最近の食中毒発生状況と検査法大阪府立大学大学院生命環境科学研究科獣医学専攻感染症制御学講座山崎伸二病因物質別食中毒事件・患者・死者数事件数患者数 1999 2007 2008 1999 2007 2008 1999 2007 2008 総数 2,697 1,289 1,369 35,214 33,477 24,732 7 7 4 2,356 732 778 27,741 12,964 10,330 4 0 1 825 126 99 11,888 3,603 2,551 3 0 0 67 70 58 736 1,181 1,424 0 0 0 667 42 17 9,396 1,287 168 1 0 0 8 25 17 46 928 115 0 0 0 237 27 34 2,238 2,772 2,088 0 0 0 11 8 21 59 124 230 0 0 1 493 416 509 1,802 2,396 3,071 0 0 0 細菌総数サルモネラ属菌ブドウ球菌腸炎ビブリオ腸管出血性大腸菌ウエルッシュ菌セレウス菌ｷｬﾝﾋﾟﾛﾊﾞｸﾀｰ・ｼﾞｪｼﾞｭﾆ/ｺﾘコレラ菌 NA 0 3 NA 0 37 0 0 0 赤痢菌 NA 0 3 NA 0 131 0 0 0 その他の細菌ウイルス 56 18 17 1,632 673 515 0 0 0 総数 116 348 304 5,217 18,750 11,630 0 0 0 ノロウイルス 116 344 303 5,217 18,520 11,618 0 0 0 0 4 1 0 230 12 0 0 0 8 10 27 134 93 619 0 0 0 その他のウイルス化学物質自然毒総数細菌性食中毒原因菌死者数年 121 113 152 377 355 387 3 7 3 植物性自然毒 87 74 91 310 266 283 1 4 0 動物性自然毒 34 39 61 67 89 104 2 3 3 その他 1 8 17 1 20 47 0 0 0 不明 95 78 91 1,744 1,295 1,289 0 0 0 • • • • • • • • • • サルモネラ属菌ブドウ球菌ボツリヌス菌腸炎ビブリオ腸管出血性大腸菌ウェルシュ菌セレウス菌ナグビブリオビブリオ・ミミカスビブリオ・フルビアリス • • • • • • • • • • ｷｬﾝﾋﾟﾛﾊﾞｸﾀｰ・ｼﾞｪｼﾞｭﾆ／ｺﾘｴﾙｼﾆｱ・ｴﾝﾃﾛｺﾘﾁｶｱｴﾛﾓﾅｽ・ﾊｲﾄﾞﾛﾌｨｰﾗｱｴﾛﾓﾅｽ・ｿﾌﾞﾘｴﾌﾟﾚｼﾞｵﾓﾅｽ・ｼｹﾞﾛｲﾃﾞｽノロ（小型球形）ウイルス（H10）コレラ菌（H12）赤痢菌チフス菌パラチフス菌Ａ 1 細菌性食中毒の分類 • 毒素型：細菌の産生した毒素を摂取することにより胃腸炎を引き起こすもの。黄色ブドウ球菌のエンテロトキシンやボツリヌス毒素等 • 感染型：菌が体内で増殖しあるいは食品中で増殖した菌を大量に摂取し胃腸炎を引き起こすもの。サルモネラ、病原大腸菌等 • 混合型：毒素型と感染型の両方の性質を持つもの。腸炎ビブリオ（耐熱性溶血毒）、腸管出血性大腸菌（ベロ毒素）等細菌の検査法：PCR法の原理と実践 PCR（Polymerase Chain Reaction）法（DNA増幅法） PCRに絶対必要なもの： 1. 鋳型DNA 2. 酵素：DNA ポリメラーゼ（耐熱性） 3. プライマー：16個から24個程度のオリゴヌクレオチド 4. 基質：dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP） 5. バッファー：10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2 The Molecular Biology of the Cell, Garland Publishing Inc., New York and London 2 腸管出血性大腸菌 ●特徴：人、動物の糞便に直接・間接的に汚染された食品が原因となる ●潜伏期間：12∼72時間 ●症状：下痢、腹痛、発熱、嘔吐、溶血性尿毒症症候群を併発し、特に小児や老人では脳症で死亡することがある ●予防方法：調理器具、手指からの二次汚染防止。調理時の十分な加熱 O157の特徴 •酸性条件に比較的耐性 •乾燥に比較的強い •熱に弱い（75℃1分間以上の加熱で死滅） •消毒剤に弱い（次亜塩素酸ナトリウム等） Shiga toxin (Stx)-phage A サブユニット分子量 32,500 B サブユニット分子量7,600 Stx 大腸菌新潟大学山本達男博士撮影志賀毒素（Stx） Stx UV照射化学物質 A サブユニット: RNA N-グリコシダーゼ O157感染症の特徴 •少量の菌数（50個位）で感染が成立 •小児や老人では重症化しやすい •家族内感染が多く見られる •２次感染が多く見られる •不顕性感染者（健康保菌者）が、感染源となる B サブユニット: レセプター (糖脂質) に結合 O157 Stx Stx1 up Stx1 down Stx Stx Stx Stx Stx 志賀毒素1と2遺伝子を検出するマルチプレックス PCR PCR条件 stx1 (13-M) M 310 bp Stx stx2 (6-F) stx1, stx2 (Sakai) 103 102 101 100 103 102 101 100 103 102 101 100 N M 94℃ 1分 55℃ 1分 A B 72℃ 1分 35 cycle 110 bp Stx2 up Stx2 down Stx1とStx2遺伝子を検出するためのPCRプライマーの結合部位と PCR産物の大きさ検出限界：約10 （cfu/tube） 3 Campylobacter属細菌の培養（微好気培養）に必要な培養器カンピロバクター微好気条件 (85% N2, 5%O2, 10%CO2) 特徴：家畜、家禽、ペットなどあらゆる動物が保菌している。