試薬ガイド
Applied Biosystems StepOne™
および StepOnePlus™
Real-Time PCR Systems
Applied Biosystems StepOne™
および StepOnePlus™ Real-Time
PCR Systems
試薬ガイド
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部品番号 4377716 Rev. C
06/2010
目次
序章
このガイドの使用方法 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vii
詳細に関する参考資料 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ix
サポートの受け方 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xii
第1章
はじめに
StepOne™ および StepOnePlus™ システムについて . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-2
使用可能な消耗品 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-4
実験の準備 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-6
実験タイプの選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-7
試薬タイプの選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-8
アッセイタイプの選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-9
第2章
試薬の概要
概要 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-2
TaqMan® 試薬 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-2
SYBR® Green 試薬 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-4
適切な試薬タイプの選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-6
DNA 汚染の最小限化 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-7
第3章
定量実験
セクション 3.1: 定量実験について . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-3
概要 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-4
定量方法の選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-5
1 ステップまたは 2 ステップ RT-PCR の選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-8
シングルプレックスまたはマルチプレックス PCR の選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-10
試薬タイプの選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-12
アッセイタイプの選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-12
セクション 3.2: 設計ガイドライン . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-15
Inventoried/Made to Order（在庫／注文生産）アッセイ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-16
TaqMan® Gene Expression Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-16
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
iii
Custom TaqMan® Gene Expression Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-18
マスターミックスの選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-19
実験の設計 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-20
カスタムアッセイ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-21
Primer Express® Software を使ったプライマーとプローブの設計 . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-21
試薬の選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-24
推奨サーマルサイクリング条件の使用 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-27
プライマー濃度の最適化 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-30
プローブ濃度の最適化 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-33
詳細について . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-35
第4章
ジェノタイピング実験
セクション 4.1: ジェノタイピング実験について . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-3
概要 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-4
アッセイタイプの選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-6
セクション 4.2: 設計ガイドライン . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-9
設計済み／検証済みアッセイ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-10
TaqMan® SNP Genotyping Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-10
TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-11
Pre-Developed TaqMan® Assay Reagents for Allelic Discrimination . . . . . . . . . . . . . . 4-12
マスターミックスの選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-13
実験の設計 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-14
カスタムアッセイ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-14
Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-14
マスターミックスの選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-16
実験の設計 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-16
第5章
有無実験
セクション 5.1: 有無実験について . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-3
概要 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-4
アッセイタイプの選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-6
セクション 5.2: 設計ガイドライン . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-9
Inventoried/Made to Order（在庫／注文生産）アッセイ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-10
TaqMan® Gene Expression Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-10
Custom TaqMan® Gene Expression Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-12
TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-13
マスターミックスの選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-15
実験の設計 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-16
カスタムアッセイ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-16
iv
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
付録 A
計算式
標準曲線法を用いた標準偏差の計算 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A-2
比較法を用いた標準偏差の計算 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A-5
比較 CT（∆∆CT）実験用計算式 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A-7
付録 B
マルチプレックス PCR におけるプライマーの制限
付録 C
アッセイ設計ガイドライン
付録 D
試薬部品番号
定量実験 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . D-2
Inventoried/Made to Order（在庫／注文生産）アッセイ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . D-2
カスタムアッセイ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . D-2
ジェノタイピング実験 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . D-5
設計済み／検証済みアッセイ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . D-5
カスタムアッセイ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . D-5
有無実験 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . D-7
Inventoried/Made to Order（在庫／注文生産）アッセイ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . D-7
カスタムアッセイ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . D-8
参考文献
用語集
索引
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
v
vi
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
序章
このガイドの使用方法
システム文書に
ついて
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems（StepOne™
および StepOnePlus™ システム）には、以下に示したガイドが付属しています。
参考： 本ガイドで使用される Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ RealTime PCR Systems という表記は、Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System
および Applied Biosystems StepOnePlus™ Real-Time PCR System の 2 製品を示します。
ガイド
Applied Biosystems StepOne™ and
StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems
Getting Started Guide for Genotyping
Experiments
Applied Biosystems StepOne™ and
StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems
Getting Started Guide for Presence/Absence
Experiments
Applied Biosystems StepOne™ and
StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems
Getting Started Guide for Relative Standard
Curve and Comparative CT Experiments
目的と対象
PN
日本語版
PN
StepOne および StepOnePlus システムで実験を行
う方法を解説します。各『入門ガイド』には次の 2
つの機能があります。
4376786
4377731
4376787
4377722
4376785
4377740
4376784
4377734
4376782
4377796
4376783
4377790
4379704
4377716
• Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR
Software（StepOne™ ソフトウェア）で提供され
ている実験データ例を使ったチュートリアル。
• 実際の実験のためのガイド。
StepOne または StepOnePlus システムを使って実
験を実施する実験室スタッフや研究者を対象に書
かれています。
Applied Biosystems StepOne™ and
StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems
Getting Started Guide for Standard Curve
Experiments
Applied Biosystems StepOne™ and
StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems
Installation, Networking, and Maintenance
Guide
Applied Biosystems StepOne™ and
StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems
Installation Quick Reference Card
Applied Biosystems StepOne™ and
StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems
Reagent Guide
StepOne および StepOnePlus システムの設置とメ
ンテナンスの方法を解説します。
StepOne または StepOnePlus システムを設置、メ
ンテナンスする実験室スタッフを対象に書かれて
います。
StepOne および StepOnePlus システムで使用する試
薬に関する情報を提供し、以下のものが含まれます。
• TaqMan® および SYBR® Green 試薬に関する序論
• 以下の実験タイプに対する設計ガイドラインの
説明
– 定量実験
– ジェノタイピング実験
– 有無実験
StepOne または StepOnePlus システムを使って実
験を実施する実験室スタッフや研究者を対象に書
かれています。
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
vii
序章
目的と対象
PN
日本語版
PN
Applied Biosystems StepOne™ and
StepOnePlusô Real-Time PCR Systems Site
Preparation Guide
StepOne および StepOnePlus システムの受け取り
と設置に向けた設置場所の準備作業を解説します。
4376768
4378357
Applied Biosystems StepOne™ Real-Time
PCR Software Help
StepOne ソフトウェアを用いて以下の事項を行う
方法を解説します。
該当せず
該当せず
ガイド
StepOne または StepOnePlus システムの設置前に
しておくべき設置場所の準備作業をスケジュール
設定、管理、実施する担当者向けに書かれています。
• StepOne および StepOnePlus システムで実験の
セットアップ、測定、解析。
• ネットワーク上の StepOne および StepOnePlus
装置の監視。
• StepOne および StepOnePlus 装置のキャリブ
レーション。
• RNase P 測定による StepOne および StepOnePlus
装置の性能確認。
対象：
• StepOne または StepOnePlus システムを使って
実験を実施する実験室スタッフや研究者。
• StepOne または StepOnePlus システムを設置、
メンテナンスする実験室スタッフ。
前提条件
本書は、次のことを前提に書かれています。
• Microsoft Windows® XP オペレーティングシステムに精通している。
• インターネットとインターネットブラウザに精通している。
• DNA または RNA サンプルの取扱いおよび PCR のための調製方法に関する知識が
ある。
• データ保存、ファイル転送、コピーと貼り付けを理解している。
• 既存の実験データフローへ StepOne または StepOnePlus システムを組み込む場合、
ネットワーク構築の経験がある。
テキスト表記法
本書では、次の表記法を採用しています。
• 太字はユーザーが行う操作を示します。次に例を示します。
0 を入力してから、残りの各フィールドで Enter を押します。
• 斜体 文字は、新規または重要な用語を示すほか、強調する際にも使われます。次に
例を示します。
解析前に、必ず 新しいマトリックスを調製してください。
• 右矢印記号（）は、ドロップダウンまたはショートカットメニューからユーザー
が続けて選択すべきコマンドの区切りとして使われます。次に例を示します。
（開く）を選びます。
［File］（ファイル）［Open］
ユーザーの注意を
促す語句
Applied Biosystems ユーザー文書では、ユーザーの注意を促す 2 種類の用語が使われて
います。各語句は、次のような注意や対応が必要なことを示します。
参考： － 必ずしも製品の使用に不可欠というわけではありませんが、製品を使用する上
で役に立つ情報です。
重要！ － 装置の適切な操作、試薬キットの正しい使用、化学薬品の安全な使用にとって
必要な情報を提供します。
viii
