X 線小角散乱法によるタンパク質溶液の評価

X 線小角散乱法によるタンパク質溶液の評価
Characterization of protein solution by small-angle X-ray scattering
引間孝明(生命系放射光利用システム開発ユニット)
Takaaki Hikima (SR Life Science Instrumentation Unit)
[email protected]
構造生物学において機能の解明を目的にタンパク質
の X 線溶液散乱測定の需要が高まっているが、一般に構
造生物学の研究者は X 線小角散乱測定の経験が少ない。
基盤研究部では理研研究者からのタンパク質溶液の X
線小角散乱に対するビームライン利用相談を受け付け
る。寄せられた相談に対して利用コーディネーターと相
談して適切な利用方法を検討する。必要に応じて相談さ
れた研究課題のビームラインでの実験可能性を評価す
るため、コーディネーターの監督のもと相談者と共同で
本課題枠にて予備実験を行なう。予備実験結果より、最
適な研究室・グループを斡旋し共同研究として一般課題
として実行するか、コーディネーターの指導により独自
研究として一般課題として実行するかを判断する。本課
題のもとに行なった実験は以下の通りである。
Swi5-Sfr1 複合体による Rad51 活性化機構の解明
相同組み換え反応は DNA 複製時や二本鎖 DNA 損傷など
の DNA 修復の中心的な反応である。Rad51 などのリコンビ
ナーゼは相同組換えの中心的な反応である DNA 鎖交換
反応を触媒する。細胞内ではリコンビナーゼ単独では機能
せず、メディエーターと呼ばれる相互作用因子が必要であ
り、その一つとして Swi5、Sfr1 が存在する。Swi5 と Sfr1 は
複合体を形成し、Rad51 や DNA と相互作用することで、一
本鎖 DNA-Rad51 フィラメントの安定化や活性化を行う。こ
の制御機構を明らかにするために、Swi5 単独、Swi5-Sfr1
複合体、 Rad51-Swi5-Sfr1 複合体の精製溶液を用いて
SAXS 解析を行った。その結果 Swi5 単独では溶液中で 4
量体を形成していることがわかった。このことは Swi5 の結晶
構造と一致していた。Swi5-ΔNSfr1 の結晶構造が明らかに
なっているが、Swi5 は複合体形成により一本のαへリックス
が折れ曲がり、大きな構造変化を起こしていた。
Swi5-dNSfr1 の SAXS 解析から溶液中でもこのことが示され、
複合体形成により Swi5 が大きな構造変化を起こすことが証
明できた。Sfr1 の N 末端側領域の構造は全く不明であった
が、SAXS 解析からその 180 残基程度の領域がほとんど二
次構造をとっていない天然変性領域であることが示された。
Rad51-Swi5-Sfr1 複合体の SAX 解析から、三者複合体形
成にはこの天然変性領域が重要であることがわかった。ま
た Swi5-Sfr1 結合により、Rad51 のフィラメントの溝が観察さ
れにくくなっていることから、Swi5-Sfr1 は Rad51 フィラメント
の溝にはまるような形で相互作用することが示唆された。
Na+/K+-ATPase 多量体の評価：Na+/K+-ATPase は細胞膜輸
送系の膜貫通タンパク質である。K+濃度に依存して多量
体構造を持つことが得られている。小角散乱測定によっ
て K+存在下および非存在下の溶液構造を推定した。
Dectin-1 の糖鎖結合様式の評価：Dectin-1 は膜タンパ
ク質で糖鎖を認識する膜外ドメインを持つ。糖鎖受容体
ドメインのβグルカン結合様式の解析を試みた。
Research Infrastructure Group provided consultation for
characterization of protein solution by small angle X-ray
scattering. We considered the adequacy of the
characterization measurement in RIKEN Structure Biology
Beamline I with our coordinators. In this project, we did
several preliminary experiments as follows.
Structural study for Rad51 activation mechanism by
Swi5-Sfr1
HR plays a central role in the repair of normal DNA
replication, DNA double-strand break and collapsed
replication fork. HR is promoted by recombinase, such as
Rad51. Recombinase is regulated by various interactants
called mediators. Swi5-Sfr1 complex is one of the mediator
and interact Rad51 directly and stabilize and activate Rad51
filament. To analyze the regulation mechanism of Rad51
activity by Swi5-Sfr1, we measured small angle X-ray
scattering (SAXS) of Swi5, Swi5-Sfr1, Rad51. Swi5 formed
tetramer in solution. The oligmer structure was consistent
with Swi5 crystal structure, Swi5 formed one a-helix and
four Swi5 chains exist in the asymmetric unit. In crystal
structure of Sw5-dNSfr1(Sfr1 N-terminal region truncated
mutant) complex, Swi5 helix was bended and the complex
formed kinked rod-shaped structure. We also confirmed that
Swi5-dNSfr1 complex formed the unique structure in
solution by SAXS. SAXS measurement shows N-terminal
region of Sfr1 was highly flexible and fully extended
structure, suggested that the region is intrisically disorderd.
The disordered region was important for formation of
tripartite complex. Swi5-Sfr1 activates Rad51 by entering
the groove of Rad51 filament.
Characterization of multimeric complex of Na+/K+-ATPase:
Na+/K+-ATPase is a membrane-spanning protein in the cell
membrane transportation system. The enzyme was indicated
to form multimeric complex depending on the concentration
of K+-ion. We tried to characterize the structures of
Na+/K+-ATPase in the solution with and without K+-ion.
Characterization of Dectin-1 complex with carbohydrate
chain: Dectin-1 is a membrane protein including a domain
outside of membrain which recognizes carbohydrate chain.
We tried to characterize the structure of the outside-domain
complex with -glucan.

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