GrundpraktikumScriptSS2014

3’- RACE-PCR und Klonierung von MADS-Box-Genen aus Tulpen
Praktikumsteil: „3’- RACE-PCR und Klonierung von MADS-BoxGenen aus Tulpen“
Vorbereitung auf diesen Praktikumsteil:
Organisation 2. Praktikumstag:
-
Für den Bioinformatik-Teil benötigen Sie am 2. Tag dieses Praktikumsteils pro Gruppe einen Laptop.
Installieren Sie das Programm „sequencher“ auf diesem Laptop.
Stellen Sie sicher, dass der Akku vollständig geladen ist (die Anzahl der Steckdosen im Seminarraum
ist begrenzt).
Stellen Sie sicher, dass Sie über das Uni-Netzwerk Zugang zum Internet haben.
Lesen Sie das gesamte Skript als Vorbereitung auf das Praktikum durch. Folgende Fragen sollen Ihnen
helfen sich auf das Praktikum vorzubereiten.
-
Was sind MADS-Box-Gene?
-
Aus welchen Abschnitten besteht die mRNA?
-
Was ist eine cDNA und mit welchen Methoden können cDNA-Sequenzen vervollständigt werden?
-
Was ist eine RACE?
-
Wie funktioniert PCR und welche Faktoren beeinflussen das Ergebnis?
-
Was sind Plasmide? Welche Eigenschaften muss ein Plasmid haben, um als Klonierungsvektor
benutzt werden zu können?
-
Auf welchem Prinzip beruht die Plasmidreinigung mittels der alkalischen Lyse?
-
Was ist „sequence assembly“?
-
Welche Programme gibt es für das „sequence assembly“?
-
Wie funktioniert die Sanger-Sequenzier-Methode mit Fluoreszenzmarkierung?
-
Wie beeinflussen die Parameter „minimum match percentage“ und „minimum overlap“ das
„sequence assembly?“
-
Was ist eine BLAST-Suche und wie funktioniert diese?
-
Welche Informationen können Sie aus der BLAST-Suche über das von Ihnen sequenzierte Gen
gewinnen?
Literatur:
Der Experimentator: Molekularbiologie/Genomics, C. Mühlhardt, Spektrum-Verlag
Molekulare Genetik, R. Knippers, Thieme-Verlag
Allgemeine und Molekulare Botanik, E. Weiler & L. Nover, Thieme-Verlag
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3’- RACE-PCR und Klonierung von MADS-Box-Genen aus Tulpen
Abb. 1: Übersicht über den Ablauf des Praktikumsteil „3’- RACE-PCR und Klonierung von MADS-Box-Genen
aus Tulpen“. Im Praktikum wird Ihnen sowohl das Template für die nested-PCR (3’RACE-PCR-Produkt) als
auch das cDNA-Template für die 3’RACE zur Verfügung gestellt. Umgekehrt als in diesem flow-chart, wird
aus Zeitgründen das erste Experiment die nested-PCR sein.
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3’- RACE-PCR und Klonierung von MADS-Box-Genen aus Tulpen
Einleitung RACE (rapid amplification of cDNA ends)
Die mRNA eines Gens besteht aus einer Protein codierenden Region (coding DNA sequence = cds), die in ein
Protein translatiert wird, den sich im 5‘- und 3‘-Bereich anschließenden nicht-translatierten Regionen (UTR =
untranslated region, Siehe Abb.2), sowie dem 5’-Cap und dem poly-A-Schwanz am 3‘-Ende. In den UTRs
können sich regulatorische Sequenzelemente befinden, aber oft ist von einer mRNA nur die kodierende
Sequenz bekannt. Mit der RACE-PCR kann die vollständige Sequenz der mRNA ermittelt werden.