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
序章
ユーザーの注意を促す用語の例を下記に示します。
参考：［Calibrate］
（キャリブレーション）機能は、コントロールコンソールでも利用で
きます。
重要！ クライアント接続を確認するには、有効なユーザー ID が必要です。
詳細に関する参考資料
関連文書
StepOne および StepOnePlus システム文書
下表に示した文書は、StepOne または StepOnePlus 装置に付属していません。以下の文
書は、2007 年 7 月以降入手可能となります。
文書
PN
Applied Biosystems StepOne™ and StepOnePlus™ Real-Time PCR
Systems Installation Performance Verification Protocol
4376791
Applied Biosystems StepOne™ and StepOnePlus™ Real-Time PCR
Systems Installation Qualification-Operation Qualification Protocol
4376790
Applied Biosystems StepOne™ and StepOnePlus™ Real-Time PCR
Systems Planned Maintenance Protocol
4376788
ジェノタイピング実験関連文書
文書
PN
Allelic Discrimination Pre-Developed TaqMan® Assay Reagents Quick
Reference Card
4312212
Custom TaqMan® Genomic Assays Protocol
4367671
Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays Protocol
4334431
Ordering TaqMan® SNP Genotyping Assays Quick Reference Card
4374204
Performing a Custom TaqMan® SNP Genotyping Assay for 96-Well Plates
Quick Reference Card
4371394
Performing a TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assay for 96-Well
Plates Quick Reference Card
4367636
Pre-Developed TaqMan® Assay Reagents Allelic Discrimination Protocol
4312214
TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays Protocol
4362038
TaqMan® SNP Genotyping Assays Protocol
4332856
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
ix
序章
有無実験関連文書
文書
PN
DNA Isolation from Fresh and Frozen Blood, Tissue Culture Cells, and
Buccal Swabs Protocol
4343586
NucPrep® Chemistry: Isolation of Genomic DNA from Animal and Plant
Tissue Protocol
4333959
PrepMan® Ultra Sample Preparation Reagent Protocol
4318925
相対標準曲線および比較 CT 実験関連文書
文書
PN
Amplification Efficiency of TaqMan® Gene Expression Assays Application
Note
127AP05
Applied Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits
Protocol
4375575
Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol
4334429
Primer
Express®
Software Version 3.0 Getting Started Guide
4362460
TaqMan® Gene Expression Assays Protocol
4333458
User Bulletin #2: Relative Quantitation of Gene Expression
4303859
標準曲線実験関連文書
文書
x
PN
Amplification Efficiency of TaqMan® Gene Expression Assays Application
Note
127AP05
Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol
4334429
Primer Express® Software Version 3.0 Getting Started Guide
4362460
TaqMan® Gene Expression Assays Protocol
4333458
User Bulletin #2: Relative Quantitation of Gene Expression
4303859
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
序章
試薬ガイド関連文書
文書
PN
Applied Biosystems High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits
Protocol
4375575
Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol
4334429
Custom TaqMan® Genomic Assays Protocol: Submission Guidelines
4367671
Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays Protocol
4334431
Power SYBR® Green PCR Master Mix and RT-PCR Protocol
4367218
Pre-Developed TaqMan® Assay Reagents Allelic Discrimination Protocol
4312214
Primer Express® Software Version 3.0 Getting Started Guide
4362460
SYBR® Green PCR and RT-PCR Reagents Protocol
4304965
SYBR® Green PCR Master Mix and RT-PCR Reagents Protocol
4310251
TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays Protocol
4362038
TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents Protocol
4308335
TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕) Protocol
4351891
TaqMan® Gene Expression Assays Protocol
4333458
TaqMan® Gene Expression Master Mix Protocol
4371135
TaqMan® Genotyping Master Mix Protocol
4371131
TaqMan® SNP Genotyping Assays Protocol
4332856
TaqMan® Universal PCR Master Mix Protocol
4304449
User Bulletin #2: Relative Quantitation of Gene Expression
4303859
Using TaqMan® Endogenous Control Assays to Select an Endogenous
Control for Experimental Studies Application Note
127AP08
参考： その他の文書については、「サポートの受け方」（xii ページ）をご参照ください。
ソフトウェア
ヘルプ情報の入手
StepOne ソフトウェアヘルプは、ユーザーインターフェースの各機能の使い方を説明し
ます。ソフトウェア内のヘルプにアクセスするには、下記のいずれかを行います。
• F1 を押します。
• ツールバーの
をクリックします。
• ［Help］（ヘルプ）［StepOne Software Help］（StepOne ソフトウェアヘルプ）
を選択します。
ヘルプで関心トピックを見つけるには：
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Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
xi
序章
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までお問い合わせください。
xii
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
1
はじめに
本章の内容：
StepOne™ および StepOnePlus™ システムについて . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-2
使用可能な消耗品 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-4
実験の準備 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-6
実験タイプの選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-7
試薬タイプの選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-8
アッセイタイプの選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1-9
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
1-1
第 1 章 はじめに
StepOne™ および StepOnePlus™ システムについて
Real-Time PCR システムには、2 つのモデルがあります。
システム
特徴
Applied Biosystems StepOne™ Real-Time
PCR System（StepOne™ システム）
• 48 ウェルプラットフォーム
• 3 色システム
Applied Biosystems StepOnePlus™ Real• 96 ウェルプラットフォーム
Time PCR System（StepOnePlus™ システム） • 4 色システム
• VeriFlex™ サンプルブロック
StepOne および StepOnePlus システムでは、蛍光ベースのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）
試薬を使って、次の機能を提供します。
• リアルタイム解析を使ったターゲット核酸配列（ターゲット）の定量検出
• PCR 後（エンドポイント）解析を使ったターゲットの定性検出
• PCR 生成物の定性解析（PCR 後の融解曲線解析による）
データ収集について
StepOne および StepOnePlus システムは、実施する測定タイプに応じて、PCR 中に様々
なポイントで生の蛍光データを収集します。
測定タイプ
リアルタイム
測定
標準曲線法
データ収集ポイント
装置は、PCR の各伸長ステップ後にデータを収集し
ます。
相対標準曲線法
比較 CT（∆∆CT）
ジェノタイピング
PCR 後
（エンドポイント） 実験
測定
有無実験
装置は、次のポイントでデータ収集を行います。
• PCR 前（有無実験の場合には、PCR 前のデータ
収集はオプションですが、推奨されています。）
• （オプション）PCR 中。装置は、測定中（リアル
タイム）にデータを収集できます。測定中のデー
タ収集は、トラブルシューティングに役立ちま
す。
• PCR 後
測定タイプに関わらず、StepOne™ または StepOnePlus™ 装置によるデータ収集ポイント
または読取は、3 相で構成されています。
1. 励起 － 装置内にある反応プレートのすべてのウェルを照射し、各反応でフルオロ
フォアを励起します。
2. 放射 － 装置の光学系は、反応プレートのウェルから放射された残留蛍光を収集し
ます。装置で収集されたイメージは、放射波長の範囲に対応する光だけで構成され
ています。
3. 収 集 － 装 置 は、一 定 時 間 内 に 収 集 さ れ た 残 留 蛍 光 を デ ジ タ ル 表 示 し ま す。
StepOne™ ソフトウェアには、解析向けに生の蛍光イメージが保存されます。
1-2
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
第 1 章 はじめに
測定後、StepOne ソフトウェアは、キャリブレーションデータ（空間、Dye、Background）
を使って、各読取における蛍光信号の位置と強度、各蛍光信号に関与する色素、信号の
重要性を特定します。
フィルタについて
StepOne および StepOnePlus システムでは、以下のフィルタを使用します。
StepOne システム
フィルタ
1
色素
StepOnePlus システム
フィルタ
FAM™ 色素
1
SYBR® Green 色素
2
JOE™ 色素
ROX™ 色素
FAM™ 色素
SYBR® Green 色素
2
VIC® 色素
3
色素
JOE™ 色素
VIC® 色素
3
TAMRA™ 色素
NED™ 色素
4
VeriFlex™ 技術に
ついて
ROX™ 色素
StepOnePlus 装置には、個別に熱制御可能な VeriFlex™ ブロックが 6 個あり、サーマル
サイクリング条件の最適化が容易です。VeriFlex ブロックは、それぞれ異なる温度設定
をしてサンプルに応じて最高で 6 つのゾーンを作成することも、すべての VeriFlex ブ
ロックを同じ温度にすることも可能です。
詳細について
本書に記載されている各トピックに関する詳細について Applied Biosystems StepOne™
Real-Time PCR System Software v2.0 内のヘルプにアクセスするには、F1 を押すか、
ツールバーの
をクリックするか、［Help］
（ヘルプ）［StepOne Software Help］
（StepOne Software ヘルプ）を選択します。
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
1-3
第 1 章 はじめに
使用可能な消耗品
StepOne システム
StepOne システムでは、以下に挙げる消耗品を使用できます。これらの消耗品は、標準
および高速試薬／プロトコルの両方で使用可能です。
重要！ 標準試薬を用いた実験でも、StepOne および StepOnePlus システムでは Fast 用
消耗品（反応プレート、チューブストリップ、チューブ）以外は使用しないでください。
消耗品
部品番号
• MicroAmp™ Fast Optical 48-Well Reaction Plate
• MicroAmp™ 48-Well Optical Adhesive Film
• 4375816
• MicroAmp™ Fast 8-Tube Strip
• MicroAmp™ Optical 8-Cap Strip
• 4358293
• 4323032
• MicroAmp® Fast Reaction Tube with Cap
• 4358297
• MicroAmp™ Fast 48-Well Tray
• MicroAmp™ 48-Well Base Adaptor
• MicroAmp™ 96-Well Support Base
• 4375282
• 4375284
• 4379590
• 4375323 と
4375928
D
E
F
B
B
G
#
A
H
C
C
消耗品
A
MicroAmp™
Fast Optical 48-Well Reaction Plate
B
MicroAmp™
Fast 48-Well Tray
C
MicroAmp™
96-Well Support Base
D
MicroAmp™ Optical 8-Cap Strip
E
MicroAmp™ Fast 8-Tube Strip
F
MicroAmp® Fast Reaction Tube with Cap
G
MicroAmp™ 48-Well Optical Adhesive Film
H
MicroAmp™ 48-Well Base Adaptor
1-4
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
H
C
第 1 章 はじめに
StepOnePlus
システム
StepOnePlus システムでは、以下に挙げる消耗品を使用できます。これらの消耗品は、
標準および高速試薬／プロトコルの両方で使用可能です。
重要！ 標準試薬を用いた実験でも、StepOne および StepOnePlus システムでは Fast 用
消耗品（反応プレート、チューブストリップ、チューブ）以外は使用しないでください。
消耗品
部品番号
• MicroAmp™ Fast Optical 96-Well Reaction Plate with
Barcode
• MicroAmp™ Optical Adhesive Film
• 4346906 と
4366932
• MicroAmp™ Fast 8-Tube Strip
• MicroAmp™ Optical 8-Cap Strip
• 4358293
• 4323032
• MicroAmp® Fast Reaction Tube with Cap
• 4358297
• MicroAmp™ 96-Well Tray for VeriFlex™ Blocks
• MicroAmp™ 96-Well Support Base
• 4379983
• 4379590
• MicroAmp™ Adhesive Film Applicator
• 4333183
• 4330015
• MicroAmp™ Cap Installing Tool（ハンドル）
• 4360954 と
4311971
D
G
E
F
A
C
#
B
B
C
C
消耗品
A
MicroAmp™
Fast Optical 96-Well Reaction Plate
B
MicroAmp™
96-Well Tray for VeriFlex™ Blocks
C
MicroAmp™ 96-Well Support Base
D
MicroAmp™ Optical 8-Cap Strip
E
MicroAmp™ Fast 8-Tube Strip
F
MicroAmp® Fast Reaction Tube with Cap
G
MicroAmp™ Optical Adhesive Film
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
1-5
第 1 章 はじめに
実験の準備
一般的な
ワークフロー
StepOne および StepOnePlus システムで実験を行う前に、以下のように実験の準備を行
います。
1. 実験タイプの選択（1-7 ページ）。
2. 試薬タイプの選択（1-8 ページ）。
3. アッセイタイプの選択（1-9 ページ）。
本書中の情報
本章には、StepOne および StepOnePlus システムで使用可能な実験タイプ、試薬タイプ
およびアッセイタイプに関する一般的な情報が記載されています。
続く各章には、具体的な情報が記載されています。
章
説明
第 2 章「試薬の概要」
• TaqMan® 試薬と SYBR® Green 試薬に関する説明と
比較
• DNA 汚染を最小限に抑える方法に関する情報
第 3 章「定量実験」
• 各実験タイプの機能に関する説明
