270 感染 症 学雑 誌 Klebsiella群 第45巻 第7号 の 沈 降 反 応 に よ る 同定 に 関 す る研 究 岩手医科大学歯学部 口腔微生物学教室 冨 沢 万 之 助 ま えが き Kiebsiella群 の同 定 は 莢膜 膨 化反 応1)2)3)5)6)7)に よつ て な され て い るが,こ の莢 膜 はVi抗 原 と同 平 田 佳 子 間 お よび16時 間 の ブ イ ヨ ン培 養 に0.5%に ホル マ リンを加 え て殺 菌 した も のを 上 述 の ご と く注 射 し て作 つ た. 様 に生 理 食 塩 液 に 容 易 に 遊 離10)して くる こ とか プ ール 血 清 の組 合 せ:各 型 血 清 の抗 体 価 が4倍 ら,富 沢11)は沈 降反 応 を用 い て 吸収 血 清 に よる分 濃 くな る よ うに1群 に8つ ず つ の型 血 清 を プ ール 類法 を発 表 した.し か し,抗 原 の作 り方 にお いて して72の 型 血 清 を9つ の プ ール血 清 に ま とめた . 2,3の そ の組 合 せ は表1に 示 す 通 りで あ る. 改 良す べ き点,す なわ ち,100℃1時 間 加 熱 に よ り抗 原 性 が 破 壊 され る菌 株 のあ る こ と, 沈 降反 応:重 層法 に よ り2時 間観 察 した. 100℃ 加 熱 に よつ てK抗 原 ば か りで な く同 時 にO Table 航 原 が多 量 に遊 離 して きてKlebsiella群 1 Combinatoin of pool sera の 同定 を 困 難 にす る型 菌 株 が 認 め られ る こ とか ら,型 抗 原 の作 り方 を 研 究 した.ま た,全 型 血 清 の吸 収 血 清 を 作 つ て 同 定 す る こ とは複 雑 で,手 数 を要 す る の で 型 血 清 を プ ール して 同定 す る方 法 を研 究 し た. 実験方法 実 験 材 料:Klebsiellaの72の 型 菌 株 を 用 い た. 型 抗 原 の作 り方: 100℃ 抗 原;ナ ス型 培 養 管(0.2%ブ 寒 天 培 地(肉 汁)40mlあ 40ml入 ドウ糖 加 るい は 普通 寒 天培 地 を れ て 斜 面 に した)に24℃ ∼35℃ に お い て 18時 間 ∼3日 間 培 養 した もの に30mlの 生理食塩 液 を注 加 して菌 浮 遊液 を 作 り,こ れ を水 浴 で20∼ 60分 間 煮 沸 後,遠 沈 して上 清 を と り抗 原 と した . 生 抗 原;上 述 の菌 浮 遊液 を加 熱 す る こ とな くホ モ ジ ナ イ ザ ーに2分 間 ず つ1∼3回 か け てか ら遠 沈 して上 清 を とつ た. 0.5, 1.0. 間 加熱 して型 抗 原 を 作 つ た のは,菌 浮遊 液 が粘 稠 性 の た め に透 明 免疫 血 清 の作 り方:16時 を0.25, 実験成績 さ き の報 告 に お い て100℃1時 間 の ブ イ ヨ ン培 養 生 菌 2.0mlず つ5日 間隔 で 家 な上 清 が 得 られ難 い か らで あ る.し か し,100℃ 1時 間 の加 熱 に よつ てO抗 原 が よ り多 く遊 離 して 兎 の耳 静 脈 内 に 注射 し,最 後 の注 射 日か ら7日 目 きてO抗 原 に よる交 叉 反 応 が現 わ れ て 同定 を 困難 に全 採 血 して血 清 を分 離 し,こ れ に10,000倍 に マ ー ゾニ ンを加 え て冷 蔵 庫 に保 存 した .1部 は6時 に す る こ とが判 明 した.ま た,100℃1時 間 の加 熱 に よつ て 時 と して 抗 原性 が 破 壊 され る型 菌 株 271 昭 和46年7月20日 Table Heated antigen centrifuged (H) in Crude and antigen (型 菌 株1,2)を K抗 原 はVi抗 this 2 Frequency next (C)-Saline of cross reaction table-Saline of heated suspensions suspensions of of organismus and crude organismus were antigens were churned heated by at blender, 100•Ž for 1 よ る交 叉 反 応 を 多 く現 わ す もの は7, 認 め た. 原 と同様 に生 理 食 塩 液 に容 易 に hour, centrifuged 12, 39, 41, 63型 血 清 な どで あ る. 