受賞者講演要旨《農芸化学技術賞》 15 ウイルス感染防御機能を持つ Lactococcus lactis JCM5805の発見と事業応用 ① ② ③ ④ キリン株式会社基盤技術研究所藤原大介 ① 小岩井乳業株式会社技術開発センター城内健太 ② キリン株式会社酒類技術研究所杉村哲 ③ キリン株式会社基盤技術研究所藤井敏雄 ④ 分類されるものであった．このうち最も安定な反応を示す【背景】季節性インフルエンザなどの従来のリスクに加えて，新興感染症の拡大などウイルスに関連したリスクは飛躍的に増大しつつある．また，健常人においても高度情報化社会のもたらす多種多様なストレスにより，免疫力の低下が問題となっている．乳酸菌に関しては古くから免疫について多くの研究が行われており，マクロファージやミエロイド樹状細胞(mDC)を介した自然免疫活性化機能が明らかとなっていた．一方，近年ウイルス L.lactis JCM5805を選抜し，その後の解析を行った． Type I/III IFNs 【JCM5805の作用機構の解明】まずin vitro pDC培養系を用いて作用機構の解析を行った．対 क़ॖঝ५ NK B CTL ളଲ༛૩/ ীੰ ಍ཝ ಍ཝ 照乳酸菌としてLactobacillus rhamnosus ATCC53103を用いて解析を行ったところ，JCM5805はIFN-αに加えてIFN-β，IFN-λと శ્౮৓ੂ਋ૢ௦ ્౮৓৏਋ૢ௦ いったウイルス感染防御に関わるサイトカインを特異的に誘導 ௕S'&ણਙ৲໚෷༳भଢ଼஢ਅറ することが分かった（図2）感染防御機能を司る制御細胞としてプラズマサイトイド樹状細 100 0 0 【pDC活性化乳酸菌の探索】 ৌස໚෷༳ઙ 疫細胞である． * 50 40 30 20 10 0 * * ; p<0.05 ௕ ໚෷༳ઙभS'&षभ๣ਸपेॊ,)1Vਓেා଑୤ૻຎ 上記のようなpDCの重要性から，それを活性化するような乳酸菌が仮に見つかれば，実効性の高いウイルス感染リスク低減技術になりうると考えた（図1）． JCM5805 100 い，さらにウイルス抗原特異的な獲得免疫の誘発による感染後 200 ৌස໚෷༳ઙ 量のtype Iインターフェロン産生を介した感染初期応答を担 ૮๣ਸ Pam3CSK4 LPS CpG-A JCM5805 200 IFN-O IFN-λ (pg/ml) 300 * * イルス核酸を認識するTLR7/9を細胞内に強発現しており，大期応答まで制御する，いわばウイルス感染防御の中核を担う免 IFN-E IFN-β JCM5805 300 (pg/ml) ૮๣ਸ Pam3CSK4 LPS CpG-A IFN-D IFN-α ৌස໚෷༳ઙ 血単核球の1%にも満たないマイナーなサブセットであるが，ウ (pg/ml) ૮๣ਸ Pam3CSK4 LPS CpG-A 胞(pDC)が見つかり，大きな注目を集めている．pDCはヒト末梢図2 乳酸菌株のpDCへの添加によるIFNs産生誘導量比較また，この反応は生菌・死菌いずれの場合でも等しく観察された．さらに必須シグナルの探索の結果，J C M 5 8 0 5 は TLR9/MyD88を介したpDC活性化を誘導することが示された． TLR9はエンドソームに発現する内在性レセプターであり， pDCにJCM5805が貪食され，菌体中のDNAが溶出することが Type I/III IFNs 必須と考えられたため，蛍光染色したJCM5805を用いた蛍光顕微鏡観察を行った．