„Bedeutung des endoplasmatischen Retikulums für die mRNA

Aus dem Institut für Vegetative Physiologie
der Medizinischen Fakultät Charité – Universitätsmedizin Berlin
DISSERTATION
„Bedeutung des endoplasmatischen Retikulums für die mRNA
Translation unter Hypoxie“
zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)
vorgelegt der Medizinischen Fakultät
Charité – Universitätsmedizin Berlin
von
Jonas J. Staudacher
aus Ravensburg
Datum der Promotion: 26.02.2016
Inhaltsverzeichnis:
ABSTRAKT ....................................................................................................................... 3
ABSTRACT ....................................................................................................................... 5
EIDESSTATTLICHE VERSICHERUNG ............................................................................ 7
AUSFÜHRLICHE ANTEILSERKLÄRUNG AN DER ERFOLGTEN PUBLIKATION .......... 8
AUSZUG AUS DER JOURNAL SUMMARY LIST (ISI WEB OF KNOWLEDGE SM)........ 9
PUBLIKATION...................................................................................................................10
LEBENSLAUF....................................................................................................................56
PUBLIKATIONSLISTE.......................................................................................................58
DANKSAGUNG.................................................................................................................59
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Abstrakt:
Einleitung: Eine herabgesetzte intrazelluläre Verfügbarkeit des Energieäquivalents
Adenosintriphosphat (ATP) ist eine Hauptfolge von Hypoxie, da aufgrund des
Sauerstoffmangels die oxidative Phosphorylierung gehemmt wird. Zellen reagieren
hierauf, indem sie ihren Metabolismus ändern und anaerobe Glykolyse in größerem
Ausmaß als ATP produzierenden Prozess nutzen. Der relative Energiemangel führt zu
einer globalen Unterdrückung der mRNA Translation, welche zu den energieintensivsten
intrazellulären Prozessen gehört. Einige Transkripte entziehen sich jedoch der
allgemeinen Hemmung der Translationsrate und können ihre normale translationelle
Aktivität behalten oder erhöhen diese sogar noch. Verschiede Mechanismen, wie etwa
die „IRES“ (Internal Ribosome Entry Site)-abhängige Translationsinitiation oder eine
Regulation durch „upstream open reading frames“ wurden vorgeschlagen, um die
erhöhte Proteinsyntheserate spezifischer mRNAs unter den Bedingungen einer globalen
Hemmung zu erklären. Eine übergreifende Erklärung, die diese Transkripte als
funktionales Operon kennzeichnet, gab es bisher nicht.
Methodik: Wir untersuchten die Auswirkungen von Sauerstoffmangel (1% O2 vs. 21% O2
für 36 h) auf die mRNA Translation in humanen Fibrosarkomzellen (HT1080). Mittels
qPCR wurde das Niveau von hypoxie-induzierbaren und nicht-hypoxie-induzierbaren
Kandidaten-mRNAs in
verschiedenen
subzellulären
Kompartimenten,
in
denen
Proteinsynthese abläuft, bestimmt. Diese Daten wurden mit dem im Westernblot
dargestellten korrespondierenden Proteinmengen als Annäherung an die nettoGenexpressionsrate verglichen. Die mRNA Translationsrate im zytoplasmatischem
Kompartiment wurde mittels Polysomengradientenanalyse bestimmt. Microarray Daten
der durch Menge und Lokalisation definierten mRNA Subpopulationen ermöglichte uns
eine „gene ontology“ Analyse, und die in silico Suche nach angereicherten cisElementen. Die Funktionalität dieser Elemente wurde durch Reporter-Gen Experimente
überprüft. Fluoresence-in-situ-Hybridisierung (FISH) wurde genutzt, um Ergebnisse zur
mRNA Lokalisation zu verifizieren.
Ergebnisse: Eine spezifische Gruppe von mRNAS zeigt unter Hypoxie eine erhöhte
Präsenz am Endoplasmatischen Retikulum (ER). Transkripte, die sowohl in ihrer
Gesamtmenge als auch in ihrer Lokalisation am ER unter Hypoxie erhöht waren, zeigten
eine Anreicherung von Genen, die den Signalwegen „response to hypoxia”, “glycolysis”
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und “HIF-1alpha transcription factor network” zugehören. Die 5`- und 3`- untranslatierten
Regionen (UTRs) dieser mRNAs zeigen einen hohen Grad an Konservierung und eine
unterdurchschnittliche Anzahl von „upstream initiation codons“ (uAUG). Spezifische cisElemente in den UTRs dieser mRNAs sind mit einer erhöhten Translationsrate unter
Hypoxie assoziiert, welche mit einer vermehrten Lokalisation am ER korreliert.
Fazit: Die Regulation der sub-zellulären Lokalisation spezifischer Transkripte stellt einen
neuen Mechanismus dar, der unter den Bedingungen einer globalen Hemmung der
mRNA Translation entscheidend für die Proteinsyntheserate ist. Wir identifizierten das
ER als subzelluläres Kompartiment, in dem unter Sauerstoffmangel induziertem
Hypometabolismus die mRNA Translation bevorzugt abläuft, während die Synthese an
freien (zytoplasmatischen) Polysomen gehemmt wird.