RACE (rapid amplification of cDNA ends) bedeutet schnelle Amplifikation von cDNA-Enden. Ausgehend von
einer bekannten Sequenz im Transkript wird die Sequenz des 5‘-Endes (5‘-RACE-PCR) bzw. des 3‘-Endes (3‘RACE-PCR) ermittelt.
Abb.2: Schematische Darstellung der Genstruktur und der Struktur der transkribierten mRNA
(Q: https://www.mun.ca/biology/scarr/iGen3_05-12_Figure-L.jpg).
Die mRNA wird aufgrund ihrer Struktur in einer herkömmlichen Polymerase-Kettenreaktion nicht
vervielfältigt (=amplifiziert) und muss demzufolge erst in einer Reaktion in eine DNA-Sequenz umgesetzt
werden (cDNA-Synthese, Siehe Abb. 3). Während der cDNA-Synthese wird eine zur mRNA reverskomplementäre DNA-Sequenz (complementary DNA = cDNA) mit dem Enzym Reverse Transkriptase
synthetisiert. Die Reverse Transkriptase ist eine RNA-abhängige DNA-Polymerase und benötigt für die DNASynthese einen Primer als Startpunkt. Meist wird ein Oligo-dT-Primer (15-25 Desoxythymidine) verwendet,
der komplementär zum Poly-A-Schwanz des 3‘-Endes der mRNA ist und dort bindet. Am Ende der Reaktion
liegt ein RNA-DNA-Hybrid vor, aus dem die RNA dann durch die zusätzliche RNase H-Aktivität der Reversen
Transkriptase abgebaut wird. Am 5‘-Ende des Oligo-dT-Primers schließt sich eine Ankersequenz an, die in der
anschließenden PCR1 (hier 3’RACE-PCR) als Bindestelle für einen Primer genutzt wird. Der zweite Primer
bindet genspezifisch im codierenden Bereich der mRNA-Sequenz (Abb.3).
Oft erhält man nach der ersten Amplifizierungsrunde (3’RACE-PCR) von cDNA noch viele unspezifische PCRProdukte. Der Anteil spezifischer PCR-Produkte kann durch eine nested-PCR (verschachtelte PCR) erhöht
werden. Für eine nested-PCR wird eine geringe Menge des PCR-Produkts aus der ersten Amplifikationsrunde
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3’- RACE-PCR und Klonierung von MADS-Box-Genen aus Tulpen
(3’RACE-PCR) als Template verwendet. Im Gegensatz zu den Primern der 3‘-RACE-PCR binden die Primer der
nested-PCR leicht in 5‘-Richtung versetzt auf dem zu amplifizierenden DNA-Fragment, sodass sie sich in ihrer
Sequenz von den Primern der ersten PCR unterscheiden und dadurch die Spezifität der PCR erhöhen.
(3‘RACE-PCR)
(nested PCR)
Abb. 3: Ablauf von cDNA-Synthese, 3’RACE-PCR und nested-PCR (Q: Protocols & Applicatios Guide,
www.promega.com, rev. 3/11).
Tag 1
Bitte berücksichtigen Sie, dass aus Zeitgründen erst die nested-PCR und dann die 3’RACE-PCR angesetzt
wird, im normalen Ablauf würde man es umgekehrt machen.
1.
Durchführung nested-PCR (= Experiment 1)
1.1. Pipettieren Sie folgende Komponenten in der angegebenen Reihenfolge in ein 0,2 µl PCR-tube auf Eis:
(als Template erhalten Sie vom Betreuer schon vorbereitetes PCR-Produkt)
Komponente
ddH2O
10x Reaktionspuffer
dNTP Mix (je 10 mM)
T127-Ankerprimer (50 µM)
T175-Primer (50 µM)
Template: 1. PCR-Produkt 1:50
verdünnt
Taq (5 U/µl)
Endkonzentration bzw. Menge in
einem Reaktionsansatz
1x
je 200 µM
1 µM
1 µM
variabel
2 U
Endvolumen: 50 µl
Eingesetzte Menge
2 µl
Endvolumen: 50 µl
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1.2. Mischen Sie den Reaktionsansatz und zentrifugieren Sie diesen kurz ab.