遊 離 して くる が,上 述 の よ うに粘 稠 性 のた め に透 100C゜ 抗 原 と生 抗 原 の0抗 明 な抗 原 を得 る こ とが 困難 な の で,こ れ を ホ モ ジ 100℃ 抗 原 の場 合 は,生 抗 原 に 比 較 して 交 叉 反 原 価 の比 較 ナ イ ザ ーに か け て か ら遠 沈 す る と容 易 に透 明 な抗 応 を現 わ す 型 血 清 が 多 く認 め られ る ので,O抗 原(生 抗 原)が 得 られ,し か も0抗 原 に よる交 叉 を 用 い て これ らの 型 血 清 のO抗 原 価 を測 つ て み 反 応 を 除 く こ とが で き る ので,試 み に 交 叉 反 応 を 一 多 く現 わす 型 菌 株7, 12. 33, 39, 41, 45, 46, た.そ の成 績 を表3に 示 す.100℃ 抗 原 に比 して8∼32倍 63な どで作 つ た100℃ 抗 原 と生 抗 原 とを もつ て実 高 い の は型 抗 原12, 33, 39, 63で あ る.し た が つ て 験 を行 な つ て比 較 してみ た.表2に 示 す 通 り,生 原 抗 原 の方 が 生 高 い0抗 原 価 を 示 す.特 に 100℃ 抗 原 の方 が0交 叉 反 応 を 起 こす 場 合 が 多 い 抗 原 の場 合 は交 叉 反 応 を示 す 型 血 清 の数 が100℃ もの と思わ れ る.し か し,生 菌 浮 遊 液 を ホ モ ジ ナ 抗 原 に比 して非 常 に減 少 す る こ とが 判 つた.特 イザ ーに か け た だ け で はK抗 原 が 遊 離 しない か, に 12, 33, 39, 63型 抗 原 に お い て著 しい. あ るい は,し が た い菌 株 が あ る.そ の成 績 を 表4 生 抗 原 を用 い る こ とに よつ て除 かれ る よ うな交 叉 反 応 を示 す 型 血 清 に つ い て抗 原 価 を調 べ て み る といず れ も低 く,1:512以 下 で あ る.こ れ は型 抗 原 中 に含 まれ て い るO抗 原 に よる反 応 と考 え ら れ る.こ れ に反 して生 抗 原 に対 して も依 然 と して に示 す.型 菌 株59,69は35℃1夜 培 養 の菌 浮 遊 液 を ホ モ ジナ イ ザ ーに か けた だ け で は抗 原 価 は1: 64陰 性 で あ る.そ れ が100℃1時 れ ぞ れ2,048,512の 間加 熱 す る とそ 抗 原 価 を示 す よ うに な る. 交 叉 反 応 を現 わす 型 血 清 に つ い て抗 原 価 を調 べ て 23∼24℃ で2∼3日 み る と,い ず れ も高 く1:1,024以 抗 原 は35℃ 培 養 菌 に 比 して 生 抗 原,100℃ なわ ち,こ く,K抗 上 で あ る.す れ は 前 報 告10)にお いて も述 べ た ご と 原 に よ る交 叉反 応 と考 え られ る.K抗 に よ る交 叉 反 応 を 多 く現 わす 型 抗 原 は7, 原 41, 46 な どで あ る. 以上 の成 績 か ら,100℃ 抗 原 を用 い る こ とに よ つ て現 わ れ る交 叉反 応 はK抗 原 に よ る よ りもO抗 原 に よ る場 合 の方 が 多 い よ うで あ る.O沈 を 現 わ す も のはO-1群 で あ る.ま たO-1群 降反 応 に属 す る 型 抗 原 が 大 多数 に 属 す る型 血 清 中 に は0抗 体 が 多 く含 まれ て い る も のが あ る.し た が つ て, これ らの型 血 清 は高 い0抗 体 価 を 示 す.0抗 原に 培 養 した 菌 を もつ て作 つ た 型 と も高 いK抗 原価 を示 す.た Table 3 Comparison and crude of 0 antigens だ し,100℃ antigen titer 抗原 抗原 の of heated 272 感染症学雑誌 Table 4 Influence of temperature and time of incubation on K antigen 第45巻 第7号 titer 場 合 は高 いO抗 原 価 を 示 す こ とは 前 述 の通 りで あ き る だ けO抗 原 を含 ま な い よ うに して 作 つ た.次 る.特 に型 抗 原45は 生 抗 原 で も高 いO抗 原 価 を示 に交 叉 反 応 を現 わ す 型 血 清 を で き るだ け1つ す. に ま とめ る よ うに して,72の 型 血 清 を9つ 抗 原,抗 血 清 を稀 釈 して交 叉 反 応 を 除 く考 えか ら型 血 清1,12,61,O-1血 清 な どを 用 い て反 応 の場8)を 調 べ た.型 血清1で た だ し型 血 清12,61は は矩 形 を 呈 す る. 完 全 な矩 形 を示 さ な い.