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Abstract:
Introduction: One major consequence of hypoxia is reduced intracellular energy
availability. Cells react by adjusting their metabolism, favoring anaerobic glycolysis as
an adenosine triphosphate (ATP) producing process. Lowered energy levels also lead
to a global inhibition of mRNA translation, which represents the most energy-intensive
cellular process. Nevertheless, specific transcripts elude this global translational
repression, and maintain or even increase their translational activity. Several
mechanisms, including internal ribosome entry sites (IRES) dependent initiation of
translation and regulation through upstream open reading frames, were proposed in
order to explain elevated protein synthesis of specific mRNAs under conditions of global
translational suppression. However, no clear consensus on how to explain effective
mRNA translation in hypoxia has been reached yet.
Methods: We investigated mRNA levels of hypoxia inducible or non-inducible gene
candidates via qPCR in different subcellular compartments which are associated with
protein synthesis during long term hypoxia (1% O2 vs. 21% O2 for 36 h) in human
fibrosarcoma cells (HT1080). Protein levels were detected by Western blot analysis to
estimate the net outcome of protein synthesis relative to the respective mRNA level.
Polysomal gradient analysis was performed to analyze the translational efficiency of
mRNAs in the cytosolic compartment. Microarray data of RNA subpopulations defined
by their subcellular localization were used to perform a gene ontology analysis, and for
an in silico search for enriched cis-elements. We verified the functionality of these
elements by reporter-gene assays. Fluoresence-in-situ-hybridisation (FISH) was used to
verify our findings of alterations of mRNA localization.
Results: A specific subset of transcripts shows an increased presence at the
endoplasmic reticulum (ER) which is associated with ongoing translation during
hypoxia. Transcripts up-regulated at the expression level as well as their ER localization
belong to crucial hypoxia related gene groups such as “response to hypoxia”,
“glycolysis”, and “HIF-1alpha transcription network”. Both the 5`- and 3`- untranslated
regions (UTRs) of these mRNAs show a high conservation among species, and an
upstream initiation codon (uAUG) count below average. We identified enriched ciselements in the UTRs of these transcripts that are associated with an increased rate of
mRNA translation in hypoxia that is attributed to selective mRNA localization at the ER.
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Summary: We show that subcellular partitioning of specific transcripts represents a
novel mechanism for the adaptation of gene expression during hypoxia. We identified
the ER as a crucial compartment for the control of translational activity of transcripts
encoding
survival
factors
during
hypoxia
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induced
hypometabolism.
Eidesstattliche Versicherung
„Ich, Jonas J. Staudacher, versichere an Eides statt durch meine eigenhändige
Unterschrift, dass ich die vorgelegte Dissertation mit dem Thema: „Bedeutung des
endoplasmatischen Retikulums für die mRNA Translation unter Hypoxie“ selbstständig
und ohne nicht offengelegte Hilfe Dritter verfasst und keine anderen als die angegebenen
Quellen und Hilfsmittel genutzt habe.
Alle Stellen, die wörtlich oder dem Sinne nach auf Publikationen oder Vorträgen anderer
Autoren beruhen, sind als solche in korrekter Zitierung (siehe „Uniform Requirements for
Manuscripts (URM)“ des ICMJE -www.icmje.org) kenntlich gemacht. Die Abschnitte zu
Methodik
(insbesondere
praktische
Arbeiten,
Laborbestimmungen,
statistische
Aufarbeitung) und Resultaten (insbesondere Abbildungen, Graphiken und Tabellen)
entsprechen den URM (s.o.) und werden von mir verantwortet.
Mein Anteil an der ausgewählten Publikation entspricht dem, der in der untenstehenden
gemeinsamen Erklärung mit dem Betreuer, angegeben ist.
Die Bedeutung dieser eidesstattlichen Versicherung und die strafrechtlichen Folgen einer
unwahren eidesstattlichen Versicherung (§156,161 des Strafgesetzbuches) sind mir
bekannt und bewusst.“
Datum
Unterschrift
7
Ausführliche Anteilserklärung an der erfolgten Publikation
Publikation:
J.J.Staudacher,
I.S.Naarmann-de
Vries,
S.J.Ujvari,
B.Klinger,
E.Benko,A.Ostareck-Lederer, D.H.Ostareck, A.B.Persson,S.Lorenzen,
N.Blüthgen, P.B.Persson, A.Henrion-Caude, R.Mrowka & M. Fähling.
M.Kasim,
J.C.Meier,
„Hypoxia-induced gene expression results from selectiv RNA partitioning to the
endoplasmic reticulum“.
Nucleic Acids Research (2015). 43(6):3219-36. doi: 10.1093/nar/gkv167
Beitrag im Einzelnen:
Durchführung der Polysomengradientenanalyse und anschlieβende Analyse der mRNA
Niveaus (qPCR) der Gene P4HA1, P4HB, HIF1A, ACTB und BLID in den
Polysomengradientfraktionen (Figure 1, S1).