• 各実験タイプに関する具体的なワークフローの説明
• 各アッセイタイプに関する設計ガイドラインの説明
第 4 章「ジェノタイピング実験」
第 5 章「有無実験」
1-6
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
第 1 章 はじめに
実験タイプの選択
本書では、実験という用語は、StepOne または StepOnePlus システムでの測定実施のプ
ロセス全体を指し、セットアップ、測定、解析を含みます。StepOne および StepOnePlus
システムを用いて、以下のタイプの実験を実施できます。
• 次の方法による定量実験：
– 標準曲線法
– 相対標準曲線法
– 比較 CT（∆∆CT）
• ジェノタイピング実験
• 有無実験
参考： StepOne および StepOnePlus システムを用いて、融解曲線解析も実施できます。
をクリックするか、F1 を押して、StepOne ソフト
詳細については、ツールバーの
ウェアのヘルプにアクセスしてください。
エンドポイント実験
対リアルタイム実験
3 種類の実験タイプは、以下に示すように、リアルタイム実験またはエンドポイント実
験として分類できます。
種類
特徴
リアルタイム
• 装置は、PCR の進捗状況をリアルタイムで監視
します。‡
• データは、PCR プロセス全体を通して収集され
ます。
• サイクリング中にターゲットの増幅が最初に検
出された時点で、反応の特徴づけが行われます。§
エンド
ポイント
実験タイプ
定量
• データは、PCR プロセス終了後に収集されます。 ジェノタイピング
• PCR の終了時に蓄積されたターゲット量によっ
有無
て、反応の特徴づけが行われます。
• データポイントは、レポーター色素のノーマライ
ズ済み信号強度、すなわち Rn です。
参考：エンドポイント実験の中には、PCR 前のデー
タポイントを含むものもあります。その場合には、
システムが以下の式により、delta Rn（∆Rn）値を計
算します。
（PCR後読み取り）– Rn
（PCR前読み取り）
∆Rn = Rn
Rn は、ノーマライズ済みレポーター
‡ Kwok and Higuchi, 1989.
§ Saiki et al., 1985.
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
1-7
第 1 章 はじめに
試薬タイプの選択
StepOne および StepOnePlus システムでは、以下の試薬タイプ（ケミストリ）が使用可
能です。
• TaqMan® 試薬
• SYBR® Green 試薬
• その他の蛍光ベース試薬
TaqMan 試薬
TaqMan 試薬には、Applied Biosystems TaqMan® アッセイ（プローブとプライマーの
セットを含む調製済みミックス）および Applied Biosystems TaqMan® マスターミック
スがあります。TaqMan 試薬を用いて次のタイプの実験を実施できます。
• 次の方法による定量実験：
– 標準曲線法
– 相対標準曲線法
– 比較 CT（∆∆CT）
• ジェノタイピング実験
• 有無実験
重要！ Applied Biosystems は、TAMRA™ 色素をレポーターやクエンチャーとして
StepOne システムで使うことはお勧めしません。TAMRA 色素は、StepOnePlus システ
ムでレポーターやクエンチャーとして使えます。
SYBR Green 試薬
SYBR Green 試薬には、プライマーと SYBR® Green 色素を含有するマスターミックス
とが含まれています。SYBR Green 試薬を用いて、定量実験が実施できます。
• 標準曲線法
• 相対標準曲線法
• 比較 CT（∆∆CT）
参考： SYBR Green 試薬を用いてマルチプレックス PCR を実施することはできません。
詳細については、
「シングルプレックスまたはマルチプレックス PCR の選択」
（3-10 ペー
ジ）をご参照ください。
その他の試薬
StepOne および StepOnePlus システムでは、他の蛍光ベース試薬も使用できますが、
StepOne ソフトウェアをご使用の際には、以下の事項にご注意ください。
• ［Design Wizard］（設定ウィザード）ではなく、［Advanced Setup］（高度なセット
アップ）により、実験を設計する必要があります。
• Applied Biosystems TaqMan および SYBR Green 試薬を使用すると、StepOne ソ
フトウェアの［Reaction Setup］
（反応セットアップ）画面で自動的に反応量が計算
されます。
1-8
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
第 1 章 はじめに
アッセイタイプの選択
StepOne ソフトウェアでは、定量、有無およびジェノタイピング実験で、以下のアッセ
イタイプを選択できます。
実験タイプ
定量 ‡
有無
ジェノタイピング
アッセイタイプ
参照
• Inventoried/Made to Order
（在庫／注文生産）
• カスタム
下記
• 設計済み／検証済み
• カスタム
• ユーザー設計
1-10 ページ
‡ 定量実験には、標準曲線法、相対標準曲線および比較 CT 法による実験が含まれます。
定量および
有無実験
Inventoried/Made to Order（在庫／注文生産）アッセイ
定量または有無実験で以下の試薬を使用している場合は、StepOne ソフトウェアで、
Inventoried/Made to Order（在庫／注文生産）アッセイタイプを選択します。
• TaqMan® Gene Expression Assays、Inventoried － 設計済み FAM™ 色素ラベル
化 TaqMan® MGB（マイナーグルーブバインダー）プローブとプライマーの既製品
セット。このアッセイミックスは、1 本の調製済み 20✕ チューブに入っています。
• TaqMan® Gene Expression Assays、Made to Order － 設計済み FAM 色素ラベ
ル化 TaqMan MGB プローブとプライマーのセットで、注文後に製造されるもの。
このアッセイミックスは、1 本の調製済み 20✕ チューブに入っています。
• Custom TaqMan® Gene Expression Assays － FAM 色素ラベル化 TaqMan MGB
プローブとプライマーのセットで、提示のあった配列情報に基づいて Custom
TaqMan® Genomic Assays サービスが設計、合成、調製したもの。このアッセイ
ミックスは、1 本の調製済み 20✕ または 60✕ チューブに入っています。
（設
参考： StepOne ソフトウェアでアッセイタイプを選択するには、［Design Wizard］
計ウィザード）または［Advanced Setup］
（高度なセットアップ）から［Reaction Setup］
（アッセイタイプ）ドロップダウンメ
（反応セットアップ）画面を開き、［Assay Type］
ニューで［Inventoried/Made to Order］（在庫／注文生産）を選択します。
カスタムアッセイ
Primer Express® Software と TaqMan または SYBR Green 試薬を用いて独自のアッセイ
（プライマーとプローブ）を設計している場合、定量および有無実験には、StepOne ソフ
（カスタム）アッセイタイプを選択します。独自のアッセイを設
トウェアで［Custom］
計する際には、最善の結果を得るために Applied Biosystems のアッセイ設計ガイドライ
ンに従ってください。
重要！ Applied Biosystems は、TAMRA™ 色素をレポーターやクエンチャーとして
StepOne システムで使うことはお勧めしません。TAMRA 色素は、StepOnePlus システ
ムでレポーターやクエンチャーとして使えます。
参考： StepOne ソフトウェアでアッセイタイプを選択するには、［Design Wizard］
（設
計ウィザード）または［Advanced Setup］
（高度なセットアップ）から［Reaction Setup］
（アッセイタイプ）ドロップダウンメ
（反応セットアップ）画面を開き、［Assay Type］
ニューで［Custom］（カスタム）を選択します。
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
1-9
第 1 章 はじめに
ジェノタイピング
実験
設計済み／検証済みアッセイ
ジェノタイピング実験では、設計済み／検証済みアッセイタイプには、次の試薬が含ま
れます。
• TaqMan® SNP Genotyping Assays － 設計済み FAM™ 色素および VIC® 色素ラベ
ル化 TaqMan® MGB（マイナーグルーブバインダー）プローブとプライマーのセッ
トで、TaqMan® Pre-Designed SNP Genotyping Assays として販売されています。
TaqMan Pre-Designed SNP Genotyping Assays は、注文後に製造します（Made to
Order）。このアッセイミックスは、1 本の調製済み 20✕ チューブに入っています。
• TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays － 設計済み FAM 色素および VIC
色素ラベル化 TaqMan MGB プローブとプライマーの既製品セット（Inventoried）
。
このアッセイミックスは、1 本の調製済み 20✕ チューブに入っています。
• Pre-Developed TaqMan® Assay Reagents for Allelic Discrimination（TaqMan®
PDARs for AD）－ 設計済み FAM 色素および VIC 色素ラベル化 TaqMan MGB プ
ローブとプライマーの既製品セット（Inventoried）。このアッセイミックスは、1
本の調製済み 10✕ チューブに入っています。
参考： StepOne ソフトウェアで SNP アッセイを選択するには、
［Design Wizard］
（設計
ウィザード）の［SNP Assays］（SNP アッセイ）画面または［Advanced Setup］
（高度
なセットアップ）の［Plate Setup］（プレートのセットアップ）画面を開きます。［SNP
Assays］（SNP アッセイ）画面または［Plate Setup］（プレートのセットアップ）画面
で、ライブラリからアッセイを選択するか、または新たにアッセイを作成します。
カスタムアッセイ
ジェノタイピング実験では、カスタムアッセイタイプには、Custom TaqMan® SNP
Genotyping Assays が含まれます。Custom TaqMan SNP Genotyping Assays は、FAM
色素および VIC 色素ラベル化 TaqMan MGB プローブとプライマーのセットで、提示の
あった配列情報に基づいて Custom TaqMan® Genomic Assays サービスが設計、合成、
調製したものです。このアッセイミックスは、1 本の調製済み 40✕ または 80✕ チューブ
に入っています。
参考： StepOne ソフトウェアで SNP アッセイを選択するには、
［Design Wizard］
（設計
ウィザード）の［SNP Assays］（SNP アッセイ）画面または［Advanced Setup］
（高度
なセットアップ）の［Plate Setup］（プレートのセットアップ）画面を開きます。［SNP
Assays］（SNP アッセイ）画面または［Plate Setup］（プレートのセットアップ）画面
で、ライブラリからアッセイを選択するか、または新たにアッセイを作成します。
ユーザー設計アッセイ
『Primer Express®
SNP アッセイ用プライマーとプローブを独自に設計したい場合には、
Software Version 3.0 Getting Started Guide』をご参照ください。
重要！ Applied Biosystems は、TAMRA™ 色素をレポーターやクエンチャーとして
StepOne システムで使うことはお勧めしません。TAMRA 色素は、StepOnePlus システ
ムでレポーターやクエンチャーとして使えます。
1-10
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
試薬の概要
2
本章の内容：
概要 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-2
TaqMan® 試薬 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-2
SYBR® Green 試薬 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-4
適切な試薬タイプの選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-6
DNA 汚染の最小限化 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2-7
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
2-1
第 2 章 試薬の概要
概要
Applied Biosystems では、Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ RealTime PCR Systems で PCR 生成物を検出するために、2 種類の試薬（ケミストリ）を開
発しました。
• TaqMan® 試薬（下記）
• SYBR® Green 試薬（2-4 ページ）
TaqMan® 試薬
実験タイプ
TaqMan® 試薬には、Applied Biosystems TaqMan® アッセイ（プローブとプライマーの
セットを含む調製済みミックス）および Applied Biosystems TaqMan® マスターミック
スがあります。アッセイは、目的とするターゲットに特異的です。マスターミックスに
は、PCR 反応を行うために必要なその他のコンポーネントが含まれています。TaqMan
試薬を用いて次のタイプの実験が実施できます。
• 次の方法による定量実験：
– 標準曲線法
– 相対標準曲線法
– 比較 CT（∆∆CT）
• ジェノタイピング実験
• 有無実験
重要！ Applied Biosystems は、TAMRA™ 色素をレポーターやクエンチャーとして
StepOne システムで使うことはお勧めしません。TAMRA 色素は、StepOnePlus システ
ムでレポーターやクエンチャーとして使えます。
TaqMan 試薬の
開発
当初、リアルタイム PCR 生成物を測定する際には、インターカレータ色素が用いられて
いました。この検出方法の大きな弱点は、蓄積される PCR 生成物は特異的なものも非特
異的なものも、両方検出してしまうことでした。
そこで、Taq DNA ポリメラーゼの 5′ ヌクレアーゼ活性を用いた蛍光ラベルプローブを
導入することによって、PCR 用リアルタイムシステムの改良を行いました。このような
蛍光プローブが利用可能となったことにより、特異的な増幅生成物のみを検出するリア
ルタイム検出法が開発されたのです。
TaqMan 試薬の
仕組み
TaqMan 試薬は、蛍光プローブを使って、PCR 中に蓄積する特定の PCR 生成物を検出
します。その仕組みは、以下のとおりです。
ステップ 1 － オリゴヌクレオチドの 5′ 末端に蛍光レポーター色素を、3′ 末端にはクエ
ンチャーを結合させて、オリゴヌクレオチドプローブを作成します。
ステップ 2 － プローブがインタクトな間は、クエンチャーは、その近傍では、蛍光共鳴
エネルギー移動（FRET、 Förster 共鳴、 Förster, V. T. 1948）により、レポーター色素
から放射される蛍光を吸収します。
2-2
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
第 2 章 試薬の概要
ステップ 3 － ターゲットが存在すると、プローブは、プライマーサイト間でアニーリン
グし、伸長反応中に Taq DNA ポリメラーゼの 5′ ヌクレアーゼ活性により遊離します。
プローブの開裂により以下のことが起こります。
• レポーター色素は、クエンチャーから遊離され、レポーター色素信号が増加します。
• ターゲット鎖からプローブが遊離され、鋳型鎖の末端までプライマー伸長が起こり
ます。このように、プローブを入れても、PCR プロセスの抑制は、全く起こりません。
ステップ 4 － 各サイクルにおいて、より多くのレポーター色素分子がそれぞれのプロー
ブから遊離するため、その蛍光強度は、生成するアンプリコン量に比例して増加します。
核酸ターゲットの開始コピー数が大きいほど、蛍光の大幅な上昇が早く観察されます。
図 2-1 に、このプロセスを図示します。
ステップ 1：レポーター（R）
と ク エ ン チ ャ ー（Q）が、
TaqMan®プローブの5′ およ
び 3′ 末端に結合していま
す。
ス テ ッ プ 2： 両 ラ ベ ル が プ
ローブに結合しているとき、
レポーター色素の蛍光がクエ
ンチされます。
図 2-1
TaqMan® プローブ
ステップ 3：各伸長ステップ
の 際 に、Taq DNA ポ リ メ
ラーゼは、レポーター色素
をプローブから遊離させま
す。
ステップ 4：クエンチャーか
ら遊離すると、レポーター
色素は、特徴的な蛍光を発
します。
TaqMan 試薬の仕組み
Applied Biosystems は、次の 2 種類の TaqMan® プローブを提供しています。
• 非蛍光クエンチャー（NFQ）を含む TaqMan® MGB（マイナーグルーブバインダー）
プローブ
• TAMRA™ 色素をクエンチャーとして含む TaqMan® プローブ
重要！ Applied Biosystems は、TAMRA 色素をレポーターやクエンチャーとして
StepOne システムで使うことはお勧めしません。TAMRA 色素は、StepOnePlus システ
ムでレポーターやクエンチャーとして使えます。
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
2-3
第 2 章 試薬の概要
Applied Biosystems では、StepOne および StepOnePlus システム用に、以下の TaqMan
プローブを提供しています。
プローブ
®
アッセイ
®
5′ ラベル色素
TaqMan Gene Expression
Assays
FAM™ 色素
TaqMan® SNP Genotyping
Assays
FAM™ および
VIC® 色素
Custom TaqMan® Gene
Expression Assays
FAM™ 色素
Custom TaqMan® SNP
Genotyping Assays
FAM™ および
VIC® 色素
Custom TaqMan®
MGB プローブ
カスタムアッセイ
FAM™、TET™、
NED™ または
VIC® 色素
Custom TaqMan®
プローブ
カスタムアッセイ
FAM™、TET™
または VIC® 色素
TaqMan MGB
プローブ
TaqMan® MGB
プローブ
3′ ラベル色素
MGB?
システム
NFQ
あり
StepOne および
StepOne Plus
システム
TAMRA™ 色素
なし
StepOnePlus
システム
TaqMan MGB プローブの推奨
Applied Biosystems では、通常の TaqMan プローブでヌクレオチド数が 30 を超える場
合には、TaqMan MGB プローブの使用をお勧めします。TaqMan MGB プローブは、以
下を含みます。
• 5′ 末端に結合した蛍光レポーター色素 － Taq DNA ポリメラーゼの 5′ ヌクレアー
ゼ活性により遊離して、信号を発生します。
• 3′ 末端に結合した非蛍光クエンチャー（NFQ）－ クエンチャーは蛍光を発生しな
いため、リアルタイム PCR システムにおいて、レポーター色素の作用を TAMRA
色素よりも正確に測定することができます。
• 3′ 末端に結合したマイナーグルーブバインダー（MGB）－ プローブの長さを増す
ことなく、融解温度（Tm）を高くできるため（Afonina et al., 1997; Kutyavin et al.,
1997）、長さが短いプローブの設計が可能となります。その結果、TaqMan MGB プ