その結果，図3に示すように対照乳酸菌株は NK ಍ཝ क़ॖঝ५ ളଲ༛૩/ ীੰ శ્౮৓ੂ਋ૢ௦ TLR9を介した活性化を起こすことが作用機構であることが示唆された． ્౮৓৏਋ૢ௦ IFN-E IFN-D IFN-O vitroで誘導したpDC培養マウス骨髄細胞からFlt-3Lによりin (pg/ml) ৌස໚෷༳ઙ 対照乳酸菌株 JCM5805 JCM5805 図1 pDC活性化乳酸菌の研究戦略 (pg/ml) 公的菌株バンクから収集した31菌種からなる計125株 50 300 300 系を用い， 40 * * * の乳酸菌株を添加し， pDC活性化指標であるIFN-αの定量を 200 200 30 * 行った．その結果，殆どの乳酸菌株添加でIFN-αは検出されな 20 100 100 10 かったが，3株において100pg/mlを上回る量が検出された．極め 0 0 0 10Pm 10Pm JCM5805 ৌස໚෷༳ઙ JCM5805 ૮๣ਸ Pam3CSK4 LPS CpG-A * ; p<0.05 60 80 100 ༳ઙभS'&षभ๣ਸपेॊ,)1Vਓেා଑୤ૻຎ ৌස໚෷༳ઙ ૮๣ਸ Pam3CSK4 LPS CpG-A ৌස໚෷༳ઙ ૮๣ਸ Pam3CSK4 LPS CpG-A JCM5805 て興味深いことにこれら3株はLactococcus lactis subsp. lactisに図3 乳酸菌のpDCによる取り込みの違い ௕໚෷༳भS'&पेॊ਄ॉ੢ाभୀः ૨ (%) (pg/ml) のに対して，JCM5805はpDCの内部に取り込まれ，DNAが pDC ໚෷༳ 乳酸菌 pDC &ણਙ৲໚෷༳भଢ଼஢ਅറ pDC外部を取り囲むように分布し，細胞内部に取り込まれない B ಍ཝ CTL ** శၭ਄ණ 16 《農芸化学技術賞》【JCM5805の動物感染モデルにおける効果】受賞者講演要旨さらにヒトにおける風邪・インフルエンザ様症状に対する効果の検証のため， 2013年冬季に試験を行った．被験者213名を2グルス感染モデルを用いて検討した．マウスをJCM5805摂取・非ループに分け， 10週間ヨーグルト飲料を飲用させ，医師による診 ৌස໚෷༳ઙ 摂取の2群に分け，試験食投与2週間後に致死量のウイルスを感 JCM5805 断及び自覚症状を調査した結果，風邪・インフルエンザ様症状で染させた．その結果，感染から10日以内に非摂取群の全個体がある咳，熱っぽさの項目がプラセボ群と比してJCM5805群で有死亡したのに対し，摂取群では約7割が生存するという著効が HLA-DR JCM5805 意な低下を示した(図6)．さらにPBMCを不活化ヒトインフルエ MFI 観察された（図4）．このとき非摂取群のマウスの肺では顕著な উছ७঎ ンザウイルスで刺激した際の抗ウイルス因子・ISG15の発現量 N.S. pDC マウス経口摂取時の効果について，パラインフルエンザウイ ໚෷༳ 好中球の浸潤が認められ気道の閉塞が起こっていたが， JCM5805摂取群では浸潤の大幅な低下が起こっていた．さらな 10Pm 10Pm る解析の結果，腸管から取り込まれたJCM5805は腸管pDC活性化を介して全身の抗ウイルス機能を高めていることが示唆さ ௕໚෷༳भS'&पेॊ਄ॉ੢ाभୀः # 4000 ** さらに，工業的により広範な加工が可能な死菌粉末について ** ; ৫઩ৎपૻखथp<0.01 3500 も同様なヒトにおける有効性評価を行い，ポジティブな結果が 3000 得られている． ৫઩ৎ ીവ৏ శၭ਄ණ JCM5805 1000 900 800 700 600 0 ** ; p<0.01 0 ** 1100 উছ७঎ ঽಁඪ૾（熱っぽさ） (೸ढ़औ) 自覚症状 ྸ஋৅ඪ঻ਯ（人） (য) 累積発症者数 ** ྸ஋৅ඪ঻ਯ （人） (য) 累積発症者数 ঽಁඪ૾（咳） (Ꭼ) 自覚症状 60 80 100 0 5000 # ; ૏ॢঝ‫ش‬উ৑ p<0.05 がJCM5805群でプラセボ群より有意に高くなった． 