藍藻Phormidium tenueの光特性と カビ臭物質の発生機構の解明プロジェクト No．2 Study on optical characteristics and musty odor compound of Phormidium tenue 参加登録学生： 福山 朝子(Fukuyama Asako)，劉 顯傑（Ryu Kenketsu） 指導担当教員： 浅枝 隆(Asaeda Takashi) 学外の連携組織： はじめに ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ ダム湖に発生する藍藻Phormideium tenueはカビ臭を発生させることが知られている。ここでは、室内実験や野外観 測によって、Phormidiumのカビ臭発生の特性およびPhormidium自体の増殖についての分光特性を調べ、カビ臭の 発生抑制の方法を理論的に確立する。 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ (財)ダム水源地環境整備センター（WEC) (株)環境科学コーポレーション 東京都水道局水源管理事務所 Introduction ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ It is known that Phormideium tenue generated in the dam lake are generated of the moldy smell. So the spectrum characteristic of the proliferation of the characteristic of the moldy smell generation of Phormidium and Phormidium is examined by the laboratory experiment and the field observation, and the generation control of moldy smell method is established theoretically. ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 背景・目的 全国のダム貯水池、自然湖沼で存在が確認されている藍藻Phormideium tenueは２－MIB（ジメチルイソボルネオール)によるカビ臭を発生させることが知られ ている。現在Phormidium tenueは誤同定によって複数種を含んでおり、緑株と茶株の存在が知られている。そこで、今回のプロジェクトではこれまで Phormidiumの代表的な株として、多くの研究で使用されてきた国立環境研究所の3種の株を用いて室内実験や野外観測を行い、Phormidiumのカビ臭発生の 特性およびPhormidium自体の増殖についての分光特性を調べる。また、カビ臭の発生抑制の方法を理論的に確立することを目的とする。 実験・分析方法 これまでの結果、考察 実験1 国環研から分譲してもらったNIES-３０、NIES-５１２、NIES-611を分析可能な細胞数（100万 細胞/ｍｌ）まで増殖させる 実験2 実験1で増殖したそれぞれの株の初期濃度を固定（約1万細胞/ｍｌ）して、同様に100万細胞/ ｍｌまで増殖させる。 実験3 初期濃度を固定（約1万細胞/ｍｌ）して３種類の強度が異なる赤色光、緑色光のもとで培養し、 増殖の様子を観察。 実験A 国環研から分譲してもらったNIES-２５、NIES-27、NIES-2124、NIES-2128、NIES-90、 NIES-512をクリーンベンチを用い滅菌状態で培養する。 培養条件 ＜実験、分析１～３について＞ ・NIES-512以外のサンプルからは２－MIB、ジェオスミンは検出されなかった。現在、NIES-512、 NIES-2128については1週間ごとに、それ以外の主に関しては２週間に１度植え継ぎというペー スが定まってきている。 NIES-30 NIES-611 NIES-512 細胞数（cells/ml) 1.E+06 2 3 A 赤,緑 赤,緑 白 75 25,50,75 － 25 22 12 － CT BG-11 300 25 １日手で１０回程度 約８５回/min 0.E+00 GC-MSによる分析 カビ臭の原因になると考えられている物質 ・２-MIB ・ジェオスミン GC-MSを用いてサンプル中にこれらの物質が含まれているかどうか調べる ＜手順＞ ・スタンダード（２-MIB＋ジェオスミン）：100μｇ/ｍｌを10μｇ/ｍｌまで希釈 ・サンプル：NIES-2124、NIES-2128、NIES-27（寒天培地培養のもの） ・サンプル抽出： 寒天培地にサンプルが生えた状態のままメタノール5ｍｌを注入し30分静置→2-3ｍｌ回収 また、培地についているサンプルをかき取り、湿潤重量をはかる（20ｍｇ程度）。 バイアルに回収した液体とはがしたサンプルを入れ、ボルテックスした後、２００Rで2分遠心分 離する。 クロマトグラフ 240 480 720 経過時間 960 1200 Fig.3 growth curve(experiment-1) N-611 緑色光 赤色光 2.E+06 N-30赤25 N-30赤50 N-30赤75 N-30緑25 N-30緑50 N-30緑75 1000000 細胞数/ｍｌ 800000 1.E+06 600000 400000 200000 0.E+00 0 120 経過時間 240 360 0 1 4 Fig.4 growth curve(experiment-2) 8 10 経過日数 11 16 Fig.5 growth curve(experiment-3-1) N-512赤25 N-512赤50 N-512赤75 N-512緑25 N-512緑50 N-512緑75 2500000 2000000 1500000 1000000 1500000 1000000 500000 500000 0 0 1 2 3 4 経過日数 N-611赤25 N-611赤50 N-611赤75 N-611緑25 N-611緑50 N-611緑75 2000000 細胞数/ｍｌ 分析１ 実験１で増殖した株から液体試料１００ｍｌ、液体試料１００mlをろ過,冷凍処理した試料より光 合成色素分析とGC-MSによるカビ臭物質の分析を行う。 分析２ 実験２において増殖した株を分析１と同様に分析する。 分析A 実験Aにおいて増殖した株をGC-MSを用いてカビ臭物質の分析を行う。 0 Fig.2 experiment-A Fig.1 experiment-1 細胞数（cells/ml) 1 白 75 ＜実験、分析A～について＞ 細胞数/ｍｌ 実験 光の色 光の強度（μMol/㎡/s） 温度（℃） 明暗周期（時間） 培地 一フラスコの培地の量（ｍｌ） フラスコの振倒 ・NIES-３０については白色光では増殖しなかったが赤色光と緑色光で増殖し、特に強い赤色光 での増殖が大きかった。ただし他の種類と比較して増殖し始める時期が遅い。また、NIES-512 については他の種より増殖のピーク時期が早く、赤色光より緑色光で増殖が大きい。NIES-611 はもっとも増殖スピードが早く、赤色光、緑色光共に強い強度の光で大きく増殖した。光合成色 素、カビ臭物質については現在分析中である。 5 Fig.6 growth curve(experiment-3-2) 6 1 2 3 経過日数 4 Fig.7 growth curve(experiment-3-3) （横軸：計測時間 縦軸：総電子量） 左が2-MIB、右がジェオスミン マススペクトル （縦軸：強度 横軸m/e) 上図：２－MIB 下図：ジェオスミン Fig.9 GC-MS analysis (experiment-A-2) Fig.8 GC-MS analysis (experiment-A-1) これからの課題、方針 ＜実験、分析１～３について＞ ・実験２の終了後、実験２において赤色光で培養していたものを緑色光に移し、逆に緑色光で培養していたものは赤色光で培養し、さらに増殖した細胞を同様に分析し、比較によりどのような 培養条件が株の増殖や臭気により影響を与えるか検討する。 ＜実験、分析A～について＞ ・実験１～３と同様に増殖カーブを取り、安定したカーブを求められるようになったら２－MIB、ジェオスミン、NIES-512からゲノムを取り、シークエンスして互いの整合性を検討する。
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