ローブによって、一致プローブと不一致プローブで Tm 値に大きな差が生じます。
Tm 値の差が大きいほど、正確なジェノタイピングを行うことができます。
SYBR® Green 試薬
実験タイプ
SYBR® Green 試薬には、プライマーと SYBR® Green 色素を含有するマスターミック
スとが含まれています。SYBR Green 試薬を用いて、定量実験が実施できます。
• 標準曲線法
• 相対標準曲線法
• 比較 CT（∆∆CT）
参考： SYBR Green 試薬を用いてマルチプレックス PCR を実施することはできません。
詳細については、
「シングルプレックスまたはマルチプレックス PCR の選択」
（3-10 ペー
ジ）をご参照ください。
2-4
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
第 2 章 試薬の概要
SYBR Green 試薬の
開発
二本鎖 DNA に結合する低分子には、DNA にインターカレートするものと DNA マイ
ナーグローブに結合するものの 2 種類があります。ヒグチ（Higuchi et al., 1992）は、
インターカレータである臭化エチジウムを用いて、PCR のリアルタイム検出を行いまし
た。Hoechst 33258 は、二本鎖 DNA に結合すると蛍光が増加するマイナーグローブ結
合色素の一例です（Higuchi et al., 1993）
。
PCR 生成物をリアルタイムで検出するために用いる DNA 結合色素に関しては、結合方
法にかかわらず、少なくとも 2 つの要件があります。
• 二本鎖 DNA に結合すると蛍光が増加すること。
• PCR を抑制しないこと。
Applied Biosystems では、SYBR® Green I Dye を用いて、PCR を抑制せず、かつ臭化
エチジウムよりも検出感度が高くなる条件を開発しました。
SYBR Green 試薬の
仕組み
SYBR Green 試薬は、SYBR Green I Dye が PCR 中に生成する二本鎖 DNA に結合する
ことによって、PCR 生成物を検出します。その仕組みは、以下のとおりです。
ステップ 1 － SYBR Green I Dye をサンプル中に加えると、すべての二本鎖 DNA と即
座に結合します。
ステップ 2 － PCR 中、AmpliTaq Gold® DNA Polymerase は、ターゲットを増幅し、
「アンプリコン」を生成します。二本鎖 DNA が変性すると、一
PCR 生成物、すなわち、
本鎖分子となり、SYBR Green I Dye が解離します。
ステップ 3 － プライマーは一本鎖 DNA とアニーリングして、AmpliTaq Gold DNA
Polymerase はターゲットを増幅し、二本鎖 DNA を生成します。PCR が進行するにつれ
て、アンプリコンが更に生成されます。
ステップ 4 － SYBR Green I Dye は、各 PCR サイクル中に生成した新しい二本鎖 DNA
の各コピーに結合します。SYBR Green I Dye は全二本鎖 DNA に結合するため、その
結果、生成される二本鎖 PCR 生成物の量に比例して、蛍光強度が増加します。
図 2-2 に、このプロセスを図示します。
図 2-2
SYBR Green 試薬の仕組み
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
2-5
第 2 章 試薬の概要
適切な試薬タイプの選択
TaqMan および SYBR Green 試薬は、以下に掲げる実験タイプに使用できます。
実験タイプ
定量 ‡
（第 3 章）
ジェノタイピング
（第 4 章）
有無
（第 5 章）
SYBR® Green 試薬
適切
推奨しない
推奨しない
TaqMan® 試薬
適切
適切
適切
試薬タイプ
‡ 定量実験には、標準曲線法、相対標準曲線法および比較 CT 法による実験が含まれます。
重要！ Applied Biosystems は、TAMRA™ 色素をレポーターやクエンチャーとして
StepOne システムで使うことはお勧めしません。TAMRA 色素は、StepOnePlus システ
ムでレポーターやクエンチャーとして使えます。
定量実験に
際する留意事項
試薬タイプ
定量実験は、TaqMan 試薬、SYBR Green 試薬のどちらでも行うことができます。2 種
類の試薬タイプを選択するに当たっては、以下の事項に留意してください。
説明
特長
制限
TaqMan®
試薬
TaqMan 試薬は、蛍光プローブを
使って、PCR サイクル中に蓄積
する特定の PCR 生成物を検出し
ます。
• 蛍光プローブの追加による高
い配列特異性。
• マルチプレックス法に対応。
• 広範なサーマルサイクリング
条件に最適化した、調製済み
アッセイを使用可能。
• 1 ステップおよび 2 ステップ
RT-PCR 両方に利用可能。
特異的な蛍光プローブを合成す
る必要あり。
SYBR® Green
試薬
SYBR Green 試 薬 は、SYBR®
Green I Dye（二本鎖 DNA 結合色
素）を使い、PCR サイクル中に
蓄積する PCR 生成物を検出しま
す。
• 経済的（プローブ不要）。
• 融解曲線で PCR 生成物の Tm
を測定可能。
• 1 ステップおよび 2 ステップ
RT-PCR 両方に利用可能。
すべての二本鎖 DNA シーケンス
に非特異的に結合します。偽陽性
信号の発生を避けるため、融解曲
線またはゲル解析を使って、非特
異的生成物の形成を確認してく
ださい。
2-6
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
第 2 章 試薬の概要
DNA 汚染の最小限化
PCR プロセスには DNA 増幅作用があるため、TaqMan 試薬や SYBR Green 試薬を用い
て実験を行う際には、特別な配慮が必要となります。DNA 濃度が高いサンプルの場合に
は、DNA テンプレートコントロールや PCR キャリーオーバーによる汚染が発生する可
能性があります。
更に、SYBR Green I Dye は非特異的なので、二本鎖 DNA は、すべて検出されます。
SYBR Green 試薬を使用する際には、融解曲線またはゲル解析を使って、非特異的生成
物の形成を確認してください。ターゲット DNA に汚染が生じない配慮が必要です。エ
クソン－エクソン結合部に広がる遺伝子発現アッセイは、gDNA（ゲノム DNA）汚染物
による影響を最小限にします。
UNG による
キャリーオーバー
生成物再増幅の
最小限化
AmpErase® ウラシル -N- グリコシラーゼ（UNG）は、26-kDa の遺伝子組み換え酵素で
あって、Escherichia coli ウラシル -N- グリコシラーゼ遺伝子でエンコードされていま
す。この遺伝子は、E. coli ホストに挿入され、この酵素の天然型を発現します（Kwok
and Higuchi, 1989）。
UNG は、dU が含まれている一本鎖および二本鎖 DNA に作用します。UNG は、dU を
含む DNA 部位で、ウラシル－グリコシド結合を加水分解します。この酵素によりウラ
シルが遊離し、DNA 中にアルカリ感受性のある無塩基部位が生成されます。この酵素
は、RNA や dT を含む DNA には作用しません（Longo et al., 1990）。
TaqMan アッセイ
TaqMan® アッセイでは、AmpErase® UNG 処理により、前回行った PCR 反応からのキャ
リーオーバー PCR 生成物の再増幅を防止できます。PCR 増幅において dTTP の代わり
に dUTP を用いると、AmpErase UNG 処理によって、アンプリコンを 50 µL 反応液当
たり 200,000 コピーまで除去できます。
参考： AmpErase UNG（ウラシル -DNA- グリコシラーゼ、UDG とも略す）は、一部
の Applied Biosystems TaqMan マスターミックスには含まれていますが、別途購入する
ことも可能です。TaqMan マスターミックスを購入する場合には、製品情報をチェック
して、マスターミックスに AmpErase UNG が含まれるかどうかを確認してください。
SYBR Green I Dye アッセイ
SYBR Green I Dye アッセイでは、AmpErase UNG 処理により、前回行った PCR 反応
からのキャリーオーバー PCR 生成物の再増幅を防止できます。Power SYBR® Green
PCR Master Mix や SYBR® Green PCR Master Mix には AmpErase UNG が含まれま
せんが、dUTP を含むため AmpErase UNG と互換性があります。PCR キャリーオーバー
による汚染が考えられる場合には、AmpErase UNG を用いて問題の解決を行ってくださ
い。
参考： AmpErase UNG は、単品でお求めになることもできますが、SYBR® Green PCR
Core Reagents Kit にも入っています。
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
2-7
第 2 章 試薬の概要
PCR 実施上の
一般的留意事項
以下の事項に留意して、サンプル汚染や PCR 生成物のキャリーオーバーを防止してくだ
さい。
• PCR 増幅用サンプルを調製する際には、清潔な実験着と手袋（増幅 PCR 生成物を
取り扱った際やサンプル調製の際に着用していなかったもの）を着用すること。汚
染が疑われる場合には、手袋を必ず交換します。
• 以下の操作用として、専用の区域および機器類を使用すること。
– サンプル調製。
– PCR セットアップ。PCR セットアップ区域には増幅 PCR 生成物を決して持ち
込まないこと。
– PCR 増幅。
– PCR 生成物の解析。
• サンプルチューブの開閉は、細心の注意を払って行うこと。PCR サンプルの飛沫が
飛び散らないように注意すること。
• フィルター付チップを装着するポジティブディスプレイスメントピペッターやエ
アーディスプレイスメントピペッターを使用すること。チップは、使用のたびに交
換すること。
• 反応液やコンポーネントは、できるだけ蓋をすること。
• 実験台や装置は、10% 次亜塩素酸ナトリウム溶液または 70% エタノールで定期的
に拭き取ること。
2-8
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
3
定量実験
本章の内容：
セクション 3.1 定量実験について . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-3
セクション 3.2 設計ガイドライン . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-15
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
3-1
第 3 章 定量実験
3-2
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
第 3 章 定量実験
セクション 3.1
定量実験について
本セクションの内容：
概要 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-4
定量方法の選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-5
1 ステップまたは 2 ステップ RT-PCR の選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-8
シングルプレックスまたはマルチプレックス PCR の選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-10
試薬タイプの選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-12
アッセイタイプの選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-12
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
3-3
第 3 章 定量実験
概要
定量実験とは？
定量実験とは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の各増幅サイクルにおいて、ターゲット
核酸配列（ターゲット）の量を測定するリアルタイム実験です。ターゲットは、DNA、
cDNA、RNA です。
本書では、次の 3 タイプの定量実験について説明します。
• 標準曲線法（3-5 ページ）
• 相対標準曲線法（3-5 ページ）
• 比較 CT（∆∆CT）法（3-6 ページ）
定量実験の仕組み
リアルタイム定量実験では、一定のサイクル終了後までに蓄積した PCR 生成物の最終量
ではなく、サイクル中において PCR 生成物の増幅が所定の蛍光レベルに到達した時点で
反応の特徴づけが行われます。増幅プロットには、実施したサイクル数にわたって検出
された蛍光度の変化が図示されます。
PCR の初期サイクルでは、蛍光信号は、ほとんど変化しません。この一定範囲の PCR
サイクルを、ベースラインと呼びます。ソフトウェアは、まず、ノーマライズ済み蛍光
レポーター信号（ベースラインサイクルに対応する Rn 値）に数式を当てはめることに
よって、ベースライン差分増幅プロットを作成します。次に、アルゴリズムによって、
ベースライン修正したノーマライズ済み蛍光レポーター信号（delta Rn［∆Rn］値）が指
定した閾値と増幅プロットにおいてクロスする点を検出します。∆Rn 値が閾値とクロス
するサイクル数を CT と定義します。
ワークフロー
Applied Biosystems StepOne および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems で定量実
験を行う前に、以下のように実験の準備を行います。
1. 定量方法を選択します（3-5 ページ）。
2. 1 ステップまたは 2 ステップ RT-PCR を選択します（3-8 ページ）。
3. シングルプレックス PCR 反応またはマルチプレックス PCR 反応を選択します（3-10
ページ）
。
4. 試薬タイプを選択します（3-12 ページ）。
5. アッセイタイプを選択します（3-12 ページ）。
6. 選択したアッセイタイプに関する設計ガイドラインを確認します（セクション 3.2
（15 ページ））。
3-4
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
第 3 章 定量実験
定量方法の選択
標準曲線実験に
ついて
標準曲線法は、サンプルに含まれるターゲットの絶対量を特定する際に用います。標準
曲線法では、StepOne ソフトウェアにより、サンプルおよびスタンダード希釈シリーズ
中に含まれるターゲットの増幅を測定します。標準希釈シリーズのデータを使用して標
準曲線を作成します。ソフトウェアは、標準曲線を用いて、サンプル中ターゲットの絶
対量を外挿します。
コンポーネント
標準曲線実験用に PCR 反応をセットアップするには、次のコンポーネントが必要です。
• サンプル – ターゲットの量が未知のサンプル。
• スタンダード – 既知量のスタンダードを含むサンプル。定量実験で使用して標準曲
線を作成します。
• スタンダード希釈シリーズ – ある範囲の既知量のスタンダードからなるセット。ス
タンダード希釈シリーズは、スタンダードを連続的に希釈して調製されます。
• 反復 – 同一サンプル、同一コンポーネントを同一量含む同一反応の総数。
• ネガティブコントロール – サンプルテンプレートの代わりに蒸留水やバッファー
を含むウェル。ターゲットの増幅は、ネガティブコントロールウェルでは起こりま
せん。
相対標準曲線実験に
ついて
相対標準曲線法は、サンプルに含まれるターゲットの相対量を特定する際に用います。
相対標準曲線法では、StepOne ソフトウェアにより、サンプル、リファレンスサンプル、
標準希釈シリーズ中に含まれるターゲットや内在性コントロールの増幅を測定します。
測定結果は、内在性コントロールによりノーマライズされます。標準希釈シリーズのデー
タを使用して標準曲線を作成します。ソフトウェアは、標準曲線を用いて、サンプルお
よびリファレンスサンプル中のターゲット量を外挿します。ソフトウェアは、各サンプ
ル中のターゲット量とリファレンスサンプル中のターゲット量とを比較することによ
り、各サンプル中ターゲットの相対量を決定します。
相対標準曲線実験は、通常以下の目的で使用します。
• 異なる組織に含まれる遺伝子の発現レベルの比較。
• 処置サンプルと未処置サンプルにおける遺伝子の発現レベルの比較。
• 野生型アレルと突然変異したアレルの発現レベルの比較。
コンポーネント
相対標準曲線実験用に PCR 反応をセットアップする際には、次のコンポーネントが必要
です。
• サンプル – ターゲット量が未知のサンプル。
• リファレンスサンプル – 相対定量の基準として用いるサンプル。例えば、遺伝子発
現に及ぼす薬剤の作用を調べる場合には、未処置の対照サンプルをリファレンスサ
ンプルとします。「キャリブレータ」とも呼ばれます。
• スタンダード – 既知量のスタンダードを含むサンプル。定量実験で使用して標準曲
線を作成します。
• スタンダード希釈シリーズ – ある範囲の既知量のスタンダードからなるセット。ス
タンダード希釈シリーズは、スタンダードを連続的に希釈して調製されます。
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
3-5
第 3 章 定量実験
• 内在性コントロール – 実験中のすべての試験サンプルで、同様のレベルで発現する
ターゲットまたは遺伝子。内在性コントロールを用いて、定量するターゲットの蛍
光シグナルをノーマライズします。ハウスキーピング遺伝子は、内在性コントロー
ルとして使用できます。
• 反復 – 同一サンプル、同一コンポーネントを同一量含む同一反応の総数。
• ネガティブコントロール – サンプルテンプレートの代わりに蒸留水やバッファー
を含むウェル。ターゲットの増幅は、ネガティブコントロールウェルでは起こりま
せん。
比較 CT 実験に
ついて
比較 CT（∆∆CT）法は、サンプルに含まれるターゲットの相対量を特定する際に用いま
す。比較 CT 法では、StepOne ソフトウェアにより、サンプルやリファレンスサンプル
中のターゲットや内在性コントロールの増幅を測定します。測定結果は、内在性コント
ロールによりノーマライズされます。ソフトウェアは、各サンプル中のターゲット量と
リファレンスサンプル中のノーマライズ済みターゲット量とを比較することにより、各
サンプル中ターゲットの相対量を決定します。
比較 CT 実験は、通常以下の目的で使用します。
• 異なる組織に含まれる遺伝子の発現レベルの比較。
• 処置サンプルと未処置サンプルにおける遺伝子の発現レベルの比較。
• 野生型アレルと突然変異したアレルの発現レベルの比較。
コンポーネント
比較 CT 実験用に PCR 反応をセットアップする際には、次のコンポーネントが必要です。
• サンプル － ターゲット量が未知のサンプル。
• リファレンスサンプル － 相対定量の基準として用いるサンプル。例えば、遺伝子
発現に及ぼす薬剤の作用を調べる場合には、未処置の対照サンプルをリファレンス
サンプルとします。「キャリブレータ」とも呼ばれます。
• 内在性コントロール － 実験中のすべての試験サンプルで、同様のレベルで発現す
るターゲットまたは遺伝子。内在性コントロールを用いて、定量するターゲットの
蛍光シグナルをノーマライズします。ハウスキーピング遺伝子は、内在性コント
ロールとして使用できます。
• 反復 － 同一サンプル、同一コンポーネントを同一量含む同一反応の総数。
• ネガティブコントロール － サンプルテンプレートの代わりに蒸留水やバッファー
を含むウェル。ターゲットの増幅は、ネガティブコントロールウェルでは起こりま
せん。
3-6
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
第 3 章 定量実験
定量方法の比較
実験タイプ
以下の記載に基づいて、標準曲線実験、相対標準曲線実験、比較 CT 実験の選択を行っ
てください。
説明
特長
制限
標準曲線法
標準曲線を用いて、サンプル中の
ターゲットの絶対量を決定しま
す。ウイルス量の定量が代表的な
使用例です。
既知のスタンダード量に対して
比較を行います。
標準曲線実験では、各ターゲット
について標準曲線の作成が必要
