アルツ ツハイマー ー病の原因 因とされる るタンパク質 質を細胞内で可視 化する技術を開発 発 － 発症メカニズムの解明や治 治療薬の候 候補物質のス スクリーニン ングに貢献 － 平成 28 8 年 3 月 17 日 国立 立研究開発法 法人 産業技術 術総合研究所 所 国 国立大学法人 人 北海道大学 学 ■ ポイン ント ■ ・ アルツ ツハイマー病の原因因子の の一つである るアミロイドタ タンパク質（A A）の動態を を生体内で可視 視化 ・ Aと蛍 蛍光タンパク質 質 GFP の融 融合を工夫し、 、Aが凝集し しても蛍光が観 観察されるタ タンパク質を開 開発 ・ GFP の の蛍光強度を を利用した簡便・迅速な治 治療薬の探索 索と、詳細な発 発症メカニズム ムの理解へ貢 貢献 ■ 概 要 ■ 国立研 研究開発法人 人 産業技術総 総合研究所【【理事長 中鉢 鉢 良治】（以 以下「産総研」 という）バイオ オメディカル研 研 究部門【【研究部門長 長 近江谷 克裕】脳遺伝子 克 子研究グルー ープ 落石 知世 知 主任研 研究員らは、国 国立大学法人 人 北海道大 大学【総長 山口 山 佳三】大 大学院 先端生 生命科学研究 究院 北村 朗 助教、学校 校法人 順天堂 堂【理事長 小 川 秀興 興】 順天堂大学 医学部 脳神経内科 志村 秀樹 准教授らと共 共同で、アル ルツハイマー病 病の原因因子 子 であるアミロイ イド（A）タン ンパク質の動 動態を、生きた た神経細胞内 内や生体内で で可視化する る技術を開発し の一つで た。 容易に重合し し、それが更に に集まって大 大きな凝集体を を形成する。Aと蛍光タン ンパク質の GFP を融合させ せ Aは容 たタンパ パク質（A-GF FP）は、Aの重合により GFP の蛍光 光が阻害される ると推測され れている。その のため、生体内 内 で発現さ させても Aが が重合すると蛍 蛍光が観察さ されず、これま まで Aの局在や動態を可 可視化するこ ことは困難であ あ った。今回、Aと GFP P を繋ぐアミノ ノ酸配列（リン ンカー）を工夫 夫することで、Aの重合状 状態に関係な なく GFP の蛍光 光 できる融合タン ンパク質を開 開発した。また た、この融合タ タンパク質はア アルツハイマ マー病の発症 症に関与する毒 毒 が観察で 性の強い い Aオリゴマ マーを形成する ることが分か かった。 この技 技術は、培養細胞や生きた た個体を用い いたアルツハ ハイマー病治療 療薬の候補物 物質のスクリ リーニングへの の 応用や、アルツハイマ マー病の発症 症メカニズムの の解明への貢 貢献が期待さ される。なお、 本成果の詳細は、2016 年 日に Scientiffic Reports 誌（電子版、オ 誌 オープンアクセ セス）に掲載さ される。 3 月 16 日 は【用語 語の説明】参照 照 開 開発した A--GFP 融合タ タンパク質の模 模式図（左）と と、培養細胞や や線虫内での の発現の様子 子（右） -1- 景 ■ ■ 開発の社会的背景 高齢化 化社会を背景 景とした認知症 症患者の増加 加は、医療費 費や介護制度の現状などが が絡み合い、世界的にも大 大 きな社会 会問題となって ている。特にア アルツハイマ マー病は記憶 憶障害や判断能力の低下、 害等を特徴とし、 、見当識障害 認知症の の半数以上を を占めるにもか かかわらず、 詳細な発症メ メカニズムが が解明されてお おらず、有効な治療法や特 特 効薬も開 開発されていな ない。 ■ 研究の経緯 ■ 研では、生体 体メカニズムや や疾病に関連 連する分子の機能・構造の の解明を目指 指した研究を推 推進しており り、 産総研 そこから得られた知見 見を基に創薬 薬基盤・医療基 開発に取り組 組んできた。ア アルツハイマ マー病は、Aを を 基盤技術の開 とする老人斑 斑の神経細胞 胞周囲への沈 沈着と、過剰に にリン酸化され れたタウタン ンパク質が神経 経細胞内に蓄 蓄 主成分と 積する神 神経原繊維変 変化および、脳 脳の萎縮を主 主な病理学的 的特徴とする認 認知症である る。これらは発 発症原因として て 有力であ あるものの、い いまだアルツ ツハイマー病発 発症のメカニ ニズムは解明できていない い。このような な背景の中で で、 最近少数 数の A分子が が重合した Aオリゴマー A ーが細胞に対する強い毒性 性を有し、これ れが細胞内に に蓄積されるこ とが病気 気の発症に強 強く関与すると という説が有 力になりつつ つある。しかし し従来の方法 法では、細胞や や脳組織の標 標 本を用い いた解析しかで できなかった たため、生きた た細胞内で Aのオリゴマー ー化の状態を を直接可視化 化して毒性との の 因果関係 係を詳細に解 解析する方法や、治療薬の の候補となる物質の Aの の重合に対す する効果を直接解析する新 新 たな手法 法が求められ れていた。