4500 ௕-&0அથ୫ષၭ਄भ঄ॺS'&ણਙपउऐॊ஍ટ 20 40 েோ૨（%） (%) 生存率れた． 5500 JCM5805 ** 400 350 ऱनः (4) ऊऩॉँॊ (3) ੗૘मँॊ (2) ૘खटऐँॊ (1) 300 250 200 0 ** ; p<0.01 উছ७঎ JCM5805 ௕ ௯ဪ‫؞‬ॖথইঝग़থ२஘ঽಁඪ૾पৌघॊ-&0அથ୫ષၭ਄भ஍ટ 5 10 15 क़ॖঝ५૎ഉ৏঩ਯ ウイルス感染後日数図6 風邪・インフルエンザ様自覚症状に対するJCM5805 含有食品摂取の効果 ௕ ঐक़५ঃছॖথইঝग़থ२क़ॖঝ५૎ഉঔॹঝपउऐॊ-&0৽ઠ਺ଖभ஍ટ 図4 マウスパラインフルエンザウイルス感染モデルにおける【まとめ】 JCM5805経口投与の効果このように我々は加工特性や安全性・コスト面に優れ，現実的【JCM5805のヒトにおける効果】な有用性を持つ乳酸菌を題材に，ヒトの抗ウイルス免疫を司る動物モデルで著効を認めたため，JCM5805で製造したヨーグ pDCに着目し，ごく限られた株に活性化作用があることを発見ルト飲料(1000億cfu/本)を用いてヒトにおける効果の検証をした．さらにJCM5805を題材にin vitro実験・動物実験・ヒト試験行った．を通して，その効果と作用機構について検証を行った． 2011年夏季に行った試験では被験者38名を無作為に19名ずつさらにヨーグルト製品を開発し，加工特性を生かした死菌粉 2グループに分け，一日100mlの試験飲料を4週間飲用させた．試末の製造ラインを立ち上げ，清涼飲料製品及びサプリメントを験開始時，終了時にそれぞれ採血を行い，末梢血単核球中のpDC 開発した．活性化度を評価したところ，試験終了時にJCM5805群のpDC活現在，JCM5805のpDC活性化における分子生物学的観点から性がプラセボ群より有意に高くなった(図5)．のメカニズム解明や，腸管感染性ウイルスに対する効果，寿命や加齢形質に与える効果など多岐に渡る応用研究を推進していプラセボ উছ७঎ N.S. 5000 4500 # ** 4000 3500 3000 る． JCM5805 JCM5805 HLA-DR MFI 5500 開始時 ৫઩ৎ ૏ॢঝ‫ش‬উ৑ p<0.05 ## ;; 両グループ間 p<0.05 開始時に比して p<0.01 **** ;; ৫઩ৎपૻखथp<0.01 ྸ஋৅ඪ঻ਯ (য) ྸ஋৅ඪ঻ਯ (য) 900 800 700 600 উছ७঎ ** 400 1000 0 ঽಁඪ૾ (೸ढ़औ) ** JCM5805 350 ऱनः (4) ऊऩॉँॊ (3) ੗૘मँॊ (2) ૘खटऐँॊ (1) 300 250 200 0 ** ; p<0.01 উছ७঎ よるものであり，研究・商品開発・マーケティング・製造・販売に発研究までご助言・ご指導を賜りました先生方に厚く御礼申し図5 JCM5805含有食品摂取のヒトpDC活性における効果 ঽಁඪ૾ (Ꭼ) 本研究成果はキリングループ各社の多くの関係者の尽力に関わった皆様に感謝いたします．また，研究コンセプトから開終了後 ીവ৏ ௕-&0அથ୫ષၭ਄भ঄ॺS'&ણਙपउऐॊ஍ટ 1100 【謝辞】 JCM5805 ௕ ௯ဪ‫؞‬ॖথইঝग़থ२஘ঽಁඪ૾पৌघॊ-&0அથ୫ષၭ਄भ஍ટ 上げます．