Signal-to-News FT-Raman によるポリペプチドの構造解析 1) IR/Raman Customer News Letter サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社 IR/Raman 営業部 編集発行 ： マーケティング部 M94007 はじめに Key Words y FT-Raman FT-IRやFTラマン分光法により、種々のタンパク質や合成ポ y 近赤外レーザ リペプチドのコンホメーションが検討され、最近では波形解 析による定量的評価も試みられてきている。近赤外光励起 FTラマン分光法は、従来のレーザラマンに比べ蛍光の影響 y ポリペプチド y 二次構造変化 を受けにくく、測定方法も非常に容易である。我々はこれま で、ギ酸処理したポリ（γ－メチル－L－グルタメート） （PMLG）膜表面のFT-IR全反射（ATR）スペクトルから、β構 造などの二次構造を定量的に評価し、処理時間の増加とと もに、また最表面へ近づくとともにそのβ構造含有率が増加 することを明らかにしてきた。2) また、ポリ（β－ベンジル－L －アスパルテート）（PBLA）を加熱処理し、その表面のFT-IR ATRスペクトルから、ω－ヘリックス部分からβ構造の分子 間水素結合が生まれ、これを核にして両ヘリックス部分から 次々と分子鎖間の水素結合が形成されていき、β構造へと 転移していくと推察した。3) 本研究では、上記処理を施したPMLGとPBLAポリペプチド の近赤外FTラマンスペクトルから、それらの二次構造変化を 評価し、膜表面の FT-IR ATRスペクトルの結果と比較検討し た。 実験 PMLGにギ酸を加え、40℃で所定時間処理後、ギ酸を除去 し40℃で真空乾燥を行った。ギ酸処理時間は1、3、5、およ び 1 4 時 間 と し て 、 それぞれPMLG-FA1 、PMLG-FA3、 PMLG-FA5、およびPMLG-FA14とした。一方PBLAの加熱 処理は真空中で行い、150℃で1時間あるいは24時間処理し たものを各々PBLA－H1、PBLA－H2とした。また150℃で1 時間処理して室温まで冷却後、さらに引き続き210℃で1時 間、9時間あるいは24時間加熱処理したものをそれぞれ PBLA－H3、PBLA－H4、PBLA－H5とした。 FTラマン測定には、サーモフィッシャー社製フーリエ変換ラ マン分光装置を用い、1064nmダイオードレーザーを180° 入射で測定した。レーザ光強度は500mW、検出器はGe、分 解能は4cm-1、積算回数は500回とした。また、波形分離を行 図1 PMLGとPBLAのFTラマンスペクトル 結果および考察 図 1 に 、 PMLG と PBLA の FT ラ マ ン ス ペ ク ト ル を 示 し た 。 PBLA の 場 合 、 1657cm-1 に C=O （ ア ミ ド Ⅰ ） 、 1609cm-1 と 1588cm-1 に Benzene ring stretching、1033cm-1と1006cm-1に C-H in-plane bending と C-C in-plane bending motion が認 められた。ラマンスペクトルでは、アミドⅡのピークは小さく観 測されにくく、アミドⅢはC-Hの変角振動と重なった。PBLA では890cm-1、PMLGでは925cm-1付近に見られるピークはα －ヘリックスとランダム構造を含む骨格振動であり、β構造 への転移に伴って顕著に減少することが知られている。 図2および図3に、各処理を施したPMLG－FAとPBLA－H の拡大スペクトルを示した。図2のPMLGの場合、α－ヘリッ クスに基づく925cm-1のピーク強度がギ酸処理時間の増加と ともに減少した。 うためのデコンボリューションプログラムを使用し、各コンホ メーションに対応するピークを検討した。 図2 PMLG, PMLG-FA1, PMLG-FA3, PMLG-F5, PMLG-FA14のFTラマンスペクトル. M94007 サーモフィッシャー サイエンティフィック株式会社 図3 PBLA, PBLA-H1, PBLA-H2, PBLA-H3, PBLA-H4、 PBLA-H5のFTラマンスペクトル. スペクトロスコピー営業本部 IR/Raman 営業部 横浜本社 045-453-9210 さらに、アミドⅠのα－ヘリックスに基づく1657cm-1 付近の ピークが徐々に減少し、β構造に帰属されると思われる 1673cm-1 のピーク強度が増加した。これらの結果は、FT-IR ATR2) によるα－ヘリックスの減少とβ構造の増加の傾向と 一致した。またPBLAの場合は、α－ヘリックスに基づく 890cm-1 付近のピーク強度が加熱処理時間の増加とともに 減少した。さらにアミドⅠのα－ヘリックスに基づく1657cm-1 付近のピークが減少し、PBLA－H1では1675cm-1 に新たな ピークが現われ、PBLA－H3では1679cm-1に少しブロードな シ ン グ ル ピ ー ク と な り 、 さ ら に PBLA － H4 お よ び H5 で は 1681cm-1のピークのみ認められた。これまでFT-IR ATR 2) の 結果から、PBLA－H1ではほぼ100％α－ヘリックス、PBLA －H1でω－ヘリックスが約40%導入され、PBLA－H3では β構造が約25%形成、PBLA－H5では100%β構造になる ことを明らかにしてきた。FTラマンの結果は、これらFT-IR ATRの結果と良く対応しており、すでに得られた定性的結 大阪支店 06-6863-1552 E-mail [email protected] 図4 PMLG(1)ならびにPBLA(2)の二次構造変化 図5 PMLG ならびに PMLG-SFAの顕微FTラマン スペクトル 果 4)､5) と比較検討を加え、アミドⅠラマンバンドのデコンボ リューションを含む波形解析により、コンホメーションの定量 的評価を試みた。結果を図4に示す。 また、PMLGキャストフィルムを一方向からギ酸処理を行い、 その断面の表面部分および内部を顕微ラマンにより 20μmφのスポットで測定を行った。その結果を図5に示 す。表面ではβ構造に基づくピーク、内部ではα構造のま ま構造変化は起きていないことが簡単に確認できる。この手 法により、デプスプロファイルを行い、処理時間と構造変化 の相関を検討中である。 www.thermofisher.co.jp (日本) 文献 1) 西尾・奈良・久後・水谷・西野 www.thermo.com (グローバル) 第43回1994年高分子討論会（九州大学） 予稿集 2) K.Kugo, M.Okuno, K.Kitayama, T.Kitaura, J.Nishino, N.Ikuta, E.Nishio, and M.Iwatsuki, Biopolymers, 32, 197-207（1992）． 3) K.Kugo, T.Chuma, Y.Ohnishi, J.Nishino, and M.Iwatsuki, Chemistry Express, 6, 1021-1024（1991）． 4) E.Nishio, K.Kugo, and J.Nishino, Chemistry Express, 8, 73-76（1993）． 5) E.Nishio, K.Kugo, and J.Nishino, Chemistry Express, 8, 413-416（1993）． ©2007 Thermo Fisher Scientific Inc. All rights reserved. All trademarks are the property of Thermo Fisher Scientific Inc. and its subsidiaries. Specification, terms and pricing are subject to change. Not all products are available in all countries. Please consult your local sales representative for details.
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