0 Titelblatt - ETH E

DISS. ETH NO. 23331
SPINAL NOCICEPTOR P LASTICITY AND INTRINSIC PROPERTIES
OF
DISTINCT DORSAL HORN I NTERNEURON POPULATIONS
A thesis submitted to attain the degree of
DOCTOR OF SCIENCES OF ETH ZURICH
(Dr. sc. ETH Zurich)
presented by
CAROLIN ANNA VON SCHOULTZ
MSc Biology, ETH Zurich
born on March 8, 1986
citizen of Essen, Germany
accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Hanns Ulrich Zeilhofer, examiner
Prof. Dr. Roger Schibli, co-examiner
Prof. Dr. Dr. Oliver Ullrich, co-examiner
2016
SUMMARY
Physiological pain serves a crucial warning function in all higher organisms that protects our body from
dangerous insults. The detection of painful stimuli starts in the periphery, where specialized nerve fibers
sense the nociceptive (i.e., painful) information in the skin and carry it as an electrical signal to the spinal
dorsal horn. There, nociceptive fibers contact a local population of excitatory or inhibitory interneurons
that may filter and modify the signal via local neuronal circuits. The final output is then relayed via longrange projection neurons to higher brain areas, where cortical processing leads to the final perception of
pain. However, in chronic pain conditions, signaling along the nociceptive pathway is dramatically
disturbed. Plastic molecular and structural changes in the periphery and in the spinal dorsal horn lead
to enhanced pain sensitivity (i.e., hyperalgesia) and pain caused by innocuous stimuli (i.e., allodynia). It
is believed that these two classical chronic pain symptoms result to a large extent from a dysfunction of
dorsal horn interneurons. These neurons display a remarkable heterogeneity with respect to their
expression of neurochemical markers, electrophysiological properties, and connectivity that exceeds a
simple distinction based on their neurotransmitter type (i.e., excitatory or inhibitory). Therefore, only a
careful molecular and functional dissection of distinct subpopulations of dorsal horn interneurons will
eventually lead to a general understanding of their role in physiological and pathophysiological
conditions of pain. The recent generation of transgenic reporter mice that fluorescently label inhibitory
(i.e., GABAergic and glycinergic) interneurons of the dorsal horn facilitated assigning distinct
functional properties to these neurons in the spinal neural circuitry. However, a similar tool to define
the contribution of excitatory (glutamatergic) neurons in nociceptive processing was still missing.
In the first part of this thesis, I present an electrophysiological and morphological characterization
of the vGluT2::eGFP bacterial artificial chromosome (BAC)-transgenic reporter mouse from the
GENSAT project. This BAC transgene uses the transcriptional control elements of the vesicular
glutamate transporter vGlut2 to drive selective eGFP expression in glutamatergic neurons. To verify
eutopic expression of eGFP in this mouse line, I performed whole-cell patch-clamp recordings of eGFPpositive superficial dorsal horn neurons. Both the action potential firing pattern and the dendritic tree
morphology of vGluT2::eGFP neurons showed the characteristic properties of spinal excitatory
interneurons. Together with additional immunohistochemical and electrophysiological experiments
performed in the Zeilhofer laboratory, my results demonstrate that vGluT2::eGFP neurons label a
v
Summary
representative subpopulation of dorsal horn glutamatergic neurons. In addition, I here present the first
electrophysiological characterization of a subpopulation of dorsal horn neurons expressing the
neuropeptide cholecystokinin (CCK). Using the same methodology, I validated that CCK-expressing
neurons represent an exciting new glutamatergic subpopulation of interneurons. Both of these mouse
strains will be valuable tools for the future investigation of glutamatergic neurons in spinal nociceptive
circuits.
Both general types of interneurons, excitatory and inhibitory, serve crucial roles in the fine-tuning of
incoming nociceptive information. One means by which neurons can adapt the anterograde neuronal
information flow (i.e., from pre- to postsynapse) is the use of retrograde signaling molecules. In this
regard, the discovery of the endocannabinoid (eCB) system has raised considerable attention over the
last decades. eCBs have been shown to be released from the postsynapse upon neuronal activation, and
signal back to presynaptic cannabinoid (CB)1 receptors in order to reduce further neurotransmitter
release. As all components of the eCB system are present at the nociceptor synapse, an eCB-dependent
short- or long-term depression (STD or LTD) of neurotransmission at nociceptive fibers would be a
prime mechanism for spinally-mediated analgesia.