1.3. Stellen Sie ihre PCR-Reaktion so lange auf Eis bis das PCR-Programm gestartet wird.
1.4. PCR-Programm:
Bezeichnung
Initiale Denaturierung
Denaturierung
Primer-Annealing
Elongation
Abschließende Elongation
Temperatur [°C]
95
95
58
72
72
15
Zeit
2 min
15 sec
30 sec
1 min
5 min
hold
35 x
1.5. Geben sie zu der PCR-Reaktion 0,2x Volumen DNA-Ladepuffer. Weiter mit Gelelektrophorese im
Punkt 2.6..
2.
Durchführung 3’RACE-PCR (Rapid Amplification of 3’-cDNA Ends) (= Experiment 2)
2.1. Pipettieren Sie folgende Komponenten in der angegebenen Reihenfolge in ein 0,2 µl PCR-tube auf Eis:
Komponente
Endkonzentration bzw. Menge
Eingesetzte Menge
in einem Reaktionsansatz
ddH2O
10x Reaktionspuffer
1x
dNTP Mix (je 10 mM)
je 200 µM
T126-Ankerprimer (50 µM)
1 µM
T176-Primer (50 µM)
1 µM
cDNA Template
variabel
1 µl
Taq (5 U/µl)
2 U
Endvolumen: 50 µl
Endvolumen: 50 µl
2.2. Mischen Sie den Reaktionsansatz und zentrifugieren Sie diesen kurz ab.
2.3. Stellen Sie ihre PCR-Reaktion so lange auf Eis bis das PCR-Programm gestartet wird.
2.4. PCR-Programm:
Bezeichnung
Initiale Denaturierung
Denaturierung
Primer-Annealing
Elongation
Abschließende Elongation
Temperatur [°C]
95
95
58
72
72
15
Zeit
2 min
15 sek
45 min
1 min
5 min
hold
25 x
2.5. Nach der PCR pipettieren Sie 10 µl der PCR in ein neues und gut beschriftetes 1,5 ml Tube für eine spätere
nested-PCR (wird im nächsten Block verwendet).
2.6. Geben sie zu den restlichen 40 µl der PCR-Reaktion 0,2x Volumen DNA-Ladepuffer.
2.7. Gelelektrophorese: Laden Sie die PCR-Produkte auf ein 1%iges Agarose-Gel mit großen Taschen (schon
vorbereitet) und legen Sie für ca. 45 min eine Spannung von 120 V an das Gel. (nicht vergessen:
zusammen mit der nested-PCR auftragen)
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3’- RACE-PCR und Klonierung von MADS-Box-Genen aus Tulpen
2.8. Ausschneiden der DNA-Fragmente aus dem Agarose-Gel (vom Betreuer). DNA im Agarose-Gel kann auf
Eis oder für eine längere Lagerung bei -20°C aufbewahrt werden.
Hinweise zur Auswertung der Gelelektrophorese beider PCR-Produkte (Exp. 1&2):
Wie viele Banden erscheinen auf dem Agarose-Gel für die verschiedenen PCR-Reaktionen? Auf welcher Höhe
liegen die Banden und welche Intensität haben sie? Gibt es Banden mit denen Sie direkt ohne nested-PCR
weiterarbeiten würden?
3.
Aufreinigung (Elution) von DNA-Fragmenten aus dem Agarosegel
(mit dem High Pure PCR Product Purification Kit von Roche Applied Science)
Auflösen des Agarosegel-Stückes:
3.1. Geben Sie zu dem Agarosegel-Stück (ca. 150 mg) 450 µl Binde-Puffer (Tube mit Nr.1).
3.2. Inkubieren Sie das Gel-Stück solange bei 56°C bis es komplett gelöst ist (max. 10 min.). Vortexen
Sie kurz
ca. alle 2 – 3 min während der Inkubationszeit, um den Lösungsvorgang zu
beschleunigen.