こ れ は単 一 の抗 原 が示 す 反 応 の場 で は な く2∼3の 抗 原 に よ る反 応 の場 が,重 なつ た も の と考 え られ る. 次 にO-1血 清 と型 血 清12(こ の血 清 中 に はO 抗 体 が 多量 に存 す る との考 え か ら)に つ い て はO1抗 原 を用 い て反 応 の場 を調 べ た.型 抗 原 の場 合 と異 な り抗 原 価 が低 い の で 四角 形 を示 す. 以上 の こ とか ら型 血 清 を稀 釈 して も交 叉 反 応 を さけ る こ とは簡 単 な こ とで は な い.こ とに,O- 1に 属 す る型 菌 株 で作 つた 型 血 清 中 に は高 いO抗 体 価 を示 す もの が あ る.ま た,型 血 清 稀 釈 に よつ て反 応 出現 の 遅 速 減 弱 な どに 差 が み られ な い の で,む しろ型 抗 原 の稀 釈 を考 え るべ きで あ る. プール血清による同定 さ きの報 告 で は 吸収 血 清 を作 つ て 同定 を行 なつ た が,吸 い.こ のプー ル血 清 に ま とめ,同 定 の簡 素 化 を考 えた.そ 反 応 の場 収 血 清 を作 るに は手 数 を要 し容 易 で な こで は 吸収 血 清 を用 いず に プ ー ル血 清 に よ る同定 法 を考 えた.上 述 の よ うに交 叉 反 応 はO抗 原 に よる場 合 が 多 い の で型 抗 原 を作 る場 合 に はで Table 5 の群 Results of pool sera (Table 1-a) の成 273 昭 和46年7月20日 In this table •¬, diminishing Figure with (•¬), •¬, degree in column which cross of of +, precipitin pool reaction (+) indicate reaction. sera indicates type sera occured 績 を 表5に 示 す.こ の表 に は ホ モ の プ ー ル血 清 以 外 の血 清 に反 応 す る型 抗 原 が 少数 認 め られ た.す なわ ち,3,7,12,21,26,29,33,41,46, 49,69型 抗 原 な どで あ る.こ れ は 色 々調 べ て交 叉 反 応 を示 す 型 血 清 を1つ の群 に プ ール した つ も り が,も れ て完 全 に プ ー ル しきれ なか つ た た め で あ る. これ らの型 抗 原 と交 叉 反 応 を示 す型 血 清 は,表 5の プ ール 血 清欄 の 陽性(+)の 例 に示 した. 以 上 の成 績 を 考 慮 に 入 れ て プー ル血 清 の組 合 せ を 表1-bに 示 す よ うに改 めた.型 血 清 の示 す交 叉 反 応 は 常 に 一 定 した もの で は な い の で,型 血 清 を 作 る ご とに 試 験 して お く必 要 が あ る. また,型 血 清 を プ ール す る と反 応 の 減弱 す る も の が認 め られ る.た とえば,型 血 清18,28,31, 34,65,66,67,69,71な どで あ る.こ れ らは 型 血 清 を プ ールす る際 に,よ り濃 い血 清 を 用 い れ ば 解 消 で き る もの と思 わ れ る. 総 括 お よび 考 察 Klebsiella群 のK抗 原 はVi抗 原 と同 じ よ うに 生 理 食 塩 液 に 浮 遊 し た だ け で 容 易 に遊 離 して く る.た だ し,粘 稠 性 が 強 い た め に透 明 な上 清 が得 られ難 い型 菌 株 が あ る ので,こ 降 原 と して用 い られ な い.そ の よ うな場 合 は沈 の た め に,型 抗 原 は,生 理 食 塩 液 に菌 を浮 遊 させ た も のを100℃1 時 間 加熱 して作 つ た.し か し,型 菌 株 に よつ ては 100℃1時 間 の加 熱 で,時 と して抗 原 性 の破 壊 さ れ る も のが あ る.た とえ ば,型 菌 株1,2な あ る. どで 274 感染症学雑誌 ま た,100℃ で加 熱 す る とK抗 原 ばか りで な く 同時 にO抗 原 ま で が遊 離 して き て,O抗 原に よる 交 叉 反 応 が現 わ れ て 同定 を困 難 にす る菌 株 が あ る (型 菌株7,12,39,63な ど). 結 第45巻 第7号 論 型 抗 原 は加 熱 して作 つ た.し か し,加 熱 に よつ てO抗 原 の含 有 量 が増 し,O抗 原 に よ る交 叉 反 応 が現 わ れ て 同定 を 困難 にす る型 抗 原 が あ る.