In the second part of this thesis, I used the vGluT2::eGFP mice together with a Gad67eGFP reporter
mouse line to investigate spinal nociceptor plasticity between nociceptive fibers and glutamatergic or
GABAergic target neurons. I could show that at nociceptor synapses with glutamatergic targets, CB1dependent STD and NMDAR-dependent LTD of neurotransmission take place, and that both forms
of plasticity involve the generation of the major eCB 2-AG. While nociceptors with GABAergic targets
also undergo STD and LTD, the underlying mechanism remains to be revealed. We therefore provide
evidence that plastic changes between nociceptors and glutamatergic or GABAergic interneurons are
mechanistically distinct and may therefore differentially contribute to the spinal processing of
nociceptive information.
The electrophysiological and morphological data presented in this thesis contribute to a better cell
type-specific understanding of the complex actions of dorsal horn neurons during nociceptive
processing.
vi
ZUSAMMENFASSUNG
Physiologischer Schmerz dient als ein äusserst wichtiges Warnsignal in allen höheren Organismen,
welches unseren Körper vor gefährlichen Verletzungen schützt. Die Erkennung eines Schmerzreizes
beginnt in der Peripherie, wo spezialisierte Nervenfasern in der Haut die nozizeptive (d.h. schmerzhafte)
Information aufnehmen und sie als elektrisches Signal in das spinale Hinterhorn leiten. Dort treffen
nozizeptive Fasern auf eine lokale Population exzitatorischer und inhibitorischer Interneuronen, die das
Signal in lokalen neuronalen Schaltkreisen filtern und anpassen können. Der finale Output wird dann
von weitreichenden Projektionsneuronen zu höheren Hirnarealen weitergeleitet, wo dessen kortikale
Verarbeitung zur letztlichen Schmerzwahrnehmung führt. In chronischen Schmerzzuständen hingegen
ist die Übermittlung entlang des nozizeptiven Signalwegs grundlegend gestört. Plastische molekulare
und strukturelle Veränderungen in der Peripherie und im spinalen Hinterhorn führen zu erhöhter
Schmerzempfindlichkeit (Hyperalgesie) und zu Schmerz durch nicht-schmerzhafte Reize (Allodynie).
Es wird angenommen, dass diese beiden klassischen Symptome des chronischen Schmerzes zu einem
grossen Teil auf Fehlfunktion der Interneuronen im Hinterhorn zurückzuführen sind. Diese Neuronen
zeigen eine ausserordentliche Heterogenität, was ihre Expression von neurochemischen Markern, sowie
ihre elektrophysiologischen Eigenschaften und ihre Konnektivität angeht. Diese Komplexität geht weit
über eine einfache Unterscheidung aufgrund ihres Neurotransmittertyps (d.h. exzitatorisch oder
inhibitorisch) hinaus. Deswegen kann nur eine sorgfältige molekulare und funktionale Analyse von
individuellen Subpopulationen von Interneuronen des Hinterhorns langfristig zu einem grundlegenden
Verständnis ihrer Rolle in physiologischen und pathophysiologischen Schmerzzuständen führen. In
letzter Zeit erleichtern transgene Reportermäuse, die die inhibitorischen (d.h. GABAerge und
glycinerge) Interneuronen im Hinterhorn fluoreszent markieren, die Zuordnung spezifischer
funktionaler Eigenschaften im spinalen neuronalen Schaltkreis. Ein entsprechendes Werkzeug, um den
exzitatorischen (d.h. glutamatergen) Beitrag in nozizeptiven Prozessen zu untersuchen, fehlte bisher
jedoch.