3.3. Geben Sie 225 µl Isopropanol (Nr.2) zu der Lösung und vortexen nochmals gründlich. Vor dem
Weiterarbeiten die Lösung kurz abzentrifugieren, damit keine Tropfen mehr am Deckel hängen.
Bindung der DNA an die Säulen:
3.4. Stecken Sie eine Säule in ein Sammel-Tube.
3.5. Geben sie das gelöste Agarosegel aus Schritt 3.3. auf die Säule.
3.6. Inkubieren Sie 1 min bei Raumtemperatur.
3.7. Zentrifugieren Sie für 1 min bei 13 000 x g.
3.8. Geben Sie den Durchfluss in den Flüssigabfall.
Waschen
3.9. Geben Sie 500 µl Wasch-Puffer (Nr.3, mit EtOH) auf die Säule.
3.10. Zentrifugieren Sie für 1 min bei 13 000 x g.
3.11. Geben Sie den Durchfluss in den Flüssigabfall.
3.12. Geben Sie 200 µl Wasch Puffer (Nr.3, mit EtOH) auf die Säule.
Durch den zweiten Waschschritt soll die Reinheit des eluierten Produktes erhöht werden.
3.13. Geben Sie den Durchfluss in den Flüssigabfall.
Elution der DNA von der Säule
3.14. Stecken Sie die Säule in ein neues, gut beschriftetes 1,5 ml-Tube.
(Beschriftung: Gruppennummer, Datum, evtl. an der Seite cDNA-Name notieren)
3.15. Geben Sie 50 µl Elutionspuffer (Nr.4) in die Mitte der Säule, berühren Sie aber nicht die Membran
mit der Pipettenspitze!
3.16. Inkubieren Sie 1 min bei Raumtemperatur.
3.17. Zentrifugieren Sie 1 min bei 13 000 x g.
3.18. Lagerung der PCR-Fragmente bei -20 °C bzw. 4 °C möglich.
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4.
pJET-Klonierung (mit dem CloneJet PCR Cloning Kit von Thermo Scientific)
Die eluierten PCR-Produkte werden in einer Ligations-Reaktion in den Klonierungsvektor pJET1.2/blunt (Abb.4
Vektorkarte) kloniert und der Vektor anschließend in chemokompetente Escherichia coli (E. coli) DH5α-Zellen
transformiert.
Der pJET1.2/blunt Vektor liegt in dem verwendeten Kit schon linearisiert vor, sodass DNA-Fragmente direkt
in den Vektor ligiert werden können. Im Vektor ist das Gen bla(APR) enthalten das eine Ampicillin-Resistenz
vermittelt, damit nur die Zellen auf einem Ampicillin-selektiven Medium überleben, die den Vektor
aufgenommen haben. Des Weiteren trägt der Vektor in der Multiplen Cloning Site (MCS) das Gen eco47IR,
dessen Genprodukt letal für die Bakterienzelle ist. Durch die Ligation eines DNA Fragmentes in die MCS wird
die Sequenz des Gens eco47IR unterbrochen und demzufolge in den Zellen kein letales Genprodukt mehr
hergestellt. Darum wachsen nach der Transformation auf Ampicillin-selektivem Medium nur noch die E. coli
Zellen, welche das rekombinante Plasmid aufgenommen haben. Zellen, die den rezirkularisierten Vektor
(Vektor ohne DNA-Fragment) aufgenommen haben, sterben aufgrund des letalen Genproduktes.
