet onシステムを組み込んだ ドキシサイクリン（dox）存在下で目的遺伝子を発現する HFD-dox (200mg) 8週間 Alb-AC 肝臓特異的に酸性セラミダー ゼmRNA発現が増加 セラミダーゼmRNA発現量・活性 測定 肝臓の酸性セラミダーゼ活性 が増加 血清の酸性セラミダ ーゼ活性は変化なし 肝臓酸性セラミダーゼ過剰発現によりセラミドが減少 HFD-dox (200mg) 8週間 Fig.1 セラミド測定（肝臓、血清） Alb-AC 肝臓および血清中のセラミド（C16:0、C18:0）が減少 肝臓酸性セラミダーゼ過剰発現 Fig.1 グルコース経口投与（2.5g/kg体重） HFD-dox (200mg) 8週間 Alb-AC 糖負荷試験 絶食3h 0 15 30 60 120 min 尾静脈から採血 血糖値低下 血中インスリン濃度低下 肝臓酸性セラミダーゼ過剰発現 インスリン抵抗性試験 Fig.1 HFD-dox (200mg) 8週間 Alb-AC インスリン腹腔内投与（0.75U/kg体重） 絶食3h 0 10 20 30 min 尾静脈から採血 インスリン投与後の 血糖値低下が亢進 肝臓酸性セラミダーゼ過剰発現 HFD-dox (200mg) 8週間 グルコースクランプ試験 Fig.1 Alb-AC 尾静脈から採血 インスリン サンプリング 血糖値を 一定にする グルコース （3H標識） ＋デオキシグルコース 投与量と血中検出量から組織に取り 込まれたグルコース量がわかる F グルコース注入量多い ＝インスリン感受性高い 腸間膜脂肪組織、精巣周囲脂肪 組織、皮下脂肪組織において2デオキシグルコース取り込み量 が増加 肝臓でのグルコース 産生率減少 （グルコース投与量と骨格筋へ の取り込まれた量から算出） 肝臓酸性セラミダーゼ過剰発現 インスリンシグナル伝達 Fig.1 インスリン インスリン 受容体 グルコース GLUT2 リン酸化 UDPグルコース 肝細胞 グリコーゲン合成 酵素キナーゼ3β グリコーゲン 合成酵素 グリコーゲン 肝臓酸性セラミダーゼ過剰発現 インスリンシグナル伝達 Fig.1 インスリン 受容体 インスリン IRS2がリン酸化される PI3Kがリン酸化される Akt p-Akt グルコース GLUT2 リン酸化 UDPグルコース 肝細胞 グリコーゲン合成 酵素キナーゼ3β グリコーゲン 合成酵素 肝臓だけでなく脂肪 組織のインスリン シグナル伝達が亢進 グリコーゲン 肝臓酸性セラミダーゼ過剰発現 HFD-dox (200mg) 8週間 肝臓脂質蓄積 Fig.２ 肝臓サンプリング Alb-AC 肝臓組織のHE染色（細胞核、細胞質を染色） 肝臓重量減少 (Fig. 1) ジアシルグリセロール＋アシルCoA →トリグリセリド 肝臓中の トリグリセリド 減少 肝臓酸性セラミダーゼ過剰発現 トリグリセリドクリアランス試験 HFD-dox (200mg) 8週間 Alb-AC Fig.２ 脂質エマルション単回投与（15μL/g体重） 一晩絶食 0 血中にトリグリセリドが 多く存在 1 2 3 4 5 6 7 h 尾静脈から採血 血中に放出されたVLDLが増加 阻害剤 VLDL リポたんぱく質リパーゼ TG LDL 肝臓酸性セラミダーゼ過剰発現 脂質取り込み評価 Fig.２ HFD-dox (200mg) 8週間 Alb-AC 3H-トリオレイン（2μCi, 100μL/匹）尾静脈注射 20 min 5時間絶食 肝臓への脂質の取り込みが減少、脂肪組織へは増加 放射活性測定 肝臓酸性セラミダーゼ過剰発現 HFD-dox (200mg) 8週間 精巣周囲脂肪組織（炎症） Fig.