Ausarbeitung des Seminars: Co-Kultivierung von Escherichia coli

Ausarbeitung des Seminars:
Co-Kultivierung von Escherichia coli und Saccharomyces
cerevisiae zur Paclitaxel-Synthese
Zhou, K., Qiao, K., Edgar, S. & Stephanopoulos, G. Distributing
a metabolic pathway among a microbial consortium enhances
production of natural products. Nature Biotechnology 33,
377–383 (2015).
Einleitung
Auf der Suche nach neuen Wirkstoffen, die therapeutisch, unter anderem gegen Krebs, eingesetzt
werden können, stellt man häufig fest, dass viele solcher Stoffe in Pflanzen gefunden werden können
[2]. Ein Beispiel für einen solchen Wirkstoff ist der Antikrebswirkstoff Paclitaxel. Auf Folie 2 ist die
chemische Struktur dieses Moleküls dargestellt. Anhand dieser Abbildung kann man bereits
erkennen, dass es sich hierbei um ein sehr komplexes Molekül handelt.
Obwohl dieser Wirkstoff bereits aus Pflanzen gewonnen bzw. in Pflanzenzellen produziert werden
kann [3], wäre eine heterologe Produktion in Mikroorganismen vorteilhaft, um eine robuste und
nachhaltige Produktion zu ermöglichen. Für eine solche heterologe Produktion gäbe es zwei
naheliegende Möglichkeiten, zum einen Bakterien und zum anderen Hefen, wobei es in beiden
Systemen bestimmte Probleme gibt. In Bakterien ist es allgemein schwierig komplexe eukaryotische
Enzyme, welche für die Synthese von komplexen Molekülen wie Paclitaxel (siehe Folie 2) benötigt
würden, funktional zu exprimieren [4]. Auf der anderen Seite ist es in Hefen schwierig eine hohe
Ausbeute bei der Produktion von Bausteinen natürlicher Produkte zu erreichen.
Um diese Probleme zu überwinden, war die Idee in der hier vorgestellten Veröffentlichung,
Mikroorganismen in einem Konsortium zu kultivieren, um damit die Vorteile der Einzelorganismen
auszunutzen, während ihre Nachteile ausgeglichen werden. Für den Ausbau eines solchen
Konsortiums gibt es im Allgemeinen viele verschiedene Möglichkeiten. Eine erste Möglichkeit, die
bereits häufiger untersucht wurde, ist eine Interaktion der Spezies, indem die eine Spezies
ausschließlich die Kohlenstoffquelle für die zweite Spezies zur Verfügung stellt. In dieser
Veröffentlichung wurde allerdings darüber hinaus ein vollständiger Stoffwechselweg auf die zwei
Spezies aufgeteilt, wobei eine Spezies ein metabolisches Zwischenprodukt synthetisiert, welches in
die zweite Spezies diffundiert und dort weiter funktionalisiert wird. Umgesetzt wurde diese Idee,
indem mit Hilfe von zwei Modellmikroorganismen ein Vorläufermolekül von Paclitaxel produziert
wurde. Bei dem ersten Mikroorganismus, der dabei verwendet wurde, handelte es sich um E. coli.
Dieser wurde verwendet um Taxadien, das Grundgerüstmolekül von Paclitaxel, herzustellen. Bei dem
zweiten Mikroorganismus handelte es um S. cerevisiae, welche verwendet wurde, um Taxadien
durch eine Oxygenierungsreaktion mit Hilfe eines Cytochrom P450 (CYP) weiter zu funktionalisieren.
Auf diese Weise sollte die schnelle Produktion von Taxadien in E. coli und die effiziente Oxygenierung
in S. cerevisiae kombiniert werden.