となるため、反応プレートに必要
となる試薬とスペースが増えま
す。
相対標準曲線法
標準曲線を用いて、リファレンス ターゲットと内在性コントロー
サンプル中の核酸配列に対して、 ルとで PCR 増幅効率が等しい必
試験サンプル中のターゲットの 要がないため、検証が容易です。
発現がどのように変化したかを
決定します。PCR 増幅効率が低
いアッセイに最適です。
相対標準曲線実験では、各ター
ゲットについて標準曲線の作成
が必要となるため、反応プレート
に必要となる試薬とスペースが
増えます。
比較 CT（∆∆CT）
数式を用いて、リファレンスサン • ターゲットと内在性コントロー
プル中の核酸配列に対して、試験
ルの PCR 増幅効率がほぼ等し
い場合には、実験サンプル中
サンプル中のターゲットの発現
のターゲットの相対量を、標
がどのように変化したかを決定
準曲線を用いないで決定でき
します。実験サンプル数が多く、
ます。
遺伝子数も多い場合に、相対発現
頻度を測定するハイスループッ • 試薬量を節約できます。
ト測定に最適です。
• 反応プレートに空きが増えま
す。
• PCR 増幅効率が低い場合には、
結果が不正確になることがあ
ります。
• 弊社では、比較 CT 法を実施す
る前に、ターゲットアッセイ
と内在性コントロールアッセ
イとで PCR 増幅効率がほぼ等
しいことを確認されるようお
勧めします。
詳細について
定量法の詳細については、
『User Bulletin #2: Relative Quantitation of Gene Expression』
をご参照ください。
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3-7
第 3 章 定量実験
1 ステップまたは 2 ステップ RT-PCR の選択
逆転写 - ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）は、RNA の定量に用います。PT-PCR は、1
ステップおよび 2 ステップで実施できます。
1 ステップ RT-PCR
について
1 ステップ RT-PCR では、逆転写と PCR とを同一のバッファー系で行います（図 3-1）。こ
の反応では、RT ステップと PCR ステップとの間に試薬を追加する必要がありません。
1 ステップ RT-PCR では、RT と PCR 増幅のための調製を 1 本のチューブで行えるため
便利です。ただし、1 ステップ RT-PCR では、キャリーオーバー防止用酵素である
AmpErase® ウラシル -N- グリコシラーゼ（UNG）を使用できません。1 ステップ RTPCR で UNG が存在すると、cDNA は、生成する一方で分解されてしまいます。UNG
の詳細については、
「UNG による キャリーオーバー 生成物再増幅の 最小限化」
（2-7 ペー
ジ）をご参照ください。
単一
チューブ
図 3-1
2 ステップ RT-PCR
について
3-8
1 ステップ RT-PCR の概略図
2 ステップ RT-PCR では、RT と PCR とを別個の反応に分けて実施します（図 3-2）。2
ステップ RT-PCR は、1 つの cDNA 反応液から複数のトランスクリプトを検出したり、
後日使用するために cDNA の一部を貯蔵しておくのに便利です。dUTP を塩基として用
いて PCR を行う場合には、AmpErase® UNG 酵素を用いて、キャリーオーバー汚染を
防止できます。UNG の詳細については、
「UNG による キャリーオーバー 生成物再増幅
の 最小限化」（2-7 ページ）をご参照ください。
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
第 3 章 定量実験
チューブ 1
オリゴ d(T) またはランダムヘキサマー
チューブ 2
図 3-2
cDNA 合成に
用いるプライマー
PCR ステップ
2 ステップ RT-PCR の概略図
1 ステップ RT-PCR では、配列特異的リバースプライマーを cDNA 合成に利用できます。
2 ステップ RT-PCR では、以下のプライマーを cDNA 合成に利用できます。
• オリゴ d(T)16
• ランダムプライマー
• 配列特異的リバースプライマー
最適な逆転写用プライマーは、これらの 3 種類のプライミングシステムを実験により評
価して選ぶことができます。ヘアピンループが存在しない短い RNA 配列の場合には、こ
れらの 3 種類のプライミングシステムは、すべて等しい効果を示します。長い RNA ト
ランスクリプトやヘアピンループを含む配列の場合には、以下のガイドラインに従って
ください。
プライマー
RT-PCR 法の比較
選択ガイドライン
オリゴ d(T)16
• 真核生物の mRNA や poly-A テールを有するレトロウイルスの逆転
写のみに用いる。
• 長い mRNA トラスクリプトや poly-A 部位から上流 2 キロベース
を超えるアンプリコンは避ける。
ランダムプライマー
• 先ず、長い逆転写物やヘアピンループを含む逆転写物で試してみ
る。
• 全 RNA（rRNA、mRNA、tRNA）の転写に用いる。
配列特異的リバース
プライマー
• RNA を含む相補的配列の逆転写のみに用いる。
• 1 ステップ RT-PCR で用いる。
方法
cDNA 合成に用いるプライマー
1 ステップ
RT-PCR
配列特異的リバースプライマー
2 ステップ
RT-PCR
ランダムヘキサマー
コメント
単一の反応ミックスでよい。
AmpErase® UNG は使用不可。
オリゴ d(T)16
配列特異的リバースプライマー
cDNA を貯蔵して、後で利用可能。
AmpErase® UNG を使用可能。
2 つの反応ミックスが必要。
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
3-9
第 3 章 定量実験
シングルプレックスまたはマルチプレックス PCR の選択
PCR 反応は、次のいずれかで実施できます。
• シングルプレックス PCR – シングルプレックス PCR では、反応チューブまたは
ウェルにはプライマーセットが 1 つだけ存在します。反応ごとにターゲットまたは
内在性コントロールを 1 つだけ増幅できます。
または
• マルチプレックス PCR – マルチプレックス PCR では、反応チューブまたはウェル
にプライマーセットが複数存在します。各セットが、特定のターゲットまたは内在
性コントロールを増幅します。通常は、FAM™ 色素でラベルしたプローブは、ター
ゲットを検出し、VIC® 色素でラベルしたプローブは、内在性コントロールを検出
します。
重要！ SYBR® Green 試薬は、マルチプレックス PCR には使用できません。
重要！ Applied Biosystems は、
TAMRA™ 色素をレポーターやクエンチャーとして
StepOne システムで使うことはお勧めしません。TAMRA 色素は、StepOnePlus シ
ステムでレポーターやクエンチャーとして使えます。
図 3-3
マルチプレックス
PCR について
シングルプレックス PCR 対マルチプレックス PCR
マルチプレックス PCR を実施する際には、次の点にご注意ください。
• すべての条件下において、選択した内在性コントロールが定量しようとしている全
てのターゲットと比較して量が多い（CT 値が低い）ことを確認します。
• 内在性コントロールアッセイをプライマー制限アッセイとして測定します。各反応
中の内在性コントロールアッセイ（量が多いテンプレート）については、プライ
マー量を制限して、競合的 PCR によって量が少ないテンプレートの CT に影響が出
ないようにしなければなりません。
マルチプレックス PCR におけるプライマーの制限
正確なマルチプレックスアッセイを行うためには、ある種類の増幅が他の種類の増幅を
大きく超えないことが重要になります。そうでないと、量の多い種類の増幅によって、
量の少ない種類の増幅がうまく起こらなくなります。
量の少ない種類がうまく増幅しない場合、実験結果が不正確になったり、最悪の場合に
は量の少ない種類がまったく検出されないことも起こります。このような状況を防ぐに
は、量の多い種類を増幅するプライマー濃度を制限して、CT に到達後に増幅を停止する
ことが必要となります。しかし、プライマー制限アッセイは、ノーマライズを行ってい
るプライマー非制限アッセイとくらべて、反応条件が不安定になる恐れがあります。詳
細については、付録 B「マルチプレックス PCR におけるプライマーの制限」をご参照く
ださい。
3-10
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
第 3 章 定量実験
シングルプレックス
対マルチプレックス
PCR
定量するターゲット数が増加するにつれて、マルチプレックス PCR におけるプライマー
制限の複雑さが増します。複数のターゲットを解析する際、次のような理由からシング
ルプレックス PCR を用いる方が効果的な場合もあります。
• マルチプレックス PCR では、次の条件を満たす適切な内在性コントロールを見つ
けるのが困難です。
– 定量しようとしているどのターゲットよりも量が多い。
– 実験条件やサンプルの違いによって、発現レベルが変化しない。
最初にマルチプレックスおよびシングルプレックスフォーマットでターゲット
アッセイと内在性コントロールアッセイをすべて測定した後、両フォーマットによ
る CT 値の比較を行って、マルチプレックスが CT 値に影響を及ぼしていないかを
調べます。
• シングルプレックス PCR では、実験条件やサンプルの違いによって発現レベルが
変化しないターゲットを、内在性コントロールとして用いることができます。それ
ゆえ、シングルプレックスフォーマットでターゲット数が多いほど、残りのター
ゲットを比ノーマライズするための適切な内在性コントロールが 1 つ以上見つかる
確率が高くなります。
マルチプレックス PCR とシングルプレックス PCR の選択に当たっては、以下の事項に
留意してください。
PCR
説明
特長
制限
シングル
プレックス
反応チューブまたはウェ
ル 内 で、一 種 類 の タ ー
ゲットまたは内在性コン
トロールの増幅が起こる
反応。
• TaqMan® アッセイに最適化は不要。
• 実験条件やサンプルの違いによって
発現レベルが変化しないターゲット
を内在性コントロールとして利用可
能。
• TaqMan® 試薬と SYBR® Green 試薬
のどちらも選択できる柔軟性。
• ターゲットと内在性コントロールと
の両方にサンプルが必要。
マルチ
プレックス
反応チューブまたはウェ
ル内で、複数のターゲッ
トまたは内在性コント
ロールの増幅が起こる反
応。
• 稼働コストおよび 2 本のチューブに
サンプルを分ける際の正確な分注操
作に対する依存度を低減。
• 内在性コントロールアッセイをプラ
イマー制限アッセイとして測定する
必要あり。
• 最適化と検証の必要あり。
• 複数のターゲットを解析する場合に
は、シングルプレックス PCR よりも
効率が悪い。
• SYBR®Green 試薬の使用は不可。
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
3-11
第 3 章 定量実験
試薬タイプの選択
TaqMan 試薬
対 SYBR Green 試薬
StepOne および StepOnePlus システムでは、以下の試薬を用いて定量実験を実施できま
す。
• TaqMan® 試薬
• SYBR® Green 試薬
TaqMan 試薬と SYBR Green 試薬の選択については、「定量実験に 際する留意事項」（2-6
ページ）をご参照ください。
アッセイタイプの選択
StepOne ソフトウェアで実験を設計する場合には、定量実験として、以下のアッセイタ
イプを選択できます。
• Inventoried/Made to Order（在庫／注文生産）（3-13 ページ）
• カスタム（3-14 ページ）
本セクションでは、各アッセイタイプに利用可能な製品をリストします。
参考： アッセイは、目的とするターゲットに特異的です。マスターミックスには、PCR
反応を行うために必要なその他のコンポーネントが含まれています。
3-12
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
第 3 章 定量実験
Inventoried/Made
to Order
（在庫／注文生産）
アッセイ
製品
属性
TaqMan® Gene
Expression Assays
• ヒト、マウス、ラット、Arabidopsis、Drosophila、C. elegans、
C. familiares（イヌ）および M. mulatta（アカゲザル）遺伝子
用の調製済み遺伝子特異的プライマーとプローブのセット
• プローブは、FAM™ 色素ラベル MGB プローブ
• 便利な単一の 20✕ チューブで提供
• Inventoried（在庫）または Made to Order（注文生産）アッセ
イとして入手可能
TaqMan® Endogenous
Control Assays
• 最適化、調製済み、そのまま使用可能な内在性コントロール
アッセイ
• ヒト、マウス、ラット、Arabidopsis、Drosophila およびあら
ゆる真核生物種用のコスト効果が高い遺伝子発現定量
• FAM™ 色素と VIC® 色素ラベルの選択が可能（プライマー制限）
参考：FAM™ 色素ラベル化
TaqMan® Endogenous
Control Assays は、
Inventoried TaqMan Gene
Expression Assays として
含まれています。
Custom TaqMan® Gene
Expression Assays
TaqMan® Gene
Expression Master Mix
•
•
•
•
あらゆる種または生物
自由にターゲットを選択
プローブは、FAM™ 色素ラベル MGB プローブ
便利な単一の 20✕ チューブで提供
リアルタイム PCR により、通常の実験や特殊な実験で正確な定
量を行う場合に使用
• ターゲットの 1 コピーまで検出する優れた検出精度
• 1 回の反応中に含まれる 2 つのターゲットを一緒に増幅するマ
ルチプレックス PCR
• 同じ遺伝子ファミリーに属する遺伝子の区別が可能な高い特
異性
• TaqMan® Gene Expression Assays により検証済み
• 全アッセイに同一試薬を用いることで、アッセイの実施を簡素
化
TaqMan® 2✕ Universal
PCR Master Mix （with
または without AmpErase®
UNG）
• cDNA または DNA をテンプレートに用いる TaqMan® アッセイ
で最適性能を発揮
• 優れたアッセイ能を保証するコンポーネントを含む
• 全アッセイに同一試薬を用いることで、アッセイの実施プロセ
スを簡素化
TaqMan® Fast Universal
PCR Master Mix (2✕),
No AmpErase® UNG
• 上記の TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix と同じ属性
• StepOne™ および StepOnePlus™ システムで約 35 分で定量実
験が終了
重要！ Applied Biosystems は、TAMRA™ 色素をレポーターやクエンチャーとして
StepOne システムで使うことはお勧めしません。TAMRA 色素は、StepOnePlus システ
ムでレポーターやクエンチャーとして使えます。
Inventoried/Made to Order（在庫／注文生産）アッセイを用いて実験を設計する際のガ
イドラインについては、（3-16 ページ）をご参照ください。
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
3-13
第 3 章 定量実験
カスタムアッセイ
製品
属性
カスタム TaqMan® プローブ
とプライマー
• あらゆる種または生物
• 色素ラベル、クエンチャーおよび合成スケールを自由に選択
• Applied Biosystems のアッセイ設計ガイドラインに従い、
Primer Express® Software で使用
Primer Express® Software
リアルタイム PCR 用のプライマーとプローブを設計するソフト
ウェア
TaqMan® Gene Expression
Master Mix
リアルタイム PCR により、通常の実験や特殊な実験で正確な定
量を行う場合に使用
• ターゲットの 1 コピーまで検出する優れた検出精度
• 1 回の反応中に含まれる 2 つのターゲットを一緒に増幅するマ
ルチプレックス PCR
• 同じ遺伝子ファミリーに属する遺伝子の区別が可能な高い特
異性
• Custom TaqMan® Gene Expression Assays により検証済み
• 全アッセイに同一試薬を用いることで、アッセイの実施を簡素
化
TaqMan® 2✕ Universal
PCR Master Mix （with
または without AmpErase®
UNG）
• cDNA または DNA をテンプレートに用いる TaqMan® アッセイ
で最適性能を発揮
• 優れたアッセイ能を保証するコンポーネントを含む
• 全アッセイに同一試薬を用いることで、アッセイの実施プロセ
スを簡素化
TaqMan® Fast Universal
PCR Master Mix (2✕), No
AmpErase® UNG
• 上記の TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix と同じ属性
• StepOne™ および StepOnePlus™ システムで約 35 分で定量実
験が終了
Power SYBR® Green PCR
Master Mix
• 高感度定量法により、低コピー数の検出が可能（2 コピーの
ターゲット遺伝子も検出）
• 二本鎖 DNA を検出、特異的プローブは不要
• 高精製 AmpliTaq Gold® DNA Polymerase LD を含有し、非特
異的生成物（プライマーダイマーを含む）の形成を最小限化
• Applied Biosystems のアッセイ設計ガイドラインに従い、Primer
Express® Software で使用
SYBR® Green PCR Master
Mix
• 二本鎖 DNA を検出、特異的プローブは不要
• 高感度な検出が不要の場合には標準的に使用
• AmpliTaq Gold® DNA Polymerase を含有し、非特異的生成物
（プライマーダイマーを含む）の形成を最小限化
• Applied Biosystems のアッセイ設計ガイドラインに従い、Primer
Express® Software で使用
重要！ Applied Biosystems は、TAMRA™ 色素をレポーターやクエンチャーとして
StepOne システムで使うことはお勧めしません。TAMRA 色素は、StepOnePlus システ
ムでレポーターやクエンチャーとして使えます。
カスタムアッセイを用いて実験を設計する際のガイドラインについては、
（3-21 ページ）
をご参照ください。
3-14
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
第 3 章 定量実験
セクション 3.2
設計ガイドライン
本セクションの内容：
Inventoried/Made to Order（在庫／注文生産）アッセイ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-16
TaqMan® Gene Expression Assays. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-16
Custom TaqMan® Gene Expression Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-18
マスターミックスの選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-19
実験の設計 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-20
カスタムアッセイ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3-21
Primer Express® Software を使ったプライマーとプローブの設計 . . . . . . . . . .