Im ersten Teil dieser Dissertation präsentiere ich eine elektrophysiologische und morphologische
Charakterisierung der vGluT2::eGFP „bacterial artifical chromosome“ (BAC)-transgenen Reportermaus
des GENSAT-Projekts. Dieses BAC-Transgen nutzt die transkriptionellen Kontrollelemente des
vii
Zusammenfassung
vesikulären Glutamattransporters vGluT2, was die selektive eGFP-Expression in glutamatergen
Interneuronen ermöglicht. Um die korrekte eGFP-Expression in dieser Mauslinie zu testen, habe ich
elektrophysiologische Ganzzellableitungen von eGFP-positiven, oberflächlichen Hinterhornneuronen
durchgeführt. Sowohl das Feuerverhalten als auch die Morphologie des Dendritenbaums von
vGluT2::eGFP-Neuronen zeigten alle Charakteristika von spinalen exzitatorischen Interneuronen.
Zusammen mit zusätzlichen immunohistochemischen und elektrophysiologischen Experimenten aus
dem Zeilhofer-Labor zeigen meine Ergebnisse, dass vGluT2::eGFP-Neuronen eine repräsentative
Subpopulation glutamaterger Interneuronen markieren. Darüber hinaus zeige ich die erste
elektrophysiologische
Charakterisierung
einer
Subpopulation
von
Hinterhornneuronen,
die
Cholecystokinin (CCK) exprimieren. Analog zu den vGluT2::eGFP-Experimenten habe ich CCKexprimierende Neuronen als eine interessante, neue, glutamaterge Subpopulation von Interneuronen
validiert. Beide Mäusestämme werden von grossem Wert sein, um zukünftig die Rolle von
glutamatergen Interneuronen in spinalen, nozizeptiven Schaltkreisen zu untersuchen.
Sowohl exzitatorische als auch inhibitorische Interneuronen haben eine entscheidende Rolle in der
Feinjustierung von eingehender, nozizeptiver Information. Ein Weg, wie Neuronen den anterograden
neuronalen Informationsfluss (d.h. von Prä- nach Postsynapse) anpassen können, ist durch die Nutzung
von retrograden Signalmolekülen. In diesem Zusammenhang hat die Entdeckung des Endocannabinoid
(eCB)-Systems in den letzten Jahrzehnten viel Aufmerksamkeit auf sich gezogen. Es wurde gezeigt,
dass eCB nach neuronaler Aktivität von der Postsynapse freigesetzt werden und auf präsynaptische
Cannabinoid (CB)1-Rezeptoren rückkoppeln, um weitere Neurotransmitterfreisetzung zu reduzieren.
Da alle Komponenten des eCB-Systems an der nozizeptiven Synapse vorhanden sind, wäre eine eCBvermittelte Kurz- oder Langzeitdepression (short/long-term depression, STD oder LTD) von synaptischer
Transmission ein geeigneter Mechanismus für spinale Analgesie.
Im zweiten Teil dieser Dissertation nutzte ich die vGluT2::eGFP Mauslinie zusammen mit einer
Gad67eGFP-Reportermauslinie um spinale Plastizität an Synapsen zwischen nozizeptiven Fasern und
jeweils glutamatergen oder GABAergen postsynaptischen Neuronen zu untersuchen. Ich konnte zeigen,
dass an nozizeptiven Synapsen mit glutamatergen Postsynapsen CB1-vermittelte STD und NMDARabhängige LTD ausgelöst wurde. Beide Formen synaptischer Plastizität beinhalteten die Synthese des
bedeutenden Endocannabinoids 2-AG. Obwohl an nozizeptiven Fasern mit GABAergen Postsynapsen
ebenfalls STD und LTD ausgelöst wurden, muss hier der zugrundeliegende Mechanismus noch
viii
Zusammenfassung
ermittelt werden. Wir zeigen somit, dass plastische Veränderungen zwischen nozizeptischen Fasern mit
glutamatergen und GABAergen Interneuronen mechanistisch unterschiedlich sind. Sie könnten daher
auf unterschiedliche Weise zur spinalen Prozessierung nozizeptiver Information beitragen.
Die elektrophysiologischen und morphologischen Daten, die in dieser Dissertation präsentiert
werden, tragen somit zu einem besseren Zelltyp-spezifischen Verständnis der komplexen Aktionen von
Hinternhornneuronen während der Schmerzverarbeitung bei.
ix

Download Report