Co-Kultur Design
Beim Design der Co-Kultur wurden verschiedene Konzepte entwickelt und getestet. Als Erstes wurde
dabei ein kompetitives Design genauer untersucht (siehe Folie 6). In diesem Fall nutzen sowohl E. coli
als auch S. cerevisiae Glukose als Kohlenstoffquelle. Taxadien wird von E. coli produziert, diffundiert
in S. cerevisiae und wird dort oxygeniert. Bei weiterer Untersuchung der Ergebnisse stellte sich hier
allerdings heraus, dass S. cerevisiae Ethanol produzierte, welches das Wachstum von E. coli
inhibierte. Trotz dieser Tatsache konnten in dieser Co-Kultur oxygenierte Taxane produziert werden,
wie die Abbild auf Folie 6 zeigt. Die Hypothese, dass das von S. cerevisiae produzierte Ethanol das
Wachstum von E. coli inhibierte, konnte damit belegt werden, dass E. coli in der Co-Kultur deutlich
schwächer wuchs als in einer reinen E. coli Kultur und dass sich das extrazelluläre Ethanol in der CoKultur anreicherte (Folie 7). Ein Problem, dass sich daraus ergab, war dass die insgesamt Menge an
Taxanen, also Taxadien und oxygenierte Taxane, in der Co-Kultur deutlich verringert war als in einer
reinen E. coli Kultur. Um dieses Problem zu lösen wurde ein neues Co-Kultur Design entwickelt.
Die Idee dieses neuen Designs für die Co-Kultur basierte auf der Idee einer mutualistischen
Interaktion der Mikroorganismen untereinander (Folie 8). Dazu wurde das Substrat Glukose durch
Xylose ersetzt, welche nur von E. coli als Kohlenstoffquelle genutzt werden kann. Dabei produziert E.
coli Taxadien und Acetat. Dieses Acetat kann wiederum von S. cerevisiae als Kohlenstoffquelle
genutzt werden. Außerdem konnten erneut oxygenierte Taxane produziert werden. Auf diese Weise
konnte erreicht werden, dass beide Mikroorganismen voneinander profitieren bzw. voneinander
abhängig sind, da S. cerevisiae das Acetat verwendet, welches ansonsten in zu hohen
Konzentrationen das Wachstum von E. coli inhibieren würde. Ein weiterer Vorteil ist, dass in dieser
Konfiguration kein Ethanol von S. cerevisiae produziert wird.
Anhand der Ergebnisse (Folie 9) konnte gezeigt werden, dass in dieser Co-Kultur Konfiguration das
extrazelluläre Acetat, welches sich in einer reinen E. coli Kultur anreichert, in der Co-Kultur nach
einem kurzen Anstieg abnimmt. Diese Verzögerung ist vermutlich darauf zurückzuführen, dass S.
cerevisiae zuerst eine gewisse Zelldichte erreichen musste. Außerdem konnte gezeigt werden, dass
der zusammengefasste Titer von Taxanen in diesem Co-Kulturdesign nicht deutlich geringer war als in
einer reinen E. coli Kultur, wobei allerdings ein weiteres Problem identifiziert wurde, die geringe
Oxygenierungseffizienz. Von den ungefähr 50 mg/L produzierten gesamten Taxanen sind nur
ungefähr 4 mg/L oxygenierte Taxane.
Optimierung der Taxadien Oxygenierung
Um das Problem der geringen Oxygenierungseffizienz zu lösen, wurden mehrere Schritte
durchgeführt. In einem ersten Schritt wurde das Inokulum erhöht und periodisch wichtige Nährstoffe
zugeführt, um allgemein das Wachstum von S. cerevisiae zu verbessern und damit auch die Menge an
oxygenierten Taxanen zu erhöhen. Auf diese Weise konnte bereits eine Verdreifachung des Titers an
oxygenierten Taxanen auf 16 mg/L erreicht werden. In einem zweiten Schritt wurde anschließend ein
stärkerer Promotor für das Gen des CYP-Enzyms eingebaut, wodurch der Titer an oxygenierten
Taxanen weiter auf 25 mg/L erhöht werden konnte. Der dritte Schritt bestand darin, E.coli
gentechnisch so zu manipulieren, dass mehr Acetat produziert wird, welches wiederum als Substrat
für S. cerevisiae dient. Die Idee dabei war, dass in E. coli das Gen atpFH ausschaltet wurde, welches
an der oxydativen Phosphorylierung beteiligt ist. Auf diese Weise sollte den Zellen die primäre Quelle
von ATP entzogen werden, weshalb die Zellen eine andere Möglichkeit der ATP-Gewinnung
benötigen, beispielsweise die Produktion von Acetat (Folie 11). Anhand der Ergebnisse (Folie 12)
konnte gezeigt werden, dass mit Hilfe des Gen-Knockouts in E. coli das Wachstum von S. cerevisiae
tatsächlich erhöht werden konnte, wodurch wiederum der Titer an oxygenierten Taxanen auf 33
mg/L erhöht werden konnte. Insgesamt konnte damit eine Oxygenierungseffizienz von ungefähr 75 %
erreicht werden.