Abb. 4: Vektorkarte und Sequenz der MCS des Vektors pJET1.2/blunt
(Q: http://img.docstoccdn.com/thumb/orig/127225690.png)
4.1. „Blunting Reaction“
Der linearisierte Vektor pJET1.2 hat glatte Enden (sogenannte blunt ends). Da die Taq-Polymerase PCRProdukte mit einem 3‘-dA Überhang produziert, müssen glatte Enden in einer sogenannten „blunting
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reaction“ mittels dem DNA-Blunting-Enzym hergestellt werden. Das DNA-Blunting-Enzym entfernt 3‘Überhänge (Exonukleaseaktivität) und füllt 5‘ Enden auf.
4.1.1. Pipettieren Sie folgenden Ansatz auf Eis:
5 µl
2x Reaction Buffer
2,5 µl
ddH2O
1 µl
eluiertes PCR-Produkt
0,5 µl
DNA Blunting Enzym
4.1.2. Kurz vortexen und abzentrifugieren
4.1.3. Inkubation: 70°C, 5 min
4.1.4. Auf Eis abkühlen
4.2. Ligation
Das blunt-end-PCR-Produkt kann nun in den Vektor pJET1.2 (Siehe Vektorkarte in Abb.4) kloniert werden.
Die enzymatische Verknüpfung der DNA-Enden wird als Ligation bezeichnet und durch das Enzym T4DNA-Ligase realisiert. Der vom Enzym benötigte Kofaktor ATP ist im Puffer schon vorhanden.
4.2.1. Zum Reaktionsansatz aus Schritt 4.1.4. pipettieren Sie folgende Reagenzien auf Eis:
0,5 µl
pJET1.2 blunt Cloning Vector
0,5 µl
T4 DNA Ligase
4.2.2. Kurz vortexen und abzentrifugieren
4.2.3. Inkubation: 22°C, 5 min
4.2.4. Auf Eis abkühlen
5.
Transformation von chemisch-kompetenten E. coli-Zellen (Calciumchlorid-Methode) und Hitzeschock
Manche Bakterienstämme produzieren von Natur aus verschiedenen Kompetenzproteine, die an der
Aufnahme von Fremd-DNA beteiligt sind. Das in der Molekularbiologie häufig verwendete Bakterium E. coli
besitzt nur einen Teil des Kompetenz-Operons und somit keine hohe Affinität Fremd-DNA aufzunehmen. Mit
der Calciumchlorid-Methode werden E. coli-Zellen chemisch kompetent gemacht. Bei der Transformation mit
Hitzeschock bei 42 °C wird kurzfristig die DNA-Membranfluidität erhöht und die Zellen nehmen vermehrt die
DNA aus dem Ligationsansatz auf. Nach kurzem Abkühlen auf Eis werden die Zellen bei 37 °C rekultiviert,
bevor man sie auf selektiven LB-Agarplatten (enthalten Ampicillin) ausplattiert.
Durchführung der Transformation:
5.1. Tauen Sie ein Aliquot (100 µl) chemisch kompetente E. coli- Zellen (Stamm DH5α) auf Eis auf.
5.2. Pipettieren Sie den gesamten Ligationsansatz aus Schritt 4.2 zu den chemokompetenten Zellen.
5.3. Inkubieren Sie den Transformationsansatz 30 min auf Eis.
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5.4. Führen Sie den Hitzeschock durch: Inkubation der Zellen für 2 min bei 42°C.
5.5. Stellen Sie die Zellen nach dem Hitzeschock unmittelbar auf Eis.
5.6. Geben Sie 1 ml LB-Medium zum Transformationsansatz.
5.7. Inkubieren Sie den Transformationsansatz mindestens 30 min bei 37°C.
5.8. Zentrifugieren Sie den Transformationsansatz 1 min bei 8000 x g.
5.9. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette. Benutzen Sie für jeden Transformationsansatz
eine neue Spitze. Sollten Sie ausversehen das Pellet mit pipettieren, wiederholen Sie den Schritt 5.8.
5.10. Resuspensieren Sie das Bakterienpellet in 100 µl LB-Medium.
5.11. Bitte unter der Clean Bench: Plattieren sie 30 µl des Transformationsansatzes auf einer LB-Platte mit
Ampicillin. Der restliche Transformationsansatz wird bei 4°C aufbewahrt.