そこ こで、細胞の可 可視化や、神 神経細胞の機能の解析、ト トランスジェニ ニック動物の作 作 成と解析 析を行っている る産総研と、生きた細胞内 内での分子の の相互作用を を解析する蛍 光相関分光法に優れた実 実 績を持っ っている北海道 道大学大学院 院先端生命科 科学研究院で で共同研究を行うこととした た。 ■ 研究の内容 ■ まで、Aと GF FP を繋ぐリン ンカーとして 1 2 個以下のア アミノ酸から構 構成されたも のが報告され れていたが、こ これま れらは A Aが重合する ると GFP の蛍 蛍光が消失す するため、毒性 性の強いオリゴマーを観察 察できていなか かった。今回 回、 Aと GF FP を繋ぐリン ンカーとして、14 個のアミノ ノ酸を用いて、A分子の重 重合体が形成 成されても蛍 蛍光を観察でき き る、A-G GFP 融合タン ンパク質（A-GFP）を開発 発した。この A-GFP A を核 核磁気共鳴装 装置や電子顕 顕微鏡、免疫組 組 織化学法 法、蛍光相関分光法で解析 析したところ、 、GFP を融合 合させたことで で Aの重合が が一定以上進 進まず、生体内 内 でも生体 体外でも 2 量体 体から 4 量体 体を中心とした たオリゴマー ーの状態で存在することが が分かった（図 図 1）。これらの の 特徴を活 活かし、生きた た細胞内で Aのダイナミ A ミックな動きや や、初代培養 養神経細胞内 内での蓄積状態などの解析 析 が可能と となる。また、重合が進んで で繊維状とな なった Aより りも、オリゴマ マーのほうが がより強い毒性 性を有すること から、A オリゴマーの の重合の度合 合いと細胞へ の毒性との関 関係などの解 解析を行うこと とができる。 -2- 図 1 生体内 内・生体外での の A−GFP の様子 の （A A）Aタンパク質 質(a)と A-G GFP(b、c)の電 電子顕微鏡像。 。Aタンパク質 質は重合が進 進み繊維状にな なるのに 対し、A-GFP は重合が途中 は 中で止まり、数 数量体のオリゴ ゴマーを形成す する（c の破線 線で囲まれた部 部分はそ れぞれ 1 個の重 重合体を示す）。 （B COS7 細胞(aa)を、オリゴマ B）A-GFP を発現させた を マーだけを認識 識する抗体で で染色した像(b b)。 (a)と (b))がほぼ一致す することから(c c)、A−GFP が がオリゴマーで であるとわかる。 Aと GFP を繋 繋ぐリンカーが短いと、重 重合の影響を受けて GFP の蛍光は観察 の 察されなくなる る。そこで今回 回 また、A 発見した た現象を利用して重合の状 状態が検出で できるシステム ムを考案し、GFP の蛍光 光強度を利用 用した治療薬候 候 補物質の のスクリーニン ングが可能で であることを実 実証した（図 2）。GFP 2 単独 独を特定の神 神経細胞に発現 現させたトラン ン スジェニック線虫では は神経細胞内 内に明瞭な蛍光 光が観察でき きる（図 2a）が が、2 個のアミ ミノ酸からなる る短いリンカー ー A-GFP を発現させた線虫 虫では、Aの の重合の影響 響を受けて GF FP の蛍光は観 観察されなか かった（図 2b）。 を持つ A この線虫 虫を、Aの重合 合を抑制する るクルクミンを を加えた培地で飼育した結 結果、GFP の の蛍光が観察 察できた(図 2c)。 このように、A-GFP は蛍光強度 度の変化を測 測定することで で、Aの重合 合を抑える創薬 薬候補物質の のスクリーニン ン 用できる。 グに利用 図 2 生体を用いた た創薬候補物 物質のスクリー ーニング例 飼育培地上の線 線虫（A）を顕微 微鏡で観察す すると、クルク クミンによる Aの重合抑制 A 制によって蛍光 光強度が 増 加した神経細 細胞を見ること とができる（B））。白丸は神経 経細胞の細胞 胞体、矢頭は神 神経細胞の軸 軸索を示 す。 -3- ■ 今後の予定 ■ は培養神経細 細胞を用いて、A-GFP の の蛍光強度を を利用したアルツハイマ ー病の治療薬 薬や予防薬の の 今後は 候補とな なる物質をよ より簡便にスクリーニ ングできる る方法の開発 発に着手する る。また、今 今回開発した た A-GFP を発現させ せたトランスジ ジェニックマウ ウスを用いて、 、アルツハイマー病発症の のごく初期に に起こる神経細 細 での微細な変 変化に Aオリ リゴマーが与 与える影響につ ついてより詳 詳細な解析を行 行い、アルツ ツハイマー病発 発 胞内部で 症のメカニズムの解明 明や予防に関 関する研究を をすすめる。 