Etablierung und Verifizierung der subzellulären Fraktionierung (ER-Isolation) (Figure S3).
Quantifizierung der Kandidaten-mRNAs in den zellulären Fraktionen (Gesamt-RNA,
Cytosol, ER) (Figure 2, S2).
Westernblotanalyse der Proteinniveaus von P4HA1, P4HB, HIF1A, ACTB und BLID
(Figure S4).
Reportergenessays zur Verifizierung der Funktionalität der im Microarray angereicherten
cis-Elemente (Figure 7).
Diskussion der Daten und Unterstützung bei dem Versuchsdesign.
Mitwirkung an der Erstellung des Manuskripts.
Unterschrift
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Auszug aus dem ISI Web of Knowledge™
Nucleic Acids Research: Position 22 out of 291 Journals in “BIOCHEMISTRY & MOLECULAR
BIOLOGY” (top 10%)
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Publikation
J.J.Staudacher, I.S.Naarmann-de Vries, S.J.Ujvari, B.Klinger, M.Kasim, E.Benko,A.OstareckLederer, D.H.Ostareck, A.B.Persson,S.Lorenzen, J.C.Meier, N.Blüthgen, P.B.Persson, A.HenrionCaude, R.Mrowka & M. Fähling.
„Hypoxia-induced gene expression results from selectiv RNA partitioning to
the endoplasmic reticulum“.
Nucleic Acids Research (2015).
http://dx.doi.org/10.1093/nar/gkv167
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Lebenslauf
Mein Lebenslauf wird aus datenschutzrechtlichen Gründen in der elektronischen Version meiner
Arbeit nicht veröffentlicht.
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Publikationsliste:
Wissenschaftliche Artikel:
Staudacher,J.J., I.S.Naarmann-de Vries, S.J.Ujvari, B.Klinger, M.Kasim, E.Benko, A.OstareckLederer, D.H.Ostareck, A.Bondke Persson, S.Lorenzen, J.C.Meier, N.Blüthgen, P.B.Persson,
A.Henrion-Caude, R.Mrowka, and M.Fähling.
“Hypoxia-induced gene expression results from selective mRNA partitioning to the endoplasmic
reticulum.”
Nucleic Acids Research (2015). 43(6):3219-36.
IF: 8,8
Kasim, M., E.Benko, A.Winkelmann, R.Mrowka, J.J.Staudacher, P.B.Persson, H.Scholz,
J.C.Meier & M.Fähling.
„Shut Down of Achaete-Scute Homolog-1
Ribonucleoprotein (hnRNP)-A2/B1 in Hypoxia”
Expression
by
Heterogeneous
Journal of Biological Chemistry (2014). 289(39):26973-88.
Nuclear
IF: 4,6
Kongressbeiträge:
Staudacher JJ, Naarmann-de Vries IS, Ujvari SJ, Klinger B, Kasim M, Benko E, OstareckLederer A, Ostareck DH, Persson PB, Mrowka R & Fähling M.
“Transcriptome partitioning for mRNA translation in hypoxia”
10th International Luebeck Conference on the Pathophysiology and Pharmacology of
Erythropoietin and other Hemopoietic Growth Factors. (2015) Lübeck, Germany.
Staudacher JJ, Ujvári SJ, Kasim M, Klinger B, Mrowka R, Persson PB & Fähling M.
“Adaptation of gene expression in hypoxia by shifting the site of mRNA translation”
Kongress der Deutschen Physiologischen Gesellschaft. (2012) Dresden, Germany.
Fähling M, Staudacher JJ, Gardow SJ & Kasim M.
“Sustained mRNA translation in hypoxia: A matter of localized protein synthesis?”
EMBO Conference Series: Protein Synthesis and Translational Control. (2011) EMBL Heidelberg,
Germany.
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Danksagung:
Zuerst möchte ich meinem Doktorvater, Herrn Prof. Dr. Michael Fähling für die
ausgezeichnete Betreuung meiner Arbeit danken. Seine Offenheit gegenüber neuen
Ideen, sein Glaube an hierarchiearmes, wissenschaftliches Argumentieren und das Maβ
an Freiheit, das er mir zubilligte, um meine eigenen Fehler zu begehen, gaben mir in
Kombination die beste wissenschaftliche Ausbildung, die ich mir vorstellen kann.
Ich danke außerdem Dr. Frank Wenke und Dr. Edgar Benko, die mir mit ihrer Geduld und
ihrer Freundschaft halfen, diese Arbeit abzuschlieβen.
Meiner Frau Franziska will ich für ihre Unterstützung danken. Gemeinsam mit ihr sind
große Herausforderungen nicht bedrohlich, und meine Tage stets sonniger.
Schlussendlich danke ich meinen Eltern, Eva und Thomas, und meinen Geschwistern,
Dawid, Jura, Olga und Rune; ohne sie wäre ich nicht wer ich bin.
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