こ の 加 熱 の代 りに菌 浮 遊 液 を ホ モ ジ ナ イザ ーに か け よ うな菌 株 は加 熱 の代 りに ホ モ ジナ イ ザ ー を用 い る と遠 沈 し易 くな り,透 明 な上 清 が 得 られ,か つ て作 り,良 い成 績 を得 た.72の 型 血 清 を9つ の プ ー ル血 清 に ま とめ てKlebsiella群 の 同定 を 行 な O抗 原 の遊 離 す る量 が 少 な い ので,O抗 原 による 交 叉 反 応 が除 かれ,同 定 を容 易 にす る.し か し, この方 法 で はK抗 原 の遊 難 し難 い型 菌 株 が あ る. こ の よ うな場 合 は加 熱 を 行 な うよ り仕 方 が ない . つ た. な お,本 論 文 の要 旨 は昭 和45年4月1日 第43回 日本 細 菌 学 会 総 会 に お い て発 表 した. た だ し,培 養 温 度 を35℃ で な く24℃ 前 後 で2-3 日間 培 養 した も のを ホ モ ジ ナ イザ ーに か け て 型 抗 原 を 作 る こ とが で き る.こ の場 合 に は 抗 原 価 は 一 般 に低 い よ うで あ る. O抗 原 ぼ か りで な くK抗 原 に よ る交 叉 反 応 も相 当 数 認 め られ る.こ の場 合 はO抗 原 と異 な り高 い 抗 原 価 を示 す. Henrik)sen4)はBrooke1),Edwards & Fife3)お よび 自身 の研 究 室 で作 つ た型 血 清 を もつ て交 叉 反 応 の頻 度 につ い て比 較 研 究 を行 な つ て い るが,3 研 究 室 で用 い て い る型 血 清 の反 応 パ タ ー ンに 関 し て著 明 な 相違 の あ る こ とを報 告 して い る.こ の こ とに つ い てHenriksenは お の お のの抗 原構 造 に反 応 す る個 々 の兎 の能 力 の相 違 と菌 株 の変 異 な どを 上 げ て い る、 著 者 も 同 じ菌 株 で 作 つ た 型 血 清 の示 す 交 叉 反 応 が 異 な る こ とを 経 験 して い る.し た が つ て 型 血 清 を 作 つ た な らば そ の度 ご とに 一 応 交 叉 反 応 を 調 べ てお く必 要 が あ る. 型 血 清 の反 応 の場 を 測 つ て み る と矩 形 を 呈 す る.O-1血 文 献 1) Brooke, M. S.: Further capsular antigens of Klebsiella strains. Acta Path . Microbiol. Scand. 28: 313-327, 1951. 2) Prskov, I.: Serological investigations in the Klebsiella Group. 2 occurrence of Klebsiella in sputa. Acta Path. Microbiol . Scand. 36: 454-460, 1955. 3) Edwards, P. R.: and Fife, M. A.: Capsule Types of Klebsiella . J. Inf. Dis. 91: 93-104, 1952. 4) Henriksen, S.D.: Studies on the Klebsiella Group (Kauffmann). 1. Sero-Types of a Collection of Strains from Human Sources and from Water. Acta Path . Microbiol. Scand. 34: 249-285, 1954. 5) Kauffmann, F.: On the Serology of the Kleb siella Group. Acta Path. Microbiol. Scand . 26: 382-406, 1949. 6) Kauffmann, F.: Enterobacteriaceae . 1st ed., Munksgaard, Copenhagen. 1951. 7) Kauffmann, F.: Enterobacteriaceae . 2nd ed., Munksgaard, Copenhagen. 1954. 8) 清 の反 応 の場 は四 角 形 を呈 す る.型 血 清 中O-1抗 測 つ て み る と,や 原 を もつ てO反 応 の場 を は り四 角形 を 呈す る.す なわ ち,K抗 原価 は 高 くO抗 原 価 は低 い.こ れ に反 し て,K抗 体 価 とO-1抗 体 価 は ほぼ 同 じ価 を 示 す 場 合 が 多 い よ うで あ る.