Refolding CA Large Kit

製品コード
7351
研究用
Refolding CA Large Kit
説明書
v201508
大腸菌等で組換えタンパク質を発現させる際に生じた不溶性の封入体（inclusion body）を活性を有する
タンパク質として再生させる（refolding）有効な手段として、リフォールディング操作を 2 段階に分け、
各々の段階に適した種類の化合物を使用する方法が報告されています 1～3）。タカラバイオでは、この
2 段階操作を行い効率を上げた上でリフォールディングの条件を検討するためのキットとして、Refolding
CA Kit（製品コード 7350）を販売しています。本製品 Refolding CA Large Kit は、Refolding CA Kit で条
件検討を行った後、スケールアップしてリフォールディング操作を行う場合などに利用できるラージス
ケールのキットで、封入体をアンフォールディングするための塩酸グアニジンとリフォールディングに
重要な高重合度シクロアミロース（CA）を含みます。
I．内容
1．8 M 塩酸グアニジン（GdmCl）
2．3％ CA（高重合度シクロアミロース）
10 ml × 2
20 ml × 6
これらを溶解した際に沈殿が生じる場合があります。37℃に加温して完全に溶液を溶解
してからご使用ください。CA は、50 回の凍結融解にも安定です（ただし、CA 溶液に微
生物やアミラーゼが混入すると開環してリフォールディング能が低下しますのでご注意く
ださい）。なお、本キットには、DL-Cystine、DTT および界面活性剤は含まれておりません。
II．保存
－ 20℃
※適切に保存し、受取り後 2 年を目途にご使用ください。
III．原理
界面活性剤をタンパク質の変性溶液中に添加することにより、変性剤の濃度を希釈すると
共にタンパク質分子同士の凝集を防ぎます。次いで CA を添加し、その包接能を利用して
タンパク質－界面活性剤複合体から界面活性剤を除くことによって、タンパク質を活性を
有する正しい高次構造にフォールディングさせます。
タカラバイオ（株）http://www.takara-bio.co.jp/
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製品コード 7351
IV．操作
以下は条件検討時の操作手順です。条件決定後は適宜スケールアップしてご使用ください。
以下の手順に従いアンフォールディングした後、使用する界面活性剤の種類等を変えてリ
フォールディング条件を検討する。
[ アンフォールディング ]
1．封入体（inclusion body）を形成したタンパク質を適当な緩衝液に懸濁する（10 mg/ml
以下が望ましい）
。
2．封入体懸濁液 24 μl に 8 M 塩酸グアニジン 75 μl、4 M DTT 1 μl を加え室温で１時間
放置する。
[ リフォールディング ]
3．アンフォールド溶液 20 μl に界面活性剤（＋ DL-Cystine）溶液＊1.4 ml を加え、室温で
１時間放置する。
＊：適当な緩衝液（1.33 ml）に界面活性剤（1％ Tween 40、1％ Tween 60、1％
CTAB または 1％ SB3-14 など）を 1/20 量（70 μl）加えて調製する。さらにシ
スチンも加える場合は、この液に 200 mM DL-Cystine を 1/100 量（14 μl）添
加する。
4．上記反応液 400 μl に 3％ CA 溶液 100 μl を加え、室温で一晩放置する。
5．15,000 rpm で 10 分間遠心し、上清を回収する。
VI．Q & A
Q1：Refolding CA Kit（製品コード 7350）で処理可能なタンパク質の量は？また、得られ
るリフォ－ルディングタンパク質の量は？
A1：Refolding CA Kit は、リフォールディング条件の検討を行うためのキットですので、
一度に大量のタンパク質を処理することはできません。Inclusion Body を形成した
タンパク質を 10 mg/ml 以下の濃度で懸濁し、まずアンフォールディング操作を行
います。この際、塩酸グアニジンを添加した段階で溶液の粘度が高くならなければ、
操作上は問題ありません。10 mg/ml の濃度で使用した場合、プロトコールに従った
1 回の処理で 100％のリフォールディングが起こると、約 14 μg のリフォールディ
ングタンパク質が得られます。
Q2：Refolding CA Kit でリフォールディングした後のタンパク質溶液に沈殿が再び生じる
ことがあるが、どうしてか？
A2：リフォールディングの過程では、CA が界面活性剤を包接し、包接化合物（白い綿状
の沈殿）を生じます。この遠心上清を集めてリフォールディングタンパク質溶液とし
ていますが、放置しておくと、残っている CA と界面活性剤が反応して沈殿が生じる
ことがあります。これを再度遠心して沈殿を除いても、リフォールディングされた
タンパク質には特に影響はありません。
Q3：Refolding CA Kit でリフォールディングした後のタンパク質溶液中のリフォールディ
ングタンパク質の検出や精製は？
A3：遠心上清として得たリフォールディングタンパク質溶液は、多くの場合、その
まま酵素活性などの生理活性の測定に使用できます。活性測定が困難な場合は、
SDS-PAGE を行い、タンパク質のサイズを確認することで、リフォールディングの成
否が判断できます。タグ（His-Tag、GST-Tag など）を付加した組換えタンパク質に関
しては、タグを利用した通常のアフィニティ精製を行ってください。
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製品コード 7351
VI．参考文献
1）Daugherty, D. L., Rozema, D., Hansen,P. E., and Gellman, S. H. (1998) J Biol Chem . 273,
33961-33971.
2）Sundari, C. S., Raman, B., and Balasubramanian, D. (1999) FEBS lett . 443, 215-219.
3）Machida, S., Ogawa, S., Xiaohua, S., Takaha, T., Fujii, K., and Hayashi, K. (2000) FEBS lett .
486, 131-135.
VII．関連製品
Refolding CA Kit（製品コード 7350）
Cycloamylose Protein Refolding Reagent（製品コード 7352/7353）
VIII．注意
・本製品は、研究用試薬です｡ヒト、動物への医療、臨床診断には使用しないようご注意
ください。また、食品、化粧品、家庭用品等として使用しないでください。
・タカラバイオの承認を得ずに製品の再販・譲渡、再販・譲渡のための改変、商用製品の
製造に使用することは禁止されています。
・ライセンスに関する情報は弊社ウェブカタログをご覧ください。
・本説明書に記載されている会社名および商品名などは、各社の商号、または登録済みも
しくは未登録の商標であり、これらは各所有者に帰属します。
本製品は、独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構、グリコ栄養食品株式会社よ
りライセンスを受け、タカラバイオ株式会社が製造販売しています。研究用途以外の使用、
スケールアップ、商用利用については以下へお問い合わせください。
グリコ栄養食品株式会社　ファインケミカル営業部
〒 555-8502　大阪市西淀川区歌島 4-6-5
TEL：06-6477-8281　FAX：06-6477-8267
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