Mature miR-183, negatively regulated by transcription factor GATA3, promotes 3T3-L1 adipogenesis through inhibition of the canonical Wnt/β-catenin signaling pathway by targeting LRP6 成熟型のmiR-183は転写因子であるGATA3により抑制的 に制御されており、LRP6を標的としてWnt/b-catenin経路 を抑制することで、3T3-L1細胞の脂質合成を促進する。 2014/12/08 藤森諒 Wnt/b-catenin経路について http://www.ishiyaku.co.jp/magazines/ayumi/AyumiArticleDetail.aspx?BC=923310&AC=9228 細胞の増殖や分化、細部周期の制御に関わる Wntタンパクが脂質合成を抑制する S.E. Ross, Science, 289 (2000), pp. 950–953 miRNAについて 転写されるが翻訳されない 小分子RNA mRNAに結合し、分解したり、 翻訳を抑制したりすること で特定の遺伝子の発現を 抑制する 細胞内に存在するが、エキ ソソームにより細胞外に放 出され、近接する細胞へ輸 送される 一部のmiRNAはガン細胞 に関わるとされており、創 薬のターゲットとしても現在 注目されている。 Vectorbiolabs HPより 背景と目的 肥満マウスの肝臓でmiR-183の発現量が野生型に比べて4倍多かった。 N. Nakanishi, Biochem. Biophys. Res. Commun., 385 (2009), pp. 492–496 分化した3T3-L1細胞でmiR-183の発現量が未分化のものに比べて2倍多 かった。 E. John, Nucleic Acids Res., 40 (2012), pp. 4446–4460 miR-183は脂質合成に関わるのではないか？？ miR-183が脂肪細胞の分化に与える影響 1. miR-183のミミックまたはNCを3T3-L1細胞に導入 2. 24時間後に分化誘導培地（IDM）に置換 3. 5日後にOil redにより脂肪滴を染色 miR-183は脂肪細胞の 分化を促進した。 IDM：インスリン、DEX（デキサメタソン）、IBMX（イソブチルメチルキサンチン） miR-183が脂肪細胞の分化に与える影響 Oil redの定量化 キットによりTGを定量 miR-183が脂肪細胞分化に関わる 遺伝子に与える影響 1. miR-183のミミックまた はNCを3T3-L1細胞に 導入 2. 24時間後に分化誘導 培地（IDM）に置換 3. qPCRにより定量 （bアクチンで標準化） 分化の初期過程 （Day2とDay4）で、 各遺伝子の発現量 を増加させた。 miR-183の抑制が脂肪細胞の分化に与える影響 1. miR-183のinhibitorまたはNCを3T3-L1細胞に導入 2. 24時間後に分化誘導培地（IDM）に置換 3. 4日後にOil redにより脂肪滴を染色 miR-183のinhibitor：miR-183とペアの塩基対のもの miR-183の抑制により、脂肪 細胞の分化は抑制された。 miR-183の抑制が脂肪細胞の分化に与える影響 Oil redの定量化 キットによりTGを定量 miR-183の抑制が脂肪細胞分化に 関わる遺伝子に与える影響 miR-183の標的遺伝子の同定 コンピュータのソフトウェアにより、miR-183と結合する可能性のある脂質合成 に関わる遺伝子を解析 → LRP6（ Wntが結合する受容体）の3’UTR（転写されるが翻訳されない部分） に結合する可能性があると解析された。 そこで、 ① miR-183によりLRP6の発現量やWnt/b-catenin経路が抑制されるかどうか ② それはLRP6のmRNAと結合することによるものかどうか ③ LRP6の抑制は実際に脂質合成に影響を与えているか これらを検証した。 ① miR-183がLRP6に与える影響 導入して24 h後にqPCR 導入して48 h後にウエスタンブロット miR-183はLRP6を抑制した。 ① miR-183がWnt/b-catenin経路に与える影響 C-mycの発現量 核内のb-カテニンのタンパク量 miR-183はWnt/b-catenin経路を抑制した。 ② miR-183の標的遺伝子の結合部位の変性 1. BHK細胞にwild typeまたはmutantの部位を持つルシフェラーゼプラスミドを導入 2. miR-183のミミックまたはNCを導入 3. 24時間後にcell lysatesを回収し、ルシフェラーゼ活性を測定 ② miR-183の標的遺伝子の結合部位の 変性によるプロモーター活性への影響 結合部位の変性 により、miR-183に よる抑制が見られ なくなった。 miR-183の活性に は標的遺伝子へ の結合が重要であ ると考えられる。 ③ siRNAによるLRP6の抑制の確認 24時間後 qPCR 48時間後 ウエスタンブロット siRNAによるLRP6の抑制が確認された ③ LRP6の抑制が脂肪細胞の分化に与える影響 1. siRNAを導入して24h後に分化誘導培地に置換 2. 4日後にOil redで染色 分化を促進した。 ③ LRP6の抑制が脂肪細胞の分化に与える影響 Oil redの定量化 キットによりTGを定量 ③LRP6の抑制が 脂肪細胞分化に 関わる遺伝子に 与える影響 ゲノム上のmiR-183の構造の解析 オンライン上のソフトウェアとpri-miR-183の配列から、ゲノム上でのmiR-183 の位置を予測した。 Pri-miR-183の転写領域の5’側（上流）に複数のプロモーター配列を見つけた。 → どのプロモーター部位が作用してpri-miR-183を転写しているか？？ レーポーターアッセイによって調べた。 1. pGL3-basic（ホタルルシフェラーゼ）, pGL3-control, pGL3-miR-183 promoter fragmentをBHK細胞に導入 2. pRL-TK（ウミシイタケルシフェラーゼベクター）を導入 3. 24時間後にcell lysatesを回収し、ルシフェラーゼ活性を測定 Promoter-1,2の活性 Promoter-2が転写活性を示した。 Promoter-2のどの部分が特に重要であるか？？ 5’末端側が特に重要か。 pre-miR-183のcore promoterに結合する 転写因子の同定 オンライン上のソフトウェアにより、pre-miR-183のcore promoterに結合する転写因 子の候補としてsp1とGATA3を見つけた。（どちらも脂肪細胞の分化に関わっている） → miR-183の転写活性に影響を与えるかどうか、sp1とGATA3をプラスミドで過剰発 現させることで調べた。 過剰発現の確認（導入して24 h後にqPCR） sp1またはGATA3の過剰発現が miR-183の転写活性へ与える影響 sp1 GATA3 導入して24 h後にcell lysatesを回収し、ルシフェラーゼ活性を測定 GATA3の過剰発現により、転写活性が抑制された。 miR-183のリプレッサーとしてはたらくと考えられる。 GATA3の過剰発現がmiR-183の 発現量に与える影響 導入して48 h後にqPCR GATA3の過剰発現により、miR-183の発現が抑制された。 GATA3の過剰発現がmiR-183の標的遺伝子 であるLRP6の発現量に与える影響 qPCR ウエスタンブロット GATA3の過剰発現はmiR-183の発現量の抑制を通して、 LRP6の発現を上昇させた。 GATA3の作用はcore promoterに 結合することによるものか core promoterを変異 → ルシフェラーゼ活性を測定 core promoterの変異により 活性が上昇した。 GATA3を過剰発現 core promoterを変異したとき、GATA3 の過剰発現は影響を与えなかった。 クロマチン免疫沈降による core promoterとGATA3の結合の確認 タカラバイオ HPより 得られたDNA断片をPCRで増幅し、DNAシー ケンシングをしたところ、core promoterであ ることが確認された。 Core promoterとGATA3の 結合が確認された。 総 括 Wnt/b-catenin経路は脂 質合成を抑制する miR-183はWntの受容体 であるLRP6を抑制するこ とでWnt/b-catenin経路 を抑制し、脂質合成を促 進する GATA3はmiR-183を抑制し、 またPPARgも直接抑制し て脂質合成を抑制する。
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