PDF：癌パネルを用いた変異解析のご案内

Target Sequencing
AmpliSeqTMがんパネルを用いた変異解析
がん関連遺伝子の変異解析を短期間で実施できます！
Ion AmpliSeqTMがんパネルを使って、ゲノムDNAから対象領域のDNAをPCR増幅し、そ
れらの塩基配列をIon Torrentシーケンサーを用いて解析します。その後、参照配列と
比較することで、目的遺伝子の変異を短期間で解析することが可能です。対象領域
の増幅にはマルチプレックスPCRを用いるため、少ないDNA量からでも解析できます。
解析の流れ
品質評価
ゲノムDNA
対象領域の増幅 /
ライブラリ作製
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Used under permission.
シーケンシング
・サンプル：ゲノムDNA*
・ DNA濃度： 10 ng/mL以上
*FFPEサンプルから抽出したDNAの場合は、別途ご相談下さい。
AmpliSeqTM パネル（ターゲット領域）
・Ion AmpliSeqTM Cancer Hotspot Panel v2
（がん関連50遺伝子上の2800以上の変異を含むHotspot 領域）
・Ion AmpliSeqTM Comprehensive Cancer Panel
（がん関連409遺伝子のコーディング領域）
データ解析
変異リストなど
サンプル条件
・生物種：ヒト
・ DNA量： 200 ng以上
・ OD260/280： 1.8以上
◎詳細は、弊社までお問い合わせ下さい。
■ Integrative Genomics Viewer (IGV)
納物
主な納品物
・リードデータ（FASTQファイル）
・マッピング結果（BAMファイル； IGV*で閲覧可能（右図）)
・変異候補の検出結果
変異候補
リード
（TSVファイル（下図）、VCFファイル（右図））
・既知変異箇所のアレルカウント（オプション）
*http://www.broadinstitute.org/igv/
参照配列
■ Variant Callerによる解析結果1: 変異候補のリスト
位置情報
遺伝子・アンプリコン情報
Coverage情報
変異情報
■ Variant Callerによる解析結果2: 既知変異箇所のアレルカウント
位置情報
アンプリコン・癌変異ID
株式会社理研ジェネシス
Coverage・塩基数情報
COSMIC ID
Target Sequencing
解析例
Ion AmpliSeqTM Cancer Hotspot Panel v2を用いた変異解析
○概要： PIK3CA、NRAS、KRAS 遺伝子内の3変異に関して、野生型と変異型のアレル比が分かっている標準ゲノム
DNAサンプルをシークエンス解析し、変異型アレルの頻度を求めた。
○材料： Horizon Diagnostics製ゲノムDNA標準サンプル* 50%
PI3Ka (PIK3CA) E545K、50% NRAS Q61R、50% KRAS G12A
（変異型アレル頻度50%の標準ゲノムDNA）を混合するこ
とで、表１のような変異型アレル頻度を示すサンプル
AB 4.4を作製した。また、 Wild TypeサンプルとしてHorizon
社 100% KRAS Wild Type を使用した。
表１変異型アレル頻度の期待値
*弊社HP（http://www.rikengenesis.jp/hdx）をご参照下さい。
Sample
name
PIK3CA
E545K
NRAS
Q61R
KRAS
G12A
AB 4.4
4.4%
4.4%
4.4%
Wild Type
0%
0%
0%
○方法： Ion AmpliSeqTM Cancer Hotspot Panel v2を使い、各サンプルDNAから対象領域をPCR増幅した。その後、
Ion PGMTMシステムを用いてシーケンス解析を行った。シーケンシングには Ion 314TM Chipを使い、その後
のデータ解析にはTorrent SuiteTMを用いた。
●結果：シーケンシング（表２）；対象領域にマップされたリード数は、両サンプルとも200Kを超えていた。また、平
均Coverage depthは共に1000以上であり、100x以上のCoverage depthを示した対象領域は両サンプルとも
99%以上であった。
表２シーケンシング概要
Sample
name
Number of
mapped reads
Percent reads
on target
Average
coverage depth
Target coverage
at 20x
Target coverage
at 100x
Target coverage
at 500x
AB 4.4
441,210
98.4%
2,021
100.0%
100.0%
98.2%
Wild Type
283,853
98.0%
1,280
100.0%
99.4%
94.0%
ターゲット変異箇所ごとのアレルカウント（表３）； AB4.4サンプルでは、３つのターゲット変異箇所すべて
において変異型アレル頻度が2.8-4.1%であり、表１の期待値とよく合っていた（赤枠）。Wild Typeサンプル
では、３つの変異箇所の変異型アレル頻度は0-0.1%であった（緑枠）。
表３ターゲット変異箇所ごとのアレルカウントとアレル頻度
Sample
name
Target
mutation
HotSpot ID
Ref
Coverage
A Reads
C Reads
G Reads
T Reads
Deletions
AB 4.4
PIK3CA E545K COSM125370
G
1399
39
(2.8%)
0
(0.0%)
1360
(97.2%)
0
(0.0%)
0
(0.0%)
Wild Type
PIK3CA E545K COSM125370
G
950
0
(0.0%)
0
(0.0%)
949
(99.9%)
0
(0.0%)
1
(0.1%)
AB 4.4
NRAS Q61R
COSM584
T
2045
0
(0.0%)
65
(3.2%)
1
(0.0%)
1979
(96.8%)
0
(0.0%)
Wild Type
NRAS Q61R
COSM584
T
1267
0
(0.0%)
1
(0.1%)
1
(0.1%)
1265
(99.8%)
0
(0.0%)
AB 4.4
KRAS G12A
COSM522
C
2667
0
(0.0%)
2555
(95.8%)
110
(4.1%)
2
(0.1%)
1
(0.0%)
Wild Type
KRAS G12A
COSM522
C
1370
0
(0.0%)
1368
(99.9%)
0
(0.0%)
2
(0.1%)
0
(0.0%)
○まとめ： Ion AmpliSeqTM Cancer Hotspot Panel v2 とIon PGMTMシステムを用いて、３つの変異箇所のアレル頻度を
求めた。それらの実測値は予測された値と良く一致しており、この手法を用いることでアレル頻度を正確
に求められることが確かめられた。
株式会社理研ジェネシス
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TEL: 045-521-8781 / Fax: 045-521-8786
E-mail: [email protected]
URL: http:www.rikengenesis.jp/

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