5.12. Inkubieren Sie die Transformationsplatte über Nacht bei 37°C.
Hinweise zur Auswertung:
Warum müssen Sie die transformierten Zellen auf LB-Platten mit Ampicillin ausplattieren? Wie wirkt
Ampicillin und wie wird die Ampicillinresistenz vermittelt? Welche Kolonien werden nur auf der Platte
wachsen und warum? Sind Satellitenkolonien gewachsen?
Tag 2
6.
Kolonie-PCR
Mittels Kolonie-PCR kann man schnell nach einer Transformation E. coli-Kolonien identifizieren, welche das
gewünschte Plasmidkonstrukt (d.h. Vektor + DNA-Fragment) aufgenommen haben. Für die Kolonie-PCR wird
keine DNA isoliert, sondern es werden ganze E. coli Zellen eingesetzt. Um die DNA aus den Bakterienzellen
freizusetzen, werden die Zellen im vorliegenden Protokoll mittels initialer Denaturierung 7 min bei 94°C
erhitzt. Damit im Anschluss an die PCR noch Klone der untersuchten Kolonie vorhanden sind, wird gleichzeitig
eine Masterplatte angelegt, die zum Wachsen der Klone über Nacht bei 37 °C inkubiert wird.
verwendete Primer:
pJET1.2 for: CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC
pJet1.2 rev: AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG
Es werden 4 Kolonien pro Transformation untersucht.
6.1. Pipettieren Sie folgenden Komponenten in der angegebenen Reihenfolge auf Eis:
Komponente
ddH2O
10x Reaktionspuffer
dNTP Mix (je 10 mM)
pJet 1.2 for (50 µM)
pJet1.2 rev (50 µM)
Homemade Taq (1 U/µl)
Endkonzentration bzw. Menge in
einem Reaktionsansatz
1x
je 200 µM
1 µM
1 µM
1U
Endvolumen: 25 µl
Eingesetzte Menge
Endvolumen: 25 µl
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6.2. Mischen Sie den Master-Mix, zentrifugieren Sie diesen kurz ab und aliquotieren Sie diesen zu je 25 µl in
ein PCR-Tube auf Eis.
6.3. Diesen Schritt unter der Clean Bench durchführen: Picken Sie eine Einzelkolonie mit einer gelben
Pipettenspitze und beimpfen Sie damit eine Masterplatte (LB mit Ampicillin). Anschließend stellen Sie
die Pipettenspitze in ein PCR-Tube mit dem PCR-Mix. Die Masterplatte wird über Nacht bei 37°C
inkubiert.
6.4. PCR-Programm:
Bezeichnung
Initiale Denaturierung
Denaturierung
Primer-Annealing
Elongation
Abschließende Elongation
Temperatur [°C]
94
94
60
72
10
15
Zeit
7 min
30 sek
30 sek
45 sek
5 min
hold
28 x
6.5. Geben sie 0,2x Volumen DNA-Ladepuffer zur PCR.
6.6. Gelelektrophorese: Laden Sie die PCR-Produkte auf ein 1%iges Agarose-Gel mit kleinen Taschen (schon
vorbereitet) und legen Sie für ca. 45 min eine Spannung von 120 V an das Gel.
Hinweise zur Auswertung: Auf welcher Höhe erwarten Sie die DNA-Bande für Ihr PCR-Produkt? Achten
Sie auf die Lage der Primer im Vektor. Finden Sie eine mögliche Erklärung für PCR-Produkte unerwarteter
Größe.
7.