た のO-2,O-3,O-4,O-5菌 体 価 は,と 株 の抗 原 価,抗 原 に よ る場 合 が 大 多 52 (第12号 補 冊): 820-844, 昭和 13年. 9) Shimizu, M.: On Vi Agglutination Especially on the Influence of Heating and Temperatures of Cultivation. J. J. Med . Scie. Biol. 5: 407-419, 1952. 10) 株以外 もに低 い よ うで あ る.し た が つ てO抗 原 に よる 交 叉 反 応 はO-1抗 数 で あ る. だ し,O-1菌 瞭: 沈 降 反 応 の 研 究 (第2報 告) ,沈降 反 応 に お け る 「反 応 の 場 」 の 形 と そ の 意 義, 東 京 医 会 誌, 体 を多 く含 ん で い る と思 わ れ る型 血 清12に つ い てO-1抗 松林 冨 沢 万 之 助: す る研 究, 11) 細 菌 誌, 13: 富 沢 万 之 助: 1-3, 318-323, ク レ プ シ ェ ー ラ菌 のK抗 原 に関 特 にK凝 集 反応 の抑 制 に つ い て, 日 734-739, 1958. Klebsiellaの 分類に関す る 研究 日 細 菌 誌, 1962. 17: 229-234 , 255-258, 昭 和46年7月20日 275 Studies on Identification of the Mannosuke Department of Klebsiella group TOMISAWA, Oral Microbiology, by Yoshiko School Precipitin Reaction HIRATA of Dentistry Iwate Medical University, Morioka, Japan (Prof. M. Tomisawa) Capsular pensions antigens of the centrifuged, In view of by of O antigen tead of heating, can be (45, 59, 69) Since sera reaction the (ca. fact were were was not divided pooled of one saline as type an as capsular and, resulting in liberated on used hour in agar type some getting medium of types rise were physiological were saline. heated at The 100•Ž saline for one sushour, antigen. antigens in of Klebsiella some (7, to O strains 12, 33, cross churned (type 39, 41, reaction, by 1, 46, 2) means blender, was 63), occasionally a large amount applied centrifuged, and here, ins the clear antigen. antigens must easily easily grown were suspensions type It not billion/ml) for in removed. were antigenicity saline used were 60 100•Ž liberated is that strains supernatants that at procedure, it Klebsiella clear heating were such gens the the was supernatants In organisms and destroyed of be contain taken liberated convenient to into 9 groups into the same into by perform each group. only few O consideration, this antigens. Therefore, however, that cross capsular reaction antigens by O anti- of some types method. the of which identification was pooled of with organisms 8 type with sera. 72 Type separate Sera type showing sera, cross
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