２ サンプリング Alb-AC 王冠様構造 脂肪の過剰蓄積により肥大化し細胞死をおこしたもの をマクロファージが取り囲んでいる構造 免疫担当細胞が貪食・処理をすることで、慢性炎症が 生じている S2 王冠様構造が減少 （マクロファージを免疫染色） マクロファージが減少 炎症性サイトカインの mRNA発現量が低下 肝臓酸性セラミダーゼ過剰発現 HFD-dox (200mg) 8週間 精巣周囲脂肪組織（線維化） Fig.２ サンプリング Alb-AC 肝線維症は肝障害の徴候 肝臓における結合組織の蓄積であり、肝細胞損傷に対する反応である 基質コラーゲン代謝の調節を異常とし、異常な基質を過剰に生産する F S2 WT Alb-AC 線維化の程度が減弱 線維化マーカーの mRNA発現量が低下 肝臓酸性セラミダーゼ過剰発現 HFD-dox (200mg) 8週間 精巣周囲脂肪組織（セラミド） Fig.２ サンプリング OH Alb-AC HO 極性基 ラクトシルセラミドなどが減少 NH O n スフィンゴイド塩基 R スフィンゴシンなどが減少 肝臓酸性セラミダーゼ過剰発現 小括 酸性セラミダーゼ過剰発現 セラミド セラミド ジアシルグリセロール グルコース セラミド グルコース取り込み 脂質取り込み トリグリセリド VLDL インスリンシグナル インスリン感受性 炎症、線維化 インスリンシグナル 酸性セラミダーゼを脂肪組織特異的に過剰発現するマウス Art-AC Fig.S3 Tet onシステムを組み込んだ ドキシサイクリン（dox）存在下で目的遺伝子を発現する HFD-dox (200mg) 10日間 セラミダーゼmRNA発現量・活性 測定 Art-AC 白色脂肪組織に酸性セラミ ダーゼmRNA発現が増加 白色脂肪組織の酸性セラミ ダーゼ活性が増加 血清の酸性セラミダ ーゼ活性は変化なし 脂肪組織酸性セラミダーゼ過剰発現によりセラミド減少 HFD-dox (200mg) 10日間 Fig.3 セラミド測定（脂肪組織、血清） Art-AC 脂肪組織および血清中のセラミドが減少 血清中のスフィンゴイド塩基が増加 脂肪組織酸性セラミダーゼ過剰発現 糖負荷試験 Fig.3 HFD-dox (200mg) 10日間 グルコース経口投与（2.5g/kg体重） 絶食3h Art-AC 0 15 30 60 120 min 尾静脈から採血 糖投与15分後 血糖値低下 血中インスリン濃度低下 脂肪組織酸性セラミダーゼ過剰発現 インスリン抵抗性試験 Fig.3 HFD-dox (200mg) 10日間 Art-AC インスリン腹腔内投与（0.75U/kg体重） 絶食3h 0 10 20 30 min 尾静脈から採血 インスリン投与後の 血糖値低下が亢進 脂肪組織酸性セラミダーゼ過剰発現 HFD-dox (200mg) 10日間 グルコースクランプ試験 Fig.3 Art-AC 尾静脈から採血 インスリン サンプリング 血糖値を 一定にする グルコース （3H標識） ＋デオキシグルコース 投与量と血中検出量から組織に取り 込まれたグルコース量がわかる グルコース注入量多い ＝インスリン感受性高い 腸間膜脂肪組織、精巣周囲脂肪 組織、皮下脂肪組織において2デオキシグルコース取り込み量 が増加 肝臓でのグルコース 産生率減少 （グルコース投与量と骨格筋へ の取り込まれた量から算出） 脂肪組織酸性セラミダーゼ過剰発現 インスリンシグナル伝達 Fig.3 インスリン 受容体 インスリン IRS2がリン酸化される PI3Kがリン酸化される Akt p-Akt グルコース GLUT2 リン酸化 