hayashi_presentation

Monitoring the Expression Pattern of
1300 Arabidopsis Genes under
Drought and Cold Stresses by Using a
Full-Length cDNA Microarray
The Plant Cell, Vol.13, 61-72, January 2001
Motoaki Seki, Mari Narusaka, Hiroshi Abe,
Mie Kasuga, Kazuko Yamaguchi-Shinozaki,
Piero Carninci, Yoshihide Hayashizaki, and
Kazuo Shinozaki
Introduction
環境ストレスについて

植物の成長は環境ストレスに影響を受ける。
→植物はこれらのストレスに応答し、適応している。

その中でも乾燥・水不足は、植物の成長・作物
の生産に最も厳しい制限要因となる。
→乾燥ストレスは様々な生化学反応や
生理学反応を誘導する。
例えば、光合成には水が必要であり、また気孔が閉じることにより、
ガス交換が妨げられるため、水不足は光合成能力を制限する要因となる。
Introduction
環境ストレスに対する応答

タンパク質は色々な機能を持っており、状況に
応じて合成され、機能している。→何が関わっているのか？

ストレス誘導性の遺伝子が転写されることで、
それに対応するタンパク質が合成され、
ストレス耐性が向上する。

この研究では、新たなストレス誘導性の遺伝子
を同定することを目的とした。
Introduction
研究の背景

プロジェクトによって、多くの生物の塩基配列な
どが決定されている。

シロイヌナズナでは2000年の終わりに、全塩基
配列が決定された。

今後は、これらのデータベースをもとに機能解析
を行うことが重要である。
Introduction
マイクロアレイについて

近年、遺伝子発現の解
析にとって便利な方法と
して注目されている。

大多数の遺伝子発現の
比較解析ができる。
(右図を参照)
Introduction
目的とした遺伝子

乾燥誘導性遺伝子 (drought-inducible gene)

低温誘導性遺伝子 (cold-inducible gene)

DREB1Aの標的遺伝子 (target gene of DREB1A )
DREB1A・・・DRE結合性タンパク質1A。低温に誘導される。
標的遺伝子・・・ある遺伝子によって発現調節を受ける遺伝子。
Method
植物材料とストレス処理

シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)
２２℃、３週間、発芽培地上で生育。

乾燥処理

温度２２℃、湿度60%、薄暗い

低温処理
温度２２℃→４℃、薄暗い
それぞれの処理は2時間、10時間行った。
Method
トランスジェニック(遺伝子導入)植物

生育条件は先程と同様

DREB1A遺伝子を過剰発現させた。
(22℃、3週間、発芽倍地上で生育)
→つまり、その標的遺伝子の発現量も多くなっていると考えられる。
Method
マイクロアレイ解析の流れ
(Figure 2)

それぞれのRNAを抽出

抽出したRNAを蛍光標識でラベリング
(未処理をCy5〈緑〉、処理をCy3〈赤〉)

ハイブリダイゼーション
ラベリングして得られたプローブをチップ上にスポットしてある
cDNA(PCRの生成物)とハイブリダイゼーションをさせる。

チップをスキャナで取り込み、蛍光の
パターンを見て、発現量を解析する。
スキャニング後の解析の例
•
•
•
•
赤→処理したほうが発現量が多い。
黄→処理と未処理で発現量に変化はない。
緑→未処理のほうが発現量が多い。
黒→処理、未処理ともに発現していない。
(Figure 1)
Method
RNAゲルブロット解析

Northern blot 法を用いて、
抽出した全RNAの一部を解析。
→マイクロアレイの正確性を評価するため。

調べたい遺伝子に結合する相補的な配列を持ったDNAあるいは
RNAプローブ液(今回はPCRで生成されたcDNA)を加えてハイブリ
ダイゼーションを行うことにより、特定のRNAを検出する方法。
Result & Discussion
マイクロアレイの正確性(RNAゲルブロット解析)
(Figure 3)

マイクロアレイのデータは、
RNAゲルブロット解析に
おいても妥当性が認めら
れた。

マイクロアレイで新たに確認された
6つのDREB1A標的遺伝子の発現は、
乾燥・低温に誘導されており、無ストレス
処理のトランスジェニック植物においても、
過剰に発現していた。
Result & Discussion
マイクロアレイで確認された遺伝子の数
(Table 1)
遺伝子の種類
確認された数
そのうち
新しいもの
以前に報告さ
れているもの
乾燥誘導性遺伝子
(drought-inducible gene)
44
30
14
低温誘導性遺伝子
(cold-inducible gene)
19
10
9
DREB1Aの標的遺伝子
(target gene of DREB1A )
12
6
6
→今回のマイクロアレイが、ストレス誘導性の遺伝子を見つけるのに、
適切に機能していることを示している。
遺伝子の発現特性による
グループ分け
(Figure 4, Table 2)
グループに分けられなかった遺伝子―21
Result & Discussion
新たに確認された遺伝子の同定
(Table 2)

相同性検索(BLAST)を利用して、
新しく確認された遺伝子の同定を行った。
遺伝子
相同性検索の結果
FL6-55(乾燥)
LEA 76 type I protein (X91919)
FL2-56(乾燥)
glycine-rich protein 3 short isoform
(GRP3S; AF104330)
FL5-3J4(乾燥)
Borrelia burgdorferi heat shock protein dnaJ
(M96847)
FL5-2D23(乾燥)
T20517 EST
FL5-90(低温)
β-amylase (AJ250341)
Result & Discussion
DREB1A標的遺伝子について
(Table 3)

多くの遺伝子はDRE、
もしくはCCGAC配列を
持っている。
→これらの遺伝子は、
ABA独立性経路によって
制御されている。

6つの遺伝子はABRE配
列を持っている。
→これらの遺伝子は、
ABA依存性経路によって
制御されている。
Result & Discussion
DREB1A標的遺伝子について
(Table 3)

rd20は、ABREをプロモーターに含んでおり、ABA処理にも誘導さ
れることから、ABA依存性経路によって制御されている。

DREB1A/CBF3は、低温特異的な遺伝子発現に関連する配列をプロモー
ターに含んでおり、ABA処理には誘導されない。つまり、ABA独立性経路に
よって制御されている。
→ストレス誘導性の遺伝子発現が、異なる制御
システムによって制御されている。
Result & Discussion
今後の展望(DREB1Aについて)

DREB1Aの標的遺伝子を、マイクロアレイにより
同定することができた。

DREB1A遺伝子の間接的な標的と、直接的な
標的を区別することはできなかった。

この問題点や複雑な相互関係を明らかにするに
は、他のアプローチが必要となる。
Result & Discussion
その他のストレス誘導性遺伝子
(Figure 4)

乾燥ストレスと低温ストレス、双方に誘導される遺伝子の大半は
DREB1Aであった。

しかし、4つの遺伝子はトランスジェニック植物の実験では、発現量
が増えていなかった。
→これら遺伝子はDREB1Aの標的遺伝子ではない
→ストレス応答性の遺伝子発現に関連する
新しい配列の存在
Result & Discussion
今後の展望(マイクロアレイ)

遺伝子の発現量の体系的な方法

新しい遺伝子を見つけるために有効

植物ホルモン誘導性遺伝子、組織特有の遺伝
子、標的遺伝子の同定に適用させていく。

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