先 ■ ■ 本件問い合わせ先 究開発法人 産業技術総合 産 合研究所 国立研究 バイオメディカル研究 究部門 脳遺伝 伝子研究グル ループ 主任研究 究員 落 落石 知世 〒305--8566 茨城県 県つくば市東 1-1-1 中央 央第 6 TEL：0229-861-6577 7 FAX：029-861-6407 E-mail ：[email protected] 究部門 脳遺伝 伝子研究グル ループ バイオメディカル研究 ループ長 研究グル 戸 戸井 基道 〒305--8566 茨城県 県つくば市東 1-1-1 中央 央第 6 TEL：0229-861-7886 6 FAX：029-861-6407 E-mail ：[email protected] 国立大学 学法人 北海 海道大学 大学 学院 先端生命 命科学研究院 院 細胞機能科 科学研究室 〒001--0021 北海道 教授 金 金城 政孝 道札幌市北区 区北 21 条西 11 丁目 次世代 代ポストゲノム ムセンター TEL：0111-706-9005 5 FAX:011-70 06-9045 E-mail ：[email protected] okudai.ac.jp 先端生命 命科学研究院 院 細胞機能科 科学研究室 〒001--0021 北海道 助教 北 北村 朗 道札幌市北区 区北 21 条西 11 丁目 次世代 代ポストゲノム ムセンター TEL：0111-706-9006 6 FAX:011-70 06-9045 E-mail ：[email protected] okudai.ac.jp 【取材 材に関する窓口 口】 国立研 研究開発法人 人 産業技術総 総合研究所 企画本部 企 報道 道室 〒305 5-8560 茨城県 県つくば市梅園 園 1-1-1 中央 央第 1 つくば ば本 部 ・情 報 技 術 共 同 研 究 棟 8F TEL：0 029-862-62166 FAX：029-862-6212 E-mail：press-m [email protected] 国立大 大学法人 北海 海道大学 総務企画部広報 総 報課 〒060 0-0808 北海道 道札幌市北区 区北 8 条西 5 丁目 TEL：0 011-706-26100 FAX：011-706-2092 E-mail：[email protected] ai.ac.jp -4- 【用語の の説明】 ◆アルツ ツハイマー病 記憶障 障害を中心とした認知機能 能障害を主な な症状とする認 認知症。認知 知症の中でも最 最も多い。 ンパク質 ◆アミロイド（A）タン 程度のアミノ酸 酸からなるタ タンパク質。 40 個程 Green Fluoreescent Prote ein 緑色蛍光 タンパク質） ◆GFP（G オワン ンクラゲがもつ つ緑色蛍光タ タンパク質。青 青色の光を吸 吸収して緑色の蛍光を発す するため、生 生きた細胞や個 個 体内のタ タンパク質の局 局在などを観 観察する際に よく用いられ れる。 ゴマー ◆オリゴ 単量体 体（モノマー）が が少数個結合 合（重合）した たもの。 識障害 ◆見当識 日時・場所・話して ている相手など ど、自分が置 置かれている状 状況が認識で できないことを をいう。 酸化 ◆リン酸 タンパ パク質の特定の の場所に、リ リン酸化酵素 によりリン酸 酸基が付加され れる化学反応 応。リン酸化さ されたタンパク 質は生体 体内でその機 機能が活性化 化されたり抑制 制されたりする る。 ◆タウタンパク質 の軸索内に存 存在する微小管結合タンパ パク質。細胞の骨組みや物 物質輸送経路 路として機能 能する微小管の の 神経の 安定化に に関与する。 原線維変化 ◆神経原 タウタンパク質がリ リン酸化される ると微小管か から離れ、タウ ウタンパク質同 同士で結合す する。これが神 神経細胞の細 細 繊維状の塊と となったもの。 胞質で繊 スジェニック動 動物 ◆トランス 外部か から特定の遺 遺伝子を人為的に導入した た動物。 相関分光法 ◆蛍光相 レーザ ザー光を用いた共焦点光学 学系を利用し し、ごく微小な な観察領域の の中を蛍光分 分子が出入りす することにより 生じる蛍 蛍光強度のゆらぎを解析し し、蛍光分子 の濃度や拡散速度を測定 定する技術。 拡散速度か から分子の大き き さや分子 子間の相互作 作用を解析する ることができる る。 -5- 気共鳴装置 ◆核磁気 物質の の分子構造や や物性を原子 子レベルで解析 析するための の装置。強力な な磁場中の試 試料にラジオ オ波を照射する る と、原子の核の状態によって、ある周波数のラ ラジオ波を吸 吸収する（核磁 磁気共鳴）。こ この吸収スペ ペクトルから分 分 を解析する。複 複雑な有機化 化合物の化学 学構造を決定 定するために広 広く用いられる る。 子構造を ◆COS7 細胞 細胞。細胞外 外から導入さ された遺伝子が効率よく機 機能するため め、遺伝子導入 入 アフリ カミドリザル腎臓由来の細 汎用される。 実験に汎 クミン ◆クルク カレー ーのスパイスで であるウコンの の黄色色素。 。Aの重合を を抑制する働きがある。 -6-
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