Plasmid-Aufreinigung (mit dem GeneJET™ Plasmid Miniprep Kit von Thermo Scientific)
Von der Transformation aus Schritt 5 wurden je 1 - 2 Kolonien in 2 ml flüssiges LB-Medium mit Ampicillin
in einem Reagenzglas angeimpft und über Nacht bei 37°C und 200 rpm kultiviert. Aus dieser BakterienKultur sollen Sie heute das Plasmid nach dem Prinzip der alkalischen Lyse isolieren. Alle benötigten
Komponenten sind in dem oben erwähnten Kit enthalten.
Die E. coli Kultur wird abzentrifugiert (pelletiert), der Überstand entfernt und das Pellet dann in EDTAhaltigem Puffer resuspendiert. EDTA destabilisiert die Zellwand durch Komplexierung von zweiwertigen
Ionen wie Mg2+, Ca2+. Anschließend werden die Bakterien mit Hilfe von Natriumdodecylsulfat (SDS) lysiert
und die DNA durch NaOH denaturiert. Im Vergleich zu chromosomaler DNA kann die niedermolekulare
Plasmid-DNA nach der Denaturierung wieder renaturieren (allerdings nur, wenn die Denaturierung nicht
zu lange erfolgt). Im anschließenden Neutralisierungsschritt wird das Lysat durch Zugabe von saurem
Kaliumacetat-Puffer neutralisiert. Dabei präzipitieren die denaturierten Proteine und chromosomale
DNA mit dem Kalium-Dodecylsulfat. Die niedermolekulare Plasmid-DNA bleibt in Lösung und kann
renaturieren. Die unlöslichen Komponenten (denaturierte Proteine, hochmolekulare RNA, denaturierte
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chromosomale DNA, bakterieller Zelldebris) werden abzentrifugiert. Im klaren Überstand befindet sich
die Plasmid-DNA.
Der Überstand wird auf ein Säulchen gegeben. Die Plasmid-DNA bindet in Gegenwart von Salzen an das
Säulchen-Material und wird mit Ethanol-haltigen Puffern gewaschen. Zum Schluss wird die Plasmid-DNA
mit Wasser von der Säule eluiert, aufgefangen und die Konzentration bestimmt.
Durchführung der Plasmid-Mini-Präparation:
Pelletierung der Bakterienzellen:
7.1. Geben Sie je 1 ml der E. coli-Kultur in ein frisches 1,5 ml Tube.
7.2. Zentrifugieren Sie für 1 min bei 12 000 x g.
7.3. Pipettieren Sie den Überstand mit einer blauen Pipettenspitze vorsichtig ab und geben Sie den
Überstand in den flüssigen S1-Abfall. Sollten Sie aus Versehen das Pellet mit pipettieren,
pipettieren Sie die Lösung zurück in das Tube und wiederholen Schritt 7.2
Resuspension, Zelllyse und Neutralisiation
7.4. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 250 µl Resuspension-Solution mit RNaseA (Nr.1) durch aufund abpipettieren. Achten Sie darauf, dass das Pellet komplett resuspendiert ist und keine weißen
Zell-Klümpchen mehr vorhanden sind.
7.5. Alkalische Lyse: Geben Sie zu der Lösung mit den resuspendierten Zellen 250 µl Lysis Solution
(Nr.2). Mischen Sie unmittelbar nach Zugabe der Lösung durch viermaliges Invertieren des Tubes.
Invertieren ist das Hin- und Herschwenken des Tubes mit den Fingern - Nicht vortexen! – es
kann zum Scheren der chromosomalen DNA kommen.
Nicht länger als 5 min inkubieren, um eine Denaturierung der Supercoiled Plasmid-DNA zu
verhindern.
7.6. Inkubieren Sie 2 min bei Raumtemperatur.
7.7. Neutralisation: Geben Sie 350 µl Neutralisation-Solution (Nr.3) dazu. Mischen Sie unmittelbar
nach Zugabe der Lösung durch vier- bis sechsmaliges Invertieren des Tubes. Es bildet sich ein
weißes Präzipitat, das die chromosomale DNA und Proteine sowie weitere Zellbestandteile
enthält.