鶏肉が原因となることが多い潜伏期間：２∼７日（平均2∼3日）症状：腹痛、激しい下痢、発熱、嘔吐、筋肉痛まれにギランバレー症候群（多発性神経炎）予防方法：調理器具、手指からの二次汚染防止調理時の十分な加熱代表菌株：Campylobacter jejuni （人の食中毒の原因菌、鶏から高率に分離） C. coli （人の食中毒の原因菌、豚から高率に分離） C. fetus （敗血症の原因菌、まれに人の食中毒）増殖至適温度：C. jejuni, C. coli, 42℃、C. fetus, 25℃ 原因食品：食肉（特に鶏肉）、牛乳、飲料水、サラダ、鶏肉関連食品、湧き水、井戸水加湿用バット家畜への病原性：ウシやヒツジの流産、ウシやブタの腸炎カンピロバクターの電子顕微鏡写真（東京都安全健康センター）培養ジャー N2-CO2 ダブルガスインキュベーターカンピロバクター（Campylobacter）属細菌の種類と生息場所 Campylobacter属細菌の簡易培養法病気の種類水を含ませたティッシュ菌種環境中での生息場所ヒト C. jejuni ヒト、ウシ、野鳥、家禽、ペット下痢、敗血症、ギランバレー症候群、関節炎動物 C. coli ブタ、トリ、家禽、ネコ下痢 C. fetus ウシ、ヒツジ敗血症、下痢、流産 C. lari トリ、イヌ、ネコ、サル、二枚貝下痢、菌血症 C. upsaliensis ペット、家禽下痢、菌血症下痢 C. hyointestinalis ウシ、ブタ、ハムスター、シカ直腸炎、下痢増殖性出血性腸炎 C. mucosalis ブタ下痢増殖性出血性腸炎 C. sputorum ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ下痢、口腔膿瘍腸炎、羊流産 C. laniens ブタ、ウシ C. insulaengrae 海洋鯨類 C. hominis ヒト C. concisus ヒト歯周病 C. curvus ヒト歯周病、肺感染症 C. rectus ヒト歯周病 C. showae ヒト歯周病 C. helveticus ネコ、イヌ C. gracilis ヒト下痢、流産流産、不育症下痢頭頸部感染症 4 主要なCampylobacter属細菌の特徴発育温度菌種 Campylobacter属細菌の検査上の問題点カタラー馬尿酸ゼ水解活性下痢患者からの分離率* (2000年-2004年) 宿主生物 25℃ 37℃ 42℃ C. jejuni ヒト, 牛, 豚, 鶏, 犬, 猫, 野鳥, 野生動物 - + + + + 94.3% C. coli ヒト, 牛, 豚, 鶏, 犬, 猫, 猿 - + + + - 4.0% C. fetus ヒト, 牛, 羊, カメ + + - + - 1.3% C. hyointestinalis ヒト, 牛, 豚, 鶏, 猿, ハムスター, カメ + + + + - < 0.1% C. lari ヒト, 鶏, 犬, 猫, 猿, 野鳥, アザラシ, カキ, カラス貝 - + + + - < 0.2% 3. 培養温度差による発育試験が必要 (C. jejuni, C. coli は25℃で生育せず、42℃で生育可。 C. fetusは25℃で生育し、42℃では生育できない) - + + - - < 0.1% 4. 菌の生化学的性状が酷似し、菌種同定が容易でないヒト, アヒル, 犬, 猫, C. upsaliensis 猿 1．培養に時間がかかる（２∼３日） 2. 微好気培養に特殊な装置が必要 (ガスパック、インキュベーター等） *東京都立病院で得られたデータコロニーハイブリダイゼーションによるCampylobacter属細菌のcdt遺伝子の分布 Probe to C. jejuni Probe to C. coli C. jejuni, C. coli とC. fetus のcdt遺伝子は、３菌種に普遍的に存在し、菌種間では相同性が低く、菌種内では相同性が高い Probe to C. fetus C. jejuni, 11株、C. coli 10株、C. fetus 10株のcdt遺伝子の塩基配列を解析した Bacterial strain Origin (n*) cdtA cdtB cdtC cdtA cdtB cdtC cdtA cdtB cdtC C. jejuni Clinical (23) 23 23 23 0 0 0 0 0 0 C. jejuni ATCC33560 (1) 1 1 1 0 0 0 0 0 0 C. jejuni ATCC43432 (1) 1 1 1 0 0 0 0 0 0 C. jejuni Animal (2) 2 2 2 0 0 0 0 0 0 C. coli Clinical (17) 0 0 0 17 17 17 0 0 0 C. coli ATCC33559 (1) 0 0 