UDPグルコース 肝細胞 グリコーゲン合成 酵素キナーゼ3β グリコーゲン 合成酵素 グリコーゲン 脂肪組織と肝臓の インスリンシグナル 伝達が亢進 脂肪組織酸性セラミダーゼ過剰発現 HFD-dox (200mg) 10日間 精巣周囲脂肪組織 S4 Fig.4 サンプリング Art-AC 王冠様構造 炎症性サイトカイン 線維化マーカー mRNA発現量が低下 王冠様構造が減少 マクロファージが減少 線維化抑制 脂肪組織酸性セラミダーゼ過剰発現 HFD-dox (200mg) 10日間 肝臓脂質蓄積 Fig.4 サンプリング 肝臓組織のHE染色（細胞核、細胞質を染色） Art-AC 肝臓中の トリグリセリド 減少 脂肪組織酸性セラミダーゼ過剰発現 HFD-dox (200mg) 10日間 Art-AC TGクリアランス試験 Fig.4 脂質エマルション単回投与（15μL/g体重） 一晩絶食 0 1 2 3 4 5 6 h 尾静脈から採血 血中に放出されたVLDLに変化なし 血中トリグリセリド量に 変化なし 阻害剤 VLDL リポたんぱく質リパーゼ TG LDL 脂肪組織酸性セラミダーゼ過剰発現 脂質取り込み評価 Fig.4 HFD-dox (200mg) 10日間 Art-AC 3H-トリオレイン（2μCi, 100μL/匹）尾静脈注射 20 min 5時間絶食 肝臓への脂質の取り込みが減少 放射活性測定 脂肪組織酸性セラミダーゼ過剰発現 小括 酸性セラミダーゼ過剰発現 セラミド トリグリセリド インスリンシグナル セラミド セラミド スフィンゴイド塩基 グルコース取り込み グルコース 脂質取り込み VLDL 炎症、線維化 インスリン感受性 インスリンシグナル 脂肪肝誘導後に酸性セラミダーゼ過剰発現 HFD-dox (200mg) HFD 2ヵ月間 Alb-AC Art-AC 脂肪肝誘導 0 03 2 14 4 肝臓中セラミド量 Fig.5 肝臓にセラミダーゼ過剰発現 8 週 脂肪組織にセラミダーゼ過剰発現 28 日 酸性セラミダーゼ過剰発現 酸性セラミダーゼ過剰発現 脂肪組織にセラミダーゼ過剰発現させた方が早く 肝臓中のセラミド量を低下 脂肪肝誘導後に酸性セラミダーゼ過剰発現 HFD 2ヵ月間 Alb-AC Art-AC 脂肪肝誘導 HFD-dox (200mg) 0 0 3 2 4 インスリンシグナル伝達 Fig.5 肝臓にセラミダーゼ過剰発現 8 週 脂肪組織にセラミダーゼ過剰発現 酸性セラミダーゼ過剰発現 脂肪組織にセラミダーゼ過剰発現させた方が早く インスリンシグナル伝達が亢進 酸性セラミダーゼ過剰発現 脂肪肝誘導後に酸性セラミダーゼ過剰発現 HFD-dox (200mg) HFD 2ヵ月間 Alb-AC Art-AC 脂肪肝誘導 0 3 03 14 14 30 肝臓脂質蓄積 Fig.5 肝臓にセラミダーゼ過剰発現 60 日 脂肪組織にセラミダーゼ過剰発現 28 日 酸性セラミダーゼ過剰発現 脂肪組織にセラミダーゼ過剰発現させた方が早く 肝臓トリグリセリド蓄積量減少 酸性セラミダーゼ過剰発現 脂肪肝誘導後に酸性セラミダーゼ過剰発現 HFD 2ヵ月間 Alb-AC Art-AC 脂肪肝誘導 インスリン抵抗性試験 Fig.5 HFD-dox (200mg) 0 肝臓にセラミダーゼ過剰発現 3 日 0 脂肪組織にセラミダーゼ過剰発現 3 日 酸性セラミダーゼ過剰発現 酸性セラミダーゼ過剰発現 脂肪組織にセラミダーゼ過剰発現誘導３日目でインスリン感受性改善 脂肪組織セラミダーゼ過剰発現の方が早く脂肪肝やインスリン感受性に効果を及ぼした 酸性セラミダーゼ過剰発現とCD36 Fig.6 