1 TruSeq Stranded RNA サンプル調製 ..................................................................1 コース名: TruSeq Stranded RNA サンプル調製 ページ ナレーション 01_ようこそ TruSeq Stranded RNA サンプル調製キットのコースへようこそ。 続行するには [次へ] をクリックしてください。 02_ナビゲーシ ョン 受講を開始する前に、このコースのナビゲーション、つまり進め方に関 する指示情報をお読みください。これらの指示情報をコースの途中で表 示したい場合は、ページの右上隅に表示されている [ヘルプ] ボタンをク リックしてください。 03_レッスンの 目標 このコースを終了すると、以下の質問に回答できるようになります。 - TruSeq Stranded mRNA サンプル調製プロトコルとは何？ - TruSeq Stranded Total RNA サンプル調製プロトコルとは何？ 「TruSeq Stranded RNA Sample Preparation Guides (TruSeq Stranded RNA サン プル調製ガイド)」をダウンロードするには、ページの下部にあるリンク をクリックしてください。 04_TruSeq Stranded mRNA サンプ ル調製プロト コルとは何？ TruSeq Stranded mRNA サンプル調製プロトコルの最初のステップでは、 poly-T オリゴが結合した磁気ビーズを用いて、mRNA 分子を持つ poly-A を精製します。 精製後、mRNA は温度上昇下において二価陽イオンを使って小断片化され ます。これによって、トランスクリプトームはうまく取り扱われます。 開裂 RNA 断片は、逆転写酵素とランダムプライマーを用いて、第 1 鎖 cDNA にコピーされます。 サンプルの鎖特異性は、第 2 鎖合成プロセスで dTTP を dUTP に置き換え ることにより達成されますが、アッセイ内で用いられるポリメラーゼは 前のこのヌクレオチドを組み込まないため、この鎖に関して後続の増幅 はクエンチされます。この手順の最終生成物は平滑末端の 2 重鎖 cDNA 分子になります。 cDNA の末端に A-base を加えて、アダプターライゲーション反応の間 に平滑末端の断片同士が互いにライゲーションするのを防ぎます。 次に、マルチインデックスアダプターを DNA 断片の末端にライゲーショ ンし、フローセルへのハイブリダイゼーションに対して調製するライゲ ーション反応が発生します。 Online Training Transcript (オンライントレーニングトランスクリプト) [email protected] 2 ページ ナレーション これらの産物がさらに精製され、PCR で濃縮されると、最終 cDNA ライブ ラリーが作製されます。 05_Stranded Total RNA サン プル調製プロト コルとは何？ TruSeq Stranded Total RNA サンプル調製プロトコルの最初の手順では、新 鮮組織または FFPE 組織から抽出された total RNA のリボソーム RNA が減 少します。減少プロセスの後、残った RNA は精製され、温度上昇下にお いて二価陽イオンを使って小断片化されます。これによって、トランス クリプトームはうまく取り扱われます。 開裂 RNA 断片は、逆転写酵素とランダムプライマーを用いて、第 1 鎖 cDNA にコピーされます。 サンプルの鎖特異性は、第 2 鎖合成プロセスで dTTP を dUTP に置き換える ことにより達成されますが、アッセイ内で用いられるポリメラーゼは前の このヌクレオチドを組み込まないため、この鎖に関して後続の増幅はクエ ンチされます。この手順の最終生成物は平滑末端の 2 重鎖 cDNA 分子にな ります。 cDNA の末端に A-base を加えて、アダプターライゲーション反応の間 に平滑末端の断片同士が互いにライゲーションするのを防ぎます。 次に、マルチインデックスアダプターを DNA 断片の末端にライゲーショ ンし、フローセルへのハイブリダイゼーションに対して調製するライゲ ーション反応が発生します。 これらの産物がさらに精製され、PCR で濃縮されると、最終 cDNA ライブ ラリーが作製されます。 06_どのキット Illumina はさまざまなキット構成を提供しています。キットの選択は、 を使うべきです 処理するサンプル数だけでなく、研究の対象とする RNA の種類によって か？ 異なります。 Illumina の TruSeq Stranded mRNA サンプル調製キットは、ポリアデニル化 された mRNA 分子に注目している研究を対象としています。高品質な RNA インプットを使用する必要があります。 Illumina のTruSeq Stranded Total RNA サンプル調製キットは、ヒト、マウ ス、またはラットの新鮮組織または FFPE 組織由来の、mRNA および非コ ード RNA を含む非リボソーム RNA をすべて抽出します。Total RNA サン プル調製キットには、次の 2 つのサブカテゴリーがあります。Ribozero および Ribozero Gold です。Ribozero Gold キットには、ミトコンドリアリ ボソーム RNA を減少させる追加機能があります。 