7.8. Zentrifugieren Sie für 5 min bei 12 000 x g.
Reinigung:
7.9. Pipettieren Sie den klaren Überstand auf eine Säule des GeneJET™-Kits.
Vorsicht: nicht das weiße Präzipitat mitpipettieren!
7.10. Zentrifugieren Sie für 1 min bei 12 000 x g.
7.11. Geben Sie den Durchfluss in den Flüssigabfall.
7.12. Geben Sie 500 µl Wash-Solution (Nr.4, mit EtOH) auf die Säule.
Die Waschschritte dienen der Reinigung der Säule von anderen Zellbestandteilen.
7.13. Zentrifugieren Sie für 1 min bei 12 000 x g.
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7.14. Geben Sie den Durchfluss in den Flüssigabfall.
7.15. Geben Sie erneut 500 µl Wash-Solution (Nr.4, mit EtOH) auf die Säule.
7.16. Zentrifugieren Sie für 1 min bei 12 000 x g.
7.17. Geben Sie den Durchfluss in den Flüssigabfall.
7.18. Zentrifugieren Sie erneut für 1 min bei 12 000 x g um den restlichen EtOH zu entfernen.
Wichtiger Schritt, denn falls zu viel Ethanol auf der Säule ist, sind die Ausbeuten an Plasmid-DNA
gering und zudem verunreinigt.
Elution:
7.19. Stecken Sie die Säule in ein neues und gut beschriftetes 1,5 ml Tube
7.20. Geben Sie 50 µl Elution-Buffer (Nr.5) in die Mitte der Membran der Säule (nicht mit der
Pipettenspitze berühren!).
7.21. Inkubieren Sie für 2 min bei Raumtemperatur.
7.22. Zentrifugieren Sie für 2 min bei 12 000 x g.
7.23. Messen Sie die DNA-Konzentration (wird vom Praktikumsleiter durchgeführt).
7.24. Gereinigte Plasmid-DNA kann bei -20°C gelagert werden.
 Die Plasmid-DNA wird in der Sequenzierreaktion zusammen mit dem Primer „pJET1.2 for“ verwendet.
Zusatz für schnelle Arbeitsbienen:
8.
Restriktionsverdau des Plasmids und Auftragen auf ein Gel
Um Herauszufinden, ob im Plasmid das Fragment der richtigen Größe enthalten ist, kann ein Testverdau
mit Restriktionsenzymen durchgeführt werden. Dazu wird das Plasmid mit zwei Enzymen, dessen
Erkennungssequenzen die MCS flankieren, verdaut. Als Kontrolle wird ein Plasmid ohne Insert ebenso
verdaut.
8.1. Restriktionsansatz:
Pipettieren Sie folgende Komponenten in ein neues 1,5 ml-Tube:
Komponente
ddH2O
10x FastDigestReaktionspuffer
XbaI
XhoI
Plasmid-DNA
Endkonzentration bzw. Menge
in einem Reaktionsansatz
1x
1 µg
Endvolumen: 20 µl
Eingesetzte Menge
1 µl
1 µl
Endvolumen: 20 µl
8.2. Mischen und abzentrifugieren Sie den Reaktionsansatz.
8.3. Inkubation des Reaktionsansatzes bei 37 °C im Heizblock (Eppendorf) für 5 min.
8.4. Stellen Sie den Reaktionsansatz auf Eis und geben Sie 0,2x Volumen DNA-Ladepuffer zur PCR.
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Als Kontrolle wird ebenso 1 µg unverdautes Plasmid aufgetragen.
8.5. Gelelektrophorese: Laden Sie den Verdau auf ein 1%iges Agarose-Gel mit kleinen Taschen und
legen Sie für ca. 45 min eine Spannung von 120 V an das Gel.
Anhang
Abb. 5: GeneRuler™ DNA Ladder Mix (Thermo Scientific)
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