Entwicklung und Evaluation eines neuen Verfahrens zur multiplexen

Entwicklung und Evaluation eines neuen Verfahrens
zur multiplexen SNP-Analytik auf der Basis der Luminex-Technologie
Ziel des geplanten Projektes ist es ein Verfahren auf der Basis der neuen LuminexTechnologie zu entwickeln und zu evaluieren, das es erlaubt, mehrere genetische
Polymorphismen (Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs) in Blutproben von
Patienten gleichzeitig nachzuweisen. Das geplante Nachweisverfahren soll so
aufgebaut sein, daß zunächst kurze Bereiche in der Umgebung bekannter SNPs mit
Hilfe einer multiplex-PCR aus Patientenblut amplifiziert werden. Diese Amplifikate
sollen als Ausgangsmaterial für die eigentliche Analytik dienen. Die Grundlage des
Primer-Extension-Verfahrens bilden synthetische Oligonukleotid-Sonden (Primer).
Jeder Primer soll so konstruiert werden, daß er jeweils komplementär zum
unmittelbaren Umfeld des zu untersuchenden SNPs ist und am 3'-Ende mit
demjenigen Nukleotid endet, das komplementär zu einem der bekannten SNP-Allele
ist. Am 5'-Ende des Primers soll ein sogenannter "Universal Tag" (eine sonst
nirgends vorkommende Nukleotid-sequenz) angehängt werden, der der späteren
Auswertung der Reaktionsergebnisse dient. Der Primer soll dem Amplifikat der PCRReaktion zugegeben und mit diesem hybridisiert werden. Als weiteres Substrat für
die Nachweisreaktion sollen mit Cyanin-3 (Cy3) fluoreszenzmarkierte
Didesoxynukleosid-Triphosphate (ddNTPs) zugegeben werden. Ist nun das zum
verwendeten Primer komplementäre SNP-Allel in der Probe enthalten, so kann das
3'-Ende des Primers vollständig an das entsprechende Amplifikat binden und wird
von der in der PCR-Reaktion enthaltenen DNA-Polymerase durch Anhängen eines
Cy3-ddNTPs fluoreszenzmarkiert (Primer-Extension). Falls das SNP-Allel, das nicht
zum verwendeten Primer komplementär ist, in der Probe enthalten ist, kann diese
Fluoreszenz-markierung nicht erfolgen. Dieses Verfahren soll mit mehreren Primern
gleichzeitig durchgeführt werden, wobei jeder Primer einen anderen SNP erkennt
und jeweils einen anderen spezifischen Universal Tag am 5'-Ende trägt.
Abschließend soll eine Suspension aus verschiedenen Mikrosphären-Populationen
hinzugegeben werden, bei der jede Population durch einen bestimmten
Fluoreszenzfarbton und einen bestimmten komplementären "Unversal Tag" ("AntiTag") auf der Ober-fläche charakterisiert ist. Anhand ihrer "Tag"- Sequenz können so
die Reaktions-produkte der Primer-Extension-Reaktionen (Primer mit oder ohne
Fluoreszenzmarkierung) spezifisch gebunden und somit sortiert werden. Die
quantitative Auswertung der gebundenen Primer soll dann vollautomatisch ohne
weitere Reinigungsschritte im Luminex100-Analysegerät erfolgen.
Kontakt: Dr. Ilja Hagen, Telefon: 0941 / 943-5011, Email: [email protected]

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