すべてのキットは、次の 2 つの異なるサイズ構成になります。高スルー プットまたは HT および低スループットまたは LT。LT キットは 12 の固有 なインデックスで 48 サンプルを調製するのに十分な量の試薬を提供しま す。HT インデックス。HT キットは 96 の固有なインデックスで 96 サン プルを調製するのに十分な量の試薬を提供します。 Online Training Transcript (オンライントレーニングトランスクリプト) [email protected] 3 ページ ナレーション 07_オプション について Illumina は、処理するサンプル数に応じて、2 つの異なるプロトコルを 提供しています。実験に適したプロトコルを判断するには、こちら側 の表をご覧ください。使用するプロトコルは購入されたキットによって 左右されないことに注意してください。たとえば、高スループット (HT) キットを購入し、それを低スループット (LS) プロトコルで使用するとし ます。 08_TruSeq Stranded mRNA LT サン プル調製プロ トコルの完了 に必要なもの TruSeq Stranded mRNA LT サンプル調製プロトコルを完了するには、以下 のいくつかのアイテムを必要とします。 • まず、ユーザーマニュアルが必要です。これには、高サンプルと低 サンプルのプロトコルが含まれています。 • プロトコルを完了するための各種キット。 • ユーザーが用意しなければならないその他の物 (詳しくはユーザーガ イドに記載) 詳細については、各項目をクリックしてください。 09_TruSeq Stranded mRNA HT サン プル調製プロ トコルの完了 に必要なもの TruSeq Stranded mRNA HT サンプル調製プロトコルを完了するには、以下 のいくつかのアイテムを必要とします。 • まず、ユーザーマニュアルが必要です。これには、高サンプルと低 サンプルのプロトコルが含まれています。 • プロトコルを完了するための各種キット。 • ユーザーが用意しなければならないその他の物 (詳しくはユーザーガ イドに記載) 詳細については、各項目をクリックしてください。 10_TruSeq Stranded Total LT サンプル調 製プロトコル の完了に必要 なもの TruSeq Stranded Total RNA LT サンプル調製プロトコルを完了するには、以 下のいくつかのアイテムを必要とします。 • まず、ユーザーマニュアルが必要です。これには、高サンプルと低 サンプルのプロトコルが含まれています。 • プロトコルを完了するための各種キット。 • ユーザーが用意しなければならないその他の物 (詳しくはユーザーガ イドに記載) 詳細については、各項目をクリックしてください。 11_TruSeq Stranded Total HT サンプル調 製プロトコル の完了に必要 なもの TruSeq Stranded Total RNA HT サンプル調製プロトコルを完了するには、 以下のいくつかのアイテムを必要とします。 • まず、ユーザーマニュアルが必要です。これには、高サンプルと低 サンプルのプロトコルが含まれています。 • プロトコルを完了するための各種キット。 • ユーザーが用意しなければならないその他の物 (詳しくはユーザーガ イドに記載) 詳細については、各項目をクリックしてください。 Online Training Transcript (オンライントレーニングトランスクリプト) [email protected] 4 ページ ナレーション 12_TruSeq Stranded mRNA 調製ワ ークフロー ここでは、TruSeq Stranded mRNA 調製ワークフローを確認します。 詳細については、各手順をクリックしてください。 各ステップが機能する方法や、各ステップに直接関連するベストプラク ティスをご覧いただけます。 13_TruSeq ここでは、TruSeq Stranded Total RNA 調製ワークフローを確認します。 Stranded Total 詳細については、各手順をクリックしてください。 RNA 調製ワーク 各ステップが機能する方法や、各ステップに直接関連するベストプラク フロー ティスをご覧いただけます。 14_サマリ これで、以下の質問に回答できるようになったはずです。 • • TruSeq Stranded mRNA サンプル調製プロトコルとは何？ TruSeq Stranded Total RNA サンプル調製プロトコルとは何？ 『TruSeq Stranded RNA Samples Preparation Guides (TruSeq Stranded RNA サ ンプル調製ガイド)』をダウンロードするには、ページの下部にあるリン クをクリックしてください。 15_レッスンの 完了 おめでとうございます！このコースの受講が完了しました。TruSeq Stranded RNA サンプル調製の詳細については、キットと試薬サポートペ ージを参照してください。 Online Training Transcript (オンライントレーニングトランスクリプト) [email protected]
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