Produktion von monoacetylierten, dioxygenierten Taxanen
Das entwickelte Co-Kultur Design wurde weiter untersucht, indem versucht wurde, ob auch
komplexere Vorläufermoleküle produziert werden können. Dazu wurden in S. cerevisiae weitere
Enzyme exprimiert, welche eine Acetylierung an der C-5α Position und eine weitere Oxygenierung an
der C-10β Position durchführen sollten. Das damit produzierte Molekül konnte in einer HPLC
nachgewiesen werden. In diesem Fall musste damit nur das Hefe-Modul verändert werden, um auch
komplexere Moleküle in der Co-Kultur produzieren zu können.
Produktion von anderen oxygenierten Produkten durch die Co-Kultur
In einem nächsten Schritt wurde untersucht, ob das entwickelte Co-Kultur Design auch zur
Produktion anderer Stoffe verwendet werden könnte. Eine Voraussetzung hierfür wäre lediglich, dass
ein Zwischenprodukt bei der Produktion des Endproduktes Zellmembranen überwinden kann. Dies
wurde gezeigt, indem zwei andere Stoffe, Ferruginol mit Miltiradien als Zwischenprodukt das
Zellmembranen
überwinden
kann
und
Nootkaton
mit
Valencen
als
entsprechendem
Zwischenprodukt, mit Hilfe der Co-Kultur produziert werden können. Dabei konnte ein Ferruginol
Titer von bis zu 18 mg/L und ein Nootkaton Titer von bis zu 4 mg/L erreicht werden. Allgemein
mussten in diesen Beispielen wieder nur die entsprechenden Enzyme für die Produktion des
jeweiligen Stoffes bzw. Zwischenproduktes in E. coli und S. cerevisiae exprimiert werden.
Fazit
In der hier vorgestellten Veröffentlichung konnte eine mutualistische Co-Kultur von E. coli und S.
cerevisiae entwickelt werden, indem eine Zusammenarbeit bzw. Abhängigkeit der Mikroorganismen
erzwungen wurde. Außerdem konnte der Stoffwechselweg für die Produktion komplexer Stoffe in
zwei Module aufgeteilt werden, welche auf die zwei Mikroorganismen der Co-Kultur verteilt wurden,
wodurch die Vorteile der verschiedenen Spezies ausgenutzt werden konnten. Dadurch konnten
wiederum komplexe, natürliche Moleküle produziert werden, welche zu diesem Zeitpunkt noch nicht
effizient in einzelnen Mikroorganismen hergestellt werden konnten.
Literatur:
[1] Zhou, K., Qiao, K., Edgar, S. & Stephanopoulos, G. Distributing a metabolic pathway among a
microbial consortium enhances production of natural products. Nature Biotechnology 33, 377–383
(2015).
[2] Cragg, G. M., Newman, D.J. Plants as a source of anti-cancer and anti-HIV agents. Ann Appl Biol
143, 127–133 (2003).
[3] Frense, D. Taxanes: perspectives for biotechnological production. Appl Microbiol Biotechnol. 73,
1233-1240 (2007).
[4] Chang, M. C. Y., Eachus, R. A., Trieu, W., Ro, D. & Keasling, J. D. Engineering Escherichia coli for
production of functionalized terpenoids using plant P450s. Nature Chemical Biology 3, 274 - 277
(2007).
[5] Kingston, D. G. I. The Shape of Things to Come: Structural and Synthetic Studies of Taxol and
Related Compounds. Phytochemistry 68, 1844-1854 (2007).
[6] Ajikumar, P.K. et al. Isoprenoid pathway optimization for Taxol precursor overproduction in
Escherichia coli. Science 330, 70–74 (2010).

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