試薬の選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
推奨サーマルサイクリング条件の使用 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
プライマー濃度の最適化 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
プローブ濃度の最適化 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
詳細について . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
3-21
3-24
3-27
3-30
3-33
3-35
3-15
第 3 章 定量実験
Inventoried/Made to Order（在庫／注文生産）アッセイ
ワークフロー
StepOne™ ソフトウェアで Inventoried/Made to Order アッセイタイプを選択する場合、
Applied Biosystems は、以下のワークフローをお勧めします。
1. アッセイを選択します。
• TaqMan® Gene Expression Assays（下記）
• Custom TaqMan® Gene Expression Assays（3-18 ページ）
2. マスターミックスを選択します（3-19 ページ）。
3. StepOne ソフトウェアを用いて実験を設計します（3-20 ページ）。
TaqMan® Gene Expression Assays
製品の説明
TaqMan® Gene Expression Assays は、ヒト、マウス、ラット、Arabidopsis、Drosophila、
C. elegans、C. familiares（イヌ）および M. mulatta（アカゲザル）遺伝子の定量実験を
行うために開発された、Inventoried/Made to Order のプローブとプライマーのセットを
包括的に含むアッセイです。
このアッセイには、次の特徴があります。
• TaqMan® 試薬を用いて cDNA サンプル中のターゲットを増幅し、検出します。
• 自 動 化 デ ザ イ ン と 品 質 管 理 さ れ た パ イ プ ラ イ ン に よ り 設 計 さ れ て い ま す。
Inventoried アッセイは、製造後在庫管理されており、Made to Order アッセイは、
設計済みで注文があった後に製造されます。
• Applied Biosystems TaqMan® マスターミックスを用いて、広範なサーマルサイク
リング条件により、最適な性能を発揮するように設計されています。
• 可能な場合には、エクソン－エクソン結合部とクロスするプローブを設計すること
により、ゲノム DNA を増幅することなくターゲット cDNA の増幅が行えます（アッ
セイ ID に m サフィックスが表示される）。
製品の必要条件
TaqMan Gene Expression Assays に必要なものは、以下のとおりです。
• 次の 3 コンポーネント：
– ウェル当たりの cDNA サンプル（RNA から変換）量は 1 ～ 100 ng で、各測定
ウェル中の cDNA 量は同じ。
– 20✕ Gene Expression Assay Mix（各ターゲットに特異的）。各アッセイミック
スは、調製済み 20✕ ミックス中に、2 つの非ラベル PCR プライマーと FAM™ 色
素ラベル TaqMan® MGB（マイナーグルーブバインダー）プローブを含みます。
1✕ の最終濃度は、プローブが 250 nM、各プライマーは 900 nM です。
– TaqMan® Gene Expression Master Mix、TaqMan® Universal PCR Master Mix
（with または without AmpErase® UNG）
、または TaqMan® Fast Universal PCR
Master Mix、No AmpErase® UNG。
• 各 PCR サイクル中に必要となる PCR 増幅ステップは 1 回のみです。同時にリアル
タイム読み取りを行うことにより結果を出します。
3-16
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
第 3 章 定量実験
利用可能なアッセイ
TaqMan Gene Expression Assays は、ヒト、マウス、ラット、Arabidopsis、Drosophila、
C. elegans、C. familiares（イヌ）および M. mulatta（アカゲザル）遺伝子用に利用でき
ます。部品番号は、
• Inventoried アッセイは PN 4331182
• Made to Order アッセイは PN 4351372
アッセイ名のプレフィックスは、アッセイ対象種を表しています。Hs は Homo sapiens
（ヒト）、Mm は Mus musculus（マウス）、Rn は Rattus norvegicus（ラット）、At は
Arabidopsis thaliana、Dm は Drosophila melanogaster、Ce は C. elegans、Cf は
C. familiares（イヌ）、Rh は M. mulatta（アカゲザル）です。
アッセイ名のサフィックスは、以下の表に示すようなアッセイの特徴を示します。
サフィックス
説明
_m
このアッセイのプローブはエクソン結合部に広がるため、ゲノム DNA を検出
しません。
_s
このアッセイのプライマーおよびプローブは単一エクソン内で作用するよう設
計されており、ゲノム DNA を検出します。
_g
このアッセイのプライマーおよびプローブは単一エクソン内で作用する可能性
があり、ゲノム DNA を検出する可能性があります。
_mH
このアッセイは、配列相同性が高い遺伝子ファミリーに属するトランスクリプ
ト用に設計されています。このアッセイでは、ターゲット遺伝子と最も類似し
た配列相同性を有する遺伝子との間で、10 CT から 15 CT の差が出ます。その
ため、サンプル中にターゲットトランスクリプトと最も相同性が高いトランス
クリプトに同数のコピーがあった場合、最も相同性が高いトランスクリプトの
1000 から 30,000 倍の感度でターゲットトランスクリプトを検出できます。
_sH
_gH
_u
このアッセイのアンプリコンはエクソン結合部に広がり、プロ－ブはそのうち
の一つのエクソン内に完全に配置されます。
TaqMan® Endogenous Control Assays
TaqMan® Endogenous Control Assays は、以下により入手可能です。
• Inventoried TaqMan Gene Expression Assays（PN 4331182）－ 各アッセイは、1
本の調製済み 20✕ チューブ中に、FAM™ 色素ラベル TaqMan® MGB プローブを含
みます。
• ヒト、マウスおよびラット種用個別コントロールアッセイ（部品番号は多岐）－ 各
アッセイは、FAM™ 色素ラベル TaqMan® MGB プローブ、VIC® 色素ラベル
TaqMan® MGB プローブまたは TAMRA™ 色素ラベルプローブを含みます。VIC 色
素ラベルを含む TaqMan Endogenous Controls では、プライマーが制限されます。
重要！ Applied Biosystems は、TAMRA™ 色素をレポーターやクエンチャーとして
StepOne システムで使うことはお勧めしません。TAMRA 色素は、StepOnePlus システ
ムでレポーターやクエンチャーとして使えます。
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
3-17
第 3 章 定量実験
詳細について
• 最新の製品および各製品の使用方法については、Applied Biosystems ウェブサイト
をご覧ください。
http://www.appliedbiosystems.com/
a. ホームページの［TaqMan® Products］
（TaqMan® 製品）から、
「TaqMan® Gene
Expression Assays」を選択します。
b. ［Gene Expression Assays & Arrays］のページで、
（個別のアッセイ）にて「TaqMan® Gene Expression
• ［Individual Assays］
Assays」を選択します。このオプションを選択すると、FAM 色素ラベル
化プローブを含む TaqMan Endogenous Control Assays を初めとする、全
TaqMan Gene Expression Assays へリンクされます。
または
（個別のコントロールアッセイ）にて「TaqMan®
• ［Individual Control Assays］
Endogenous Control Assays」を選択します。このオプションを選択す
ると、個別の TaqMan Endogenous Control Assays（FAM 色素ラベル化
TaqMan MGB プローブ、VIC 色素ラベル化 TaqMan MGB プローブ、ま
たは TAMRA 色素ラベル化プローブを含む）へリンクされます。
『Using TaqMan®
• Custom TaqMan Endogenous Control Assays についての情報は、
Endogenous Control Assays to Select an Endogenous Control for Experimental
Studies Application Note』をご参照ください。
• TaqMan Gene Expression Assays を使って PCR 反応を調製する方法については、
『TaqMan® Gene Expression Assays Protocol』をご参照ください。
Custom TaqMan® Gene Expression Assays
製品の説明
Custom TaqMan® Gene Expression Assays は、TaqMan プローブとプライマーのセット
で、お客様から提示のあった配列情報に基づいて Custom TaqMan® Genomic Assays
サービスが設計、合成、調製したものです。Custom TaqMan Gene Expression Assays
を使うと、どのような生物の遺伝子やスプライシング変異でも定量実験を実施できます。
このアッセイには、次の特徴があります。
• TaqMan® 試薬を用いて cDNA サンプル中のターゲットを増幅し、検出します。
• 独自のアッセイ設計ソフトウェアを用いて開発されています。
• Applied Biosystems TaqMan® マスターミックスを用いて、広範なサーマルサイク
リング条件により、最適な性能を発揮するように設計されています。
製品の必要条件
Custom TaqMan Gene Expression Assays には、以下が必要です。
• ターゲット配列に関する提出用ファイル。無償の File Builder ソフトウェアを使用
して提出用ファイルを作成し、Custom TaqMan® Genomic Assays サービスに当該
ファイルを提示してください。
• 次の 3 コンポーネント：
– ウェル当たりの cDNA サンプル（RNA から変換）量は 1 ～ 100 ng で、各測定
ウェル中の cDNA 量は同じ。
3-18
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
第 3 章 定量実験
– 20✕ Gene Expression Assay または 60✕ Gene Expression Assay（各ターゲット
に特異的）。各アッセイは、調製済み 20✕ または 60✕ ミックス中に、2 種類の
ターゲット特異的プライマーと FAM™ 色素ラベル TaqMan MGB プローブを含
みます。1✕ の最終濃度は、プローブが 250 nM、各プライマーは 900 nM です。
– TaqMan® Gene Expression Master Mix、TaqMan® Universal PCR Master Mix
（with または without AmpErase® UNG）
、または TaqMan® Fast Universal PCR
Master Mix、No AmpErase® UNG。
• 各 PCR サイクル中に必要となる PCR 増幅ステップは 1 回のみです。同時にリアル
タイム読み取りを行うことにより結果を出します。
詳細について
• 最新の製品および各製品の使用方法については、Applied Biosystems ウェブサイト
をご覧ください：
http://www.appliedbiosystems.com/
a. ホームページの［TaqMan® Products］
（TaqMan® 製品）から、
「TaqMan® Gene
Expression Assays」を選択します。
b. ［Gene Expression Assays & Arrays］ページの［Individual Assays］（個別の
アッセイ）で［TaqMan® Gene Expression Assays］を選択します。
『Custom TaqMan®
• Custom TaqMan Gene Expression Assays の注文方法については、
Genomic Assays Protocol: Submission Guidelines』をご参照ください。
• Custom TaqMan Gene Expression Assays を使って PCR 反応を調製する方法につ
いては、
『Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol』をご参照ください。
マスターミックスの選択
利用可能な
マスターミックス
Applied Biosystems の 定 量 実 験 用 Inventoried/Made to Order ア ッ セ イ は、以 下 の
TaqMan® マスターミックスを用いるように設計されています。
マスターミックス
部品番号
TaqMan® Gene Expression Master Mix、1-Pack（1 × 5 mL)、200 反応
4369016
TaqMan® Gene Expression Master Mix、10-Pack（10 × 5 mL）、
2000 反応
4369542
TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕)、No AmpErase® UNG、
250 反応
4352042
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、200 反応
4304437
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、2000 反応
4326708
10-Pack、TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix
4305719
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、No AmpErase® UNG、
200 反応
4324018
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、No AmpErase® UNG、
2000 反応
4326614
10-Pack、TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、
No AmpErase® UNG
4324020
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
3-19
第 3 章 定量実験
詳細について
TaqMan 試薬の使用に関しては、以下をご参照ください。
• TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕) Protocol
• TaqMan® Gene Expression Master Mix Protocol
• TaqMan® Universal PCR Master Mix Protocol
実験の設計
StepOne ソフト
ウェアの使用
Applied Biosystems の Inventoried/Made to Order アッセイでは、StepOne ソフトウェ
アを用いて定量実験の設計を行います。StepOne ソフトウェアは、自動的に以下の量を
計算します。
• 反応ミックスコンポーネント
• サンプル希釈液
• （標準曲線および相対標準曲線実験の場合のみ）スタンダード希釈シリーズ
参考： StepOne ソフトウェアで Inventoried/Made to Order アッセイタイプを選択するに
は、
［Design Wizard］
（設計ウィザード）または［Advanced Setup］
（高度なセットアッ
プ）で［Reaction Setup］
（反応セットアップ）画面を開き、
［Assay Type］
（アッセイタ
（在庫／注文生産）
イプ）ドロップダウンメニューから［Inventoried/Made to Order］
を選択します。
詳細について
StepOne および StepOnePlus システムによる定量実験の設計および実施については、以
下をご参照ください。
• Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems
標準曲線実験入門ガイド
• Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems
相対標準曲線と比較 CT 実験入門ガイド
3-20
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
第 3 章 定量実験
カスタムアッセイ
ワークフロー
StepOne™ ソフトウェアで定量実験にカスタムアッセイを選択する場合には（すなわち、
独自にプライマーとプローブを設計する場合には）、Applied Biosystems のアッセイ設
計ガイドラインのワークフローに従うことをお勧めします。
1. Primer Express® Software を使って、プライマーとプローブを設計します（下記）。
2. 適切な試薬を選択します（3-24 ページ）。
重要！ Applied Biosystems は、
TAMRA™ 色素をレポーターやクエンチャーとして
StepOne システムで使うことはお勧めしません。TAMRA 色素は、StepOnePlus シ
ステムでレポーターやクエンチャーとして使えます。
3. 推奨されたサーマルサイクリング条件を用います（3-27 ページ）。