CD36：細胞内への脂肪酸輸送促進 Alb-AC HFD-dox (200mg) 2ヵ月間 肝臓にセラミダーゼ過剰発現 脂肪組織にセラミダーゼ過剰発現 Art-AC セラミダーゼ過剰発現により、肝臓のCD36発現量が低下 酸性セラミダーゼ過剰発現とCD36 Fig.6 ・ 心筋細胞においてPKCζはCD36の活性化を促進し、脂質の取り込みを促進する(Luiken et al., 2009) ・ セラミドはPKCζの活性因子である(Muller et al., 1995) 氷冷PBSで洗う（3回） 回収 C2セラミド100μM（or DMSO） H4iie（ラット肝がん由来細胞） 90～100%コンフルエント 60分 ドミナントネガティブ (不活性) CD36免疫染色 常時活性型 DAPI（細胞核を染色） CD36が膜移行 CD36は膜に局在していない セラミド添加前からCD36が膜局在 セラミドによるCD36の膜移行はPKCζを介す 酸性セラミダーゼ過剰発現とPKCζ Fig.6 Alb-AC HFD-dox (200mg) 8週間 肝臓にセラミダーゼ過剰発現 脂肪組織にセラミダーゼ過剰発現 セラミダーゼ過剰発現により肝臓のPKCζ発現量が減少し、活性は低下する セラミドとPKCζ活性、脂肪酸取り込み 0.2%BSA (脂肪酸不含) +PKCζ偽基質阻害剤 Fig.6 C2セラミド100μM 90分 H4iie（ラット肝がん由来細胞） 60分 氷冷PBSで洗う（3回） 回収 90～100%コンフルエント dn：ドミナントネガティブ（不活性） Ca：常時活性 セラミド添加によって脂肪酸取り込み促進 セラミド添加によってPKCζ活性化 スフィンゴシンとPKCζ活性、脂肪酸取り込み 0.2%BSA (脂肪酸不含) +PKCζ偽基質阻害剤 90分 60分 H4iie（ラット肝がん由来細胞） 90～100%コンフルエント スフィンゴシン50μM Fig.S5 氷冷PBSで洗う（3回） 回収 スフィンゴシンは、セラミダーゼ反応の生成物であり、複数のPKCの阻害剤 スフィンゴシンはPKCζの活性を抑制 スフィンゴシンはセラミドによる 脂肪酸取り込みを抑制 酸性セラミダーゼ過剰発現とPKCζ Alb-AC HFD-dox (200mg) ＋APCD（PKCζ阻害剤） 2ヵ月間 Art-AC インスリン抵抗性試験 Fig.6 インスリン腹腔内投与（0.75U/kg体重） 絶食3h 0 10 20 30 min 尾静脈から採血 酸性セラミダーゼ過剰発現 PKCζ阻害剤はセラミダーゼ過剰発現時と同じくらい インスリン感受性を改善 酸性セラミダーゼ過剰発現 酸性セラミダーゼ過剰発現とPKCζ Alb-AC Fig.6 HFD-dox (200mg) ＋APCD（PKCζ阻害剤） 2ヵ月間 サンプリング Art-AC PKCζ阻害剤はセラミダーゼ過剰発現時と同じくらい 肝臓中トリグリセリド量を低下 総括 肝臓のセラミダーゼ過剰発現 肝臓 脂肪組織 セラミド 脂質 取り込み インスリンシグナル伝達 インスリン感受性改善 互いのスフィンゴ脂質量がインスリン感受性 や肝臓脂肪蓄積に影響 脂肪組織のセラミダーゼ過剰発現 肝臓 脂肪組織 セラミド 取り込み 脂質 インスリンシグナル伝達 インスリン感受性改善 ・ セラミドはPKCζの活性化を促進し、CD36による脂肪酸の取り込みを増加させた ・ 脂肪組織でのセラミダーゼ過剰発現による脂肪肝抑制やインスリン感受性改善は 肝臓でのセラミダーゼ過剰発現よりも早く効果を示した
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