0 1 1 1 0 0 0 C. coli ATCC43478 (1) 0 0 0 1 1 1 0 0 0 C. fetus Clinical (2) 0 0 0 0 0 0 2 2 2 C. fetus Animal (16) 0 0 0 0 0 0 16 16 16 cdtB: 99.4-100, 99.5-100, 99.3-100% (99.0, 99.8, 99.6% in average) C. fetus subsp. fetus ATCC27374 (1) 0 0 0 0 0 0 1 1 1 cdtC: 99.4-100, 99.2-100, 99.3-100% (99.1, 99.8, 99.8% in average) C. fetus subsp. venerealis ATCC19438 (1) 0 0 0 0 0 0 1 1 1 C. lari ATCC43675 (1) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 C. hyointestinalis ATCC35217 (1) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 C. upsaliensis ATCC43954 (1) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 C. helveticus ATCC51209 (1) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 菌種間の相同性(C. jejuni, C. coli, C. fetus) cdtA: 50.5-63.2%, cdtB: 62.2-70.2%, cdtC: 52.4-61.4% 菌種内の相同性 (C. jejuni, C. coli, C. fetus) cdtA: 98.6-100, 97.0-100, 97.5-100% (99.4, 99.7, 99.6% in average) cdt遺伝子は、C, jejuni、C. coli、C. fetusを菌種特異的に検出する標的 Asakura et al., Microb. Pathog., 2007. Asakura et al., Microbial Pathog, 2007. 5 Campylobacter （cdt gene） PCR Campylobacter 属菌の同定法 cdtB cdtC C A Cdt gene C. jejuni, C. coli およびC. fetusのcdtB遺伝子または cdtC遺伝子を増幅し、３菌種 M + 生物学的性状 API Campy + B C. j cdtA CdtB遺伝子増幅産物電気泳動図 f ｃ .f C. + C C. + + c j . ｃ . f C. j C. j C. N C. C C C. c Cytolethal distending toxin (Cdt) C. f Detection and Typing Kit M 遺伝学的性状 71４bp cdt gene-based multiplex PCR 533bp 16S rRNA 遺伝子の塩基配列 413bp 馬尿酸分解酵素 (hipO) 遺伝子の PCRによる検出を同時に検出・同定できる N・・・negative control (E. coli C600) M・・・100 bp ladder 2% agarose C. jejuni C. j : C.jejuni C.jejuni C. c : C. coli C. f : C.fetus : hipO遺伝子陽性 Other campylobacters : hipO遺伝子陰性鶏肉からのCampylobacterの検出食品からのCampylobacterの検査・同定法市販国産鶏肉 12検体保存や輸送中の菌への損傷７∼８日サンプルの調製検体１∼2日１∼2日 2日増菌培養分離培養純培養 42±1℃ 微好気増菌培地検体50 g＋等量生理食塩水→ストマッカー処理 2日生化学的性状試験同定増菌培養 Bolton培地＊またはPreston培地* 42℃、微好気条件 42±1℃ 微好気選択培地１２、１６、２４、４８時間後２４時間後増菌培養不可欠特殊な培養装置が必要生化学的性状が類似 Campylobacter （cdt gene） PCR Detection and Typing Kitを用いた簡便、迅速な検査 DNAテンプレートの作製分離培養 mCCDA＊、Skirrow、フィルター培養法 42℃、微好気条件ボイル法またはDNA精製ボイル法またはDNA精製４８時間後菌の分離・同定＊Campylobacter標準法案で用いられている培地 6 カンピロバクターの選択培養法カンピロバクターの増菌培養法孔径0.45μmのフィルター食肉の検査結果例 ( ボルトン増菌後、スキロー培地での分離培養）結論１．PCR法は、簡便、迅速かつ高感度な病原細菌の検出法として有用である。(( ２．PCR法と培養法を組み合わせれば、より正確かつ高率に病原細菌の分離・同定が可能となる。 ((( カンピロバクター様のコロニープレート一面に菌が遊走し、カンピロバクターに特徴的なコロニーが認められない。培養法に基づく検査法では陰性。 Multiplex PCR 陽性 7