4. デフォルト設定のプライマーおよびプローブ濃度で開始します。必要に応じて、プ
ライマー濃度（3-30 ページ）およびプローブ濃度（3-33 ページ）を最適化します。
重要！ これらの手順に完全に従うと、本システムで迅速にアッセイを設計、最適化でき、
信頼性の高い結果が得られます。実験が高いレベルで成功するために、本システムを包
括的にご利用ください。Applied Biosystems のアッセイ設計ガイドラインの詳細につい
ては、付録 C をご覧ください。
（カスタム）アッセイタイプを選択するには、
参考： StepOne ソフトウェアで［Custom］
（設計ウィザード）または［Advanced Setup］
（高度なセットアップ）
［Design Wizard］
から［Reaction Setup］
（反応セットアップ）画面を開き、
［Assay Type］
（アッセイタイ
プ）ドロップダウンメニューで［Custom］
（カスタム）を選択します。
Primer Express® Software を使ったプライマーとプローブの設計
Primer Express® Software は、お客様が提示した DNA 配列に基づき、推奨パラメータ
を用いてプライマーとプローブを選択します。
ご自分でアッセイの設計を行う場合には、（3-23 ページ）にある定量実験用プライマー
およびプローブの設計ガイドラインの要約に従ってください。これらのガイドラインの
詳細な解説については、
「プライマーおよび プローブ設計ガイドラインについて」
（3-22
ページ）をご覧ください。
重要！ Applied Biosystems は、TAMRA™ 色素をレポーターやクエンチャーとして
StepOne システムで使うことはお勧めしません。TAMRA 色素は、StepOnePlus システ
ムでレポーターやクエンチャーとして使えます。
参考： SYBR® Green I Dye による検出を行う場合にはプローブは必要ありませんが、
SYBR® Green 試薬用アッセイを設計する際に、Primer Express Software によってプラ
イマーとプローブのセットを選択することをお勧めします。プローブは使用しませんが、
プライマーは必要とされる要件をすべて満たします。高い特異性を得るためにアッセイ
を TaqMan 試薬に変更する必要が生じた場合、作成した Primer Express Software ドキュ
メントを開いて、すぐにプローブを見つけることができます。
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
3-21
第 3 章 定量実験
定量アッセイ用
アンプリコン部位の
選択
アンプリコン部位を適切に選択することで、ゲノム配列、偽遺伝子やその他の関連遺伝
子の共増幅を起こすことなく、ターゲット mRNA ／ cDNA の増幅を行えます。SYBR
Green 試薬は、遺伝子発現用アンプリコン部位をスクリーニングするのに有用です。
ガイドライン
• アンプリコンは、ゲノム DNA 中のターゲット遺伝子の増幅を防止するために、1
つ以上のイントロンに及ぶスパンが必要です。
• プライマーペアは、偽遺伝子やその他の関連遺伝子の増幅を防止するために、ター
ゲット遺伝子に特異的であることが必要です。
• プライマーを設計する際には、Primer Express Software ガイドラインを用います。
• 適当な配列が見つからない場合には、配列を検討してアンプリコンの再設計を行う
か、あるいは他の部位のスクリーニングを行う必要があります。
試験中の遺伝子にイントロンが含まれない場合には、ゲノム配列を増幅することなく
mRNA 配列を増幅するアンプリコンの設計はできません。その場合には、逆転写を行っ
ていない RNA サンプルをコントロールとして測定してください（RT マイナスコント
ロール）。
プライマーおよび
プローブ設計ガイド
ラインについて
短いアンプリコンの選択
Primer Express Software パラメータのデフォルト設定で重要な点は、レンジが 50 から
150 塩基対のアンプリコンが選択されていることです。短いアンプリコンには、効率の
高い増幅ができるという利点があります。
また、効率の高いアッセイにより、比較 CT（∆∆CT）法を用いた相対定量を行うことが
。この方法では、標準曲線の必要がないため、サ
できます（Livak and Schmittgen, 2001）
ンプルスループットが高くなります。
G/C 含量
できる限り、G/C 含量が 30 から 80％の領域で、プライマーとプローブを選択してくだ
さい。G/C 含量が >80% の領域は、サーマルサイクリング中に十分な変性が起こらず、
反応効率の低下につながります。G/C 含量が高い配列は、非特異的相互作用の影響によ
り、反応効率が低下し、SYBR Green 試薬を用いたアッセイで非特異的信号が発生する
可能性があります。G 塩基が 4 個以上連続しているプライマーやプローブは避けてくだ
さい。
融解温度
推奨融解温度（Tm）を有するプライマーやプローブを選択した場合には、広範囲なサー
マルサイクリング条件を使用できます。Applied Biosystems は、プローブ Tm がプライ
マー Tm より 10°C 高いことをお勧めします。
プローブの 5′ 末端
Primer Express Software では、5′ 末端に G があるプローブは選択されません。この位
置にある G 塩基のクエンチ作用は、プローブ開裂後も残ります。G 塩基の存在により、
蛍光値（∆Rn）が低下し、アッセイ性能に影響が出ます。5′ 末端近傍（末端以外）の位
置にある G 塩基では、アッセイ性能の低下は認められていません。
3-22
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
第 3 章 定量実験
プライマーの 3′ 末端
非特異的生成物が形成される可能性を抑えるため、プライマーの 3′ 末端側の最後の 5 塩
基には、C や G 塩基が 3 個以上含まれないようにしてください。G/C 含有率が高いテン
プレートの場合など一定の条件下では、アンプリコンの長さが 150 塩基対以下という推
奨条件を緩和する必要がある場合もあります。一般論として、3′ 末端に G や C 塩基を
極端に多く含むプライマーは避けてください。
プライマーおよび
MGB プローブ設計
ガイドラインの要約
プローブガイドライン
プライマーガイドライン
プローブを最初に選び、次にプローブに重ならない範囲でできるだけプローブに近いプライ
マーを設計します（50 から 150 塩基対のアンプリコンを強くお勧めします）。
G/C 含量を 30 から 80% の範囲とします。
同一のヌクレオチド、特にグアニンが連続しないようにし、G が 4 個以上連続するのは避けて
ください。
Primer Express® Software を使用する場合に
は、Tm を 68 から 70 °C とします。
Primer Express® Software を使用する場合に
は、Tm を 58 から 60 °C とします。
G が 5′ 末端に来てはいけません。
3′ 末端側の 5 個のヌクレオチドには、G や C
塩基が 3 個以上含まれてはいけません。
ヌクレオチドが 13 個より短くならない範囲
で、TaqMan® MGB プローブをできるだけ短
くします。
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
3-23
第 3 章 定量実験
試薬の選択
定量実験用に、数種類の TaqMan および SYBR Green 試薬が利用可能です。使用する試
薬は、ターゲットに応じて変わります。
• DNA または cDNA 定量（下記）。
• 1 ステップ RT-PCR を用いる RNA 定量（3-25 ページ）。
• 2 ステップ RT-PCR を用いる RNA 定量（3-26 ページ）。
参考： SYBR Green 試薬を用いる場合には、Applied Biosystems は Power SYBR Green
色素の使用を強くお勧めします。
DNA または cDNA
の定量
試薬
TaqMan® 試薬
キット
TaqMan® Gene Expression Master Mix、
1-Pack（1 × 5 mL）、200 反応
4369016
TaqMan® Gene Expression Master Mix、
10-Pack（10 × 5 mL）、2000 反応
4369542
TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕)、
No AmpErase® UNG、250 反応
4352042
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、200 反応
4304437
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、2000 反応
4326708
10-Pack、TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix
4305719
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、
No AmpErase® UNG、200 反応
4324018
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、
No AmpErase® UNG、2000 反応
4326614
10-Pack、TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、
No AmpErase® UNG
4324020
TaqMan® PCR Core Reagents Kit、200 反応
3-24
部品番号
N808-0228
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
第 3 章 定量実験
試薬
SYBR® Green 試薬
キット
Power SYBR® Green PCR Master Mix（1 mL）、
40 反応
4368577
Power SYBR® Green PCR Master Mix（5-mL）、
200 反応
4367659
Power SYBR® Green PCR Master Mix
（10 × 5-mL）、2000 反応
1 ステップ RT-PCR
を用いる RNA 定量
試薬
TaqMan® 試薬
部品番号
4368708
Power SYBR® Green PCR Master Mix（50 mL）、
2000 反応
4367660
SYBR® Green PCR Master Mix（1-mL）、40 反応
4344463
SYBR® Green PCR Master Mix（5-mL）、200 反応
4309155
SYBR® Green PCR Master Mix（50-mL）、2000 反
応
4334973
SYBR® Green PCR Core Reagents、200 反応
4304886
キット
TaqMan® One-Step RT-PCR Master Mix
Reagents Kit
TaqMan® EZ RT-PCR Core Reagents
部品番号
4309169
N808-0236
ステップが必要な場合には、TaqMan®
参考：高温 RT
EZ RT-PCR Core Reagents を使用してください。
SYBR® Green 試薬
Power SYBR® Green RT-PCR Reagents Kit
4368711
SYBR® Green RT-PCR Reagents
4310179
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
3-25
第 3 章 定量実験
2 ステップ RT-PCR
を用いる RNA 定量
試薬
TaqMan®
試薬
ステップ
4369016
TaqMan® Gene Expression Master
Mix、10-Pack（10 × 5 mL）、
2000 反応
4369542
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master
Mix
4304437
TaqMan® Fast Universal PCR Master
Mix（2✕）、No AmpErase® UNG
4352042
High-Capacity cDNA Reverse
Transcription Kit
4374966
TaqMan® Reverse Transcription
Reagents
N808-234
RT ステップと
PCR ステップ
の両方
TaqMan® Gold RT PCR Kit
N808-232
PCR ステップ
のみ
Power SYBR® Green PCR Master Mix
4367659
SYBR® Green PCR Master Mix
4309155
High-Capacity cDNA Reverse
Transcription Kit
4374966
TaqMan® Reverse Transcription
Reagents
N808-234
Power SYBR® Green RT-PCR
Reagents Kit
4368711
SYBR® Green RT-PCR Reagents
4310179
RT ステップ
のみ
RT ステップと
PCR ステップ
の両方
AmpliTaq Gold
DNA Polymerase に
ついて
部品番号
TaqMan® Gene Expression Master
Mix, 1-Pack（1 × 5 mL）、200 反応
PCR ステップ
のみ
RT ステップ
のみ
SYBR® Green
試薬
キット
ホットスタート酵素である AmpliTaq Gold® DNA Polymerase の使用は、TaqMan およ
び SYBR Green 試薬に関する Applied Biosystems のアッセイ設計ガイドラインの重要
事項です。AmpliTaq Gold DNA Polymerase によって、確実な反応が行われ、生じる非
特異的生成物の量を大幅に低減できます。また、アッセイのセットアップが簡素化され、
室温で測定可能であることも利点に数えられます。
参考： TaqMan Fast Universal PCR Master Mix（2✕）
、No AmpErase UNG に含まれて
いる DNA ポリメラーゼは、迅速なホットスタート PCR が可能です。性能は AmpliTaq
Gold DNA Polymerase に劣りません。
MultiScribe Reverse
Transcriptase に
ついて
3-26
MultiScribe™ Reverse Transcriptase は、RNA を相補 DNA（cDNA）に逆転写する、遺
伝子組み換え Moloney マウス白血病ウイルス（MuLV）逆転写酵素です。
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
第 3 章 定量実験
推奨サーマルサイクリング条件の使用
サンプルに応じて推奨されるサーマルサイクリング条件を用います。
• DNA または cDNA 定量（3-28 ページ）。
• 1 ステップ RT-PCR を用いる RNA 定量（3-28 ページ）。
• 2 ステップ RT-PCR を用いる RNA 定量（3-29 ページ）。
参考： Fast 試薬用のサーマルサイクリング条件は、標準試薬用のサーマルサイクリング
条件と異なります。
VeriFlex™ 技術に
ついて
StepOnePlus 装置には、個別に熱制御可能な VeriFlex™ ブロックが 6 個あり、サーマル
サイクリング条件の最適化が容易です。
StepOnePlus 装置で実験を測定するときに、VeriFlex ブロックは、それぞれ異なる温度
設定をしてサンプルに応じて最高で 6 つのゾーンを作成することも、すべての VeriFlex
ブロックを同じ温度にすることも可能です。
をクリッ
VeriFlex サンプルブロックの使用に関する詳細については、ツールバーの
クするか、F1 を押して、StepOne ソフトウェアのヘルプにアクセスしてください。
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
3-27
第 3 章 定量実験
DNA または
cDNA の定量
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix（2✕)、No AmpErase UNG については、
以下の条件に従います。
時間と温度
PCR（40 サイクル）
初期ステップ
AmpErase® UNG
の活性化 ‡
活性化
ホールド
ホールド
50 °C で 2 分
95 °C で 20 秒
融解
アニール／伸長
サイクル
95 °C で 1 秒
60 °C で 20 秒
‡ AmpErase® UNG を反応に加えた場合にのみ必要。
TaqMan Gene Expression Master Mix、TaqMan 2✕ Universal PCR Master Mix
および Power SYBR Green PCR Master Mix については、以下の条件に従います。
時間と温度
初期ステップ
PCR（40 サイクル）
AmpErase® UNG
の活性化 ‡
AmpliTaq Gold®
DNA Polymerase
の活性化
ホールド
ホールド
50 °C で 2 分
95 °C で 10 分
融解
アニール／伸長
サイクル
95 °C で 15 秒
60 °C で 1 分
‡ AmpErase® UNG を反応に加えた場合またはマスターミックスに含まれている場合にのみ必要。
1 ステップ RT-PCR
を用いる RNA 定量
TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents Kit および Power SYBR Green
RT-PCR Reagents Kit については、以下の条件に従います。
時間と温度
PCR（40 サイクル）
初期ステップ
逆転写
AmpliTaq Gold®
DNA Polymerase
の活性化
ホールド
ホールド
48 °C で 30 分
95 °C で 10 分
融解
アニール／伸長
40 サイクル
95 °C で 15 秒
60 °C で 1 分
参考： この条件は、TaqMan EZ RT-PCR Kit 用ではありません。適切な条件については、
『TaqMan® EZ RT-PCR Kit Protocol』をご覧ください。
3-28
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
第 3 章 定量実験
2 ステップ RT-PCR
を用いる RNA 定量
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit については、以下の条件に従いま
す。
ステップ
時間と温度
1. RT ステップ
ステップ 1
ステップ 2
ホールド
ホールド
25 °C で 10 分
37 °C で 120 分
RNA を cDNA に逆転写した（RT ステップ）後、サンプルを貯蔵したり、続いて行う PCR ス
テップ（下記）に使うことができます。
重要！ ほとんどの使用例や大量の cDNA が必要な場合、Applied Biosystems は、最適
な変換が行われるよう 37 °C で 120 分、逆転写を行うことをお勧めします。
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix（2✕）、No AmpErase UNG については、
以下の条件に従います。
ステップ
時間と温度
PCR（40 サイクル）
初期ステップ
2. PCR ステップ
AmpErase®
UNG の活性化 ‡
AmpliTaq
Gold® DNA
Polymerase の
活性化
ホールド
ホールド
50 °C で 2 分
95 °C で 20 秒
融解
アニール／伸長
サイクル
95 °C で 1 秒
60 °C で 20 秒
‡ AmpErase® UNG を反応に加えた場合にのみ必要。
TaqMan Gene Expression Master Mix、TaqMan 2✕ Universal PCR Master Mix
（with AmpErase UNG）および Power SYBR Green PCR Master Mix について
は、以下の条件に従います。
ステップ
時間と温度
初期ステップ
2. PCR ステップ
AmpErase®
UNG の活性化
AmpliTaq
Gold® DNA
Polymerase の
活性化
ホールド
ホールド
50 °C で 2 分
95 °C で 10 分
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
PCR（40 サイクル）
融解
アニール／伸長
サイクル
95 °C で 15 秒
60 °C で 1 分
3-29
第 3 章 定量実験
プライマー濃度の最適化
フォワードプライマーおよびリバースプライマーの濃度を個別に変更することによっ
て、最適なアッセイ性能が得られる濃度を特定することができます。プライマーは、PCR
増幅の指数関数的領域では、モル数が常に大幅な余剰の状態にあります。
TaqMan Gene Expression Master Mix または TaqMan 2✕ Universal PCR Master Mix を
使用する場合には、Applied Biosystems は、プライマー濃度を下記の「プライマー濃度
の デフォルト値」に示す濃度とすることをお勧めします。次の事項に関する詳細な説明
を以下に記します。
• プライマー最適化マトリックス（下記）
• TaqMan 試薬（下記）
• SYBR Green 試薬（3-31 ページ）
プライマー濃度の
デフォルト値
下記の表に示した推奨開始プライマー濃度は、DNA および cDNA 定量アッセイ用です。
濃度（nM)
試薬
プライマー最適化
マトリックス
フォワードプライマー
リバースプライマー
TaqMan® 試薬
900
900
SYBR® Green 試薬
50
50
プライマー最適化マトリックスを行うと、最小の CT 値と最大の ∆Rn 値を生じる最小の
プライマー濃度を決定することができます。
プライマー最適化マトリックスによって、非特異的プライマー結合の補正を行います。
非特異的結合は、特定の部位に結合するプライマー量を低下させる可能性があります。
TaqMan 試薬
TaqMan 試薬を用いた定量アッセイでは、一定量のターゲットテンプレートに対して最
小の CT 値と最大の ∆Rn 値を生じるプライマー濃度を選択することによって、最適な性
能が得られます。
参考： CT 値はリアルタイム定量アッセイにおいて数値で表されるパラメータですが、
∆Rn 値も最大の感度と再現性を得る上で重要です。
TaqMan 試薬プライマー最適化マトリックスによる実験結果の具体例を図 3-4（3-31 ペー
ジ）に示します。
• 図 3-4a には、各プライマー濃度の組み合わせに対する増幅プロットを線形表示で
示しました。
• 図 3-4b には、同じデータを対数表示で示しました。
フォワードプライマーとリバースプライマーがそれぞれ50nMである組み合わせ（プロッ
トグループ C）の場合に、∆Rn が最小で、CT が最大になっています。フォワードプライ
マーまたはリバースプライマーのいずれかが 150nM の組み合わせ（プロットグループ
B）でも、∆Rn 値が低下しています。フォワードプライマーとリバースプライマーがそ
れぞれ少なくとも 300nM の組み合わせ（プロットグループ A）の場合に、∆Rn が最大
で、CT が最小になっています。結果として、プロットグループ A または B の組み合わ
せのときに、最適性能が得られます。
3-30
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
第 3 章 定量実験
a）線形表示
プロットグループ A
プロットグループ B
プロットグループ C
サイクル
b）対数表示
プロットグループ A
プロットグループ B
プロットグループ C
サイクル
図 3-4 プライマー濃度を組み合わせて行ったプライマー最適化実験による増幅結果の
プロット（線形および対数表示）
プロットグループ名：
A：フォワードプライマーおよびリバースプライマーをそれぞれ少なくとも 300nM 含む
組み合わせ
B：フォワードプライマーおよびリバースプライマーをそれぞれ少なくとも 150nM 含む
組み合わせ
C：フォワードプライマーおよびリバースプライマーをそれぞれ少なくとも 50nM 含む
組み合わせ
SYBR Green 試薬
SYBR Green 試薬を用いた定量アッセイの場合には、プライマー濃度の最適化は、若干
複雑になります。TaqMan 試薬と同じプライマー最適化マトリックスを行いますが、
SYBR Green 試薬の場合にはネガティブコントロールを加えなければなりません。選択
するプライマー濃度は、ターゲットテンプレートに対して低い CT 値と高い ∆Rn 値を示
す必要がありますが、ネガティブコントロールに対して非特異的生成物が形成してはい
けません。
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
3-31
第 3 章 定量実験
SYBR Green 試薬を用いた定量アッセイに最適なプライマー濃度を選択する場合、融解
曲線やゲル解析が極めて有用になります。図 3-5（3-32 ページ）に、900nM のフォワー
ドプライマーおよびリバースプライマーのプライマー最適化マトリックスの結果を示し
ます。
• 図 3-5a では、ネガティブコントロールウェルで強い増幅が起こっています。これ
は、非特異的増幅がかなりの程度発生していることを表します。
• 図 3-5b では、テンプレートを加えずに得られた生成物の融解温度が、テンプレー
トを加えて得られた生成物の融解温度よりも低くなっています。これは、非特異的
増幅がかなりの程度発生していることを表します。
図 3-5 に示した結果は、プライマーダイマー形成に典型的なものです。これらの結果か
ら、プライマー濃度が低いと一層最適な結果が得られることがわかります。また、目的
とするターゲットに対して別のプライマーセットを再設計することもできます。
a）増幅プロット（線形表示）
ターゲット増幅
NC（非特異的増幅）
b）融解曲線解析
NC
（非特異的増幅）
ターゲット
増幅
図 3-5 SYBR® Green 試薬を用いた増幅データ
（a）ネガティブコントロール（NC）ウェルで非特異的増幅が起こっている可能性がある
ことを示す増幅プロット（線形表示）
（b）NC ウェル中の生成物が特定の生成物とは異なる融解温度を有することを表す融解
曲線解析
3-32
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
第 3 章 定量実験
プローブ濃度の最適化
TaqMan® プローブによる検出を行う場合には、推奨プローブ濃度である 250nM で優れ
たアッセイ性能が得られます。しかし、アッセイの要件によっては、プローブ最適化実
験が有用な場合もあります。
参考： SYBR Green I Dye による検出を行う場合には、プローブは不要です。
推奨プローブ濃度
TaqMan 試薬を用いて実施する DNA および cDNA の定量アッセイに対して推奨される
プローブ濃度は 250nM です。図 3-6 に、プローブ濃度を 50nM から 250nM まで変化さ
せて行ったプローブ最適化実験の結果を示します。
• 図 3-6a では、プローブ濃度が増加するにつれて ∆Rn 値が上昇していることがわか
ります。
• 図 3-6b は、プローブ濃度が十分な場合の CT 値の変化を示します。
最大の再現性を確保するため、特にコピー数が小さいターゲットを検出しようとする場
合など、低いプローブ濃度を避けてください。アッセイは、プローブ濃度を 250nM に
して測定してください。濃度を 250nM とすると、プローブ制限を回避することができ、
∆Rn 値が大きくなります。∆Rn 値が大きい場合には、反応が強力であって増幅効率が良
いため、生成物の収率が高くピーク測定が正確になります。
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
3-33
第 3 章 定量実験
a）線形表示
250 nM プローブ
150 nM プローブ
100 nM プローブ
50 nM プローブ
サイクル
b）対数表示
250 nM プローブ
150 nM プローブ
100 nM プローブ
50 nM プローブ
サイクル
図 3-6 50nM から 250nM までプローブ濃度を変化させた場合の増幅プロット（線形
および対数表示）
3-34
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
第 3 章 定量実験
詳細について
詳細については：
• TaqMan 試薬の使用に関しては、以下をご参照ください。
– TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2✕) Protocol
– TaqMan® Gene Expression Master Mix Protocol
– TaqMan® Universal PCR Master Mix Protocol
• SYBR Green 試薬の使用に関しては、以下をご参照ください。
– Power SYBR® Green PCR Master Mix and RT-PCR Protocol
– SYBR® Green PCR Master Mix and RT-PCR Reagents Protocol
– SYBR® Green PCR and RT-PCR Reagents Protocol
• StepOne および StepOnePlus システムで行う定量実験に関しては、以下をご参照く
ださい。
– Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems
標準曲線実験入門ガイド
– Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems
相対標準曲線と比較 CT 実験入門ガイド
『Applied Biosystems
• StepOne および StepOnePlus システムで行う有無実験については、
StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 有無実験入門ガイド』を
ご参照ください。
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
3-35
第 3 章 定量実験
3-36
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
ジェノタイピング実験
4
本章の内容：
セクション 4.1 ジェノタイピング実験について . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-3
セクション 4.2 設計ガイドライン . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-9
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
4-1
第 4 章 ジェノタイピング実験
4-2
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
第 4 章 ジェノタイピング実験
セクション 4.1
ジェノタイピング実験について
本セクションの内容：
概要 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-4
アッセイタイプの選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-6
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
4-3
第 4 章 ジェノタイピング実験
概要
ジェノタイピング
実験とは？
ジェノタイピング実験とは、未知のサンプルのジェノタイプを決定するエンドポイント
実験です。この実験タイプでは、一塩基多型（SNP）の区別が可能です。
ジェノタイピング実験では、未知のサンプルが以下に該当するかどうかを決定します。
• ホモ接合体（アレル 1 のみを含むサンプル）
• ホモ接合体（アレル 2 のみを含むサンプル）
• ヘテロ接合体（アレル 1 およびアレル 2 の両方を含むサンプル）
コンポーネント
ジェノタイピング実験用の PCR 反応には、以下のコンポーネントが含まれます。
• サンプル － ターゲットのジェノタイプが未知のサンプル。
• （オプション）反復 － 同じコンポーネントと容量を含む同一の反応。
• ネガティブコントロール － テンプレートの代わりに蒸留水か緩衝液を含むサンプ
ル。テンプレートを含まないコントロール（NTC）ともいう。ネガティブコント
ロールでは増幅しません。
• （オプション）ポジティブコントロール － 既知のジェノタイプ（アレル 1 のホモ接
合体、アレル 2 のホモ接合体、アレル 1 および 2 のヘテロ接合体）を含むサンプル。
装置
ジェノタイピング実験には、二つのステップが必要であり、サーマルサイクリング（PCR
増幅）の後に、発生する蛍光信号のエンドポイント検出が行われます。サーマルサイク
リングステップ（PCR 増幅）は、Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™
Real-Time PCR Systems またはスタンドアロンサーマルサイクラーで実施できます。
StepOne™ および StepOnePlus™ システムを使用すると、
• PCR の解析を行うことができ、トラブルシューティングに役立ちます。
• エンドポイントプレート読み取りを個別に行えます。
ジェノタイピング
実験の仕組み
ジェノタイピング実験では、PCR には各アレルに特異的な蛍光色素でラベルしたプロー
ブが含まれます。プローブには、各アレルを区別する、様々な蛍光レポーター色素が含
まれています。
StepOne および StepOnePlus システムでは、TaqMan® マイナーグルーブバインダー
（MGB）プローブを使用できます。各 TaqMan® MGB プローブは、以下を含みます。
• 各プローブの 5′ 末端に結合したレポーター色素
– VIC® 色素は、アレル 1 プローブの 5′ 末端に結合しています。
– FAM™ 色素は、アレル 2 プローブの 5′ 末端に結合しています。
• マイナーグルーブバインダー（MGB）
この修飾により、プローブ長を増すことなく溶融温度（Tm）を高くすることが可
能となり（Afonina et al., 1997; Kutyavin et al., 1997）、短いプローブの設計がで
きます。その結果、TaqMan MGB プローブによって、一致プローブと不一致プロー
ブで Tm 値に大きな差が生じます。Tm 値の差が大きいほど、正確なジェノタイピ
ングを行うことができます。
4-4
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
第 4 章 ジェノタイピング実験
• プローブの 3′ 末端に結合した非蛍光クエンチャー（NFQ）
クエンチャーは蛍光を発生しないため、リアルタイム PCR システムにおいて、レ
ポーター色素の作用をより正確に測定することができます。
PCR 中、各プローブは、フォワードプライマー部位とリバースプライマー部位との間で、
相補的な配列に対して特異的にアニーリングします。AmpliTaq Gold ® DNA Polymerase
は、アレル配列にハイブリダイズ（一致）するプローブのみ開裂します。開裂により、
レポーター色素は、クエンチャー色素から分離し、レポーター色素の蛍光が増加します。
このように、PCR 増幅中に発生する蛍光信号は、サンプル中に存在するアレルを示しま
す。
プローブとアレル配列の不一致
プローブとアレルとの不一致により、プローブのハイブリダイゼーション効率が低下し
ます（図 4-1）。また、AmpliTaq Gold DNA Polymerase は、不一致プローブを開裂する
のではなく、不一致プローブを取り除いて、リポーター色素を生じる作用があると考え
られています。
図 4-1 ジェノタイピング実験におけるアレルとプローブ配列の一致および不一致に
よる結果
表 4-1 に、上記のジェノタイピング実験例で考えられる結果を要約しました。
表 4-1
ジェノタイピング実験結果
以下のシグナルが大幅に増加した場合
ワークフロー
意味
VIC® 色素の蛍光のみ
アレル 1 のホモ接合性
FAM™ 色素の蛍光のみ
アレル 2 のホモ接合性
両方の蛍光シグナル
ヘテロ接合性
StepOne システムおよび StepOnePlus システムでジェノタイピング実験を行う前に、以
下のように実験の準備を行います。
1. アッセイタイプを選択します（下記）。
2. 選択したアッセイタイプに関する設計ガイドラインを確認します（セクション 4.2
（4-9 ページ））
。
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
4-5
第 4 章 ジェノタイピング実験
アッセイタイプの選択
StepOne ソフトウェアで実験を設計する場合には、ジェノタイピング実験として、以下
のアッセイタイプを選択できます。
• 設計済み／検証済み（下記）
• カスタム（4-7 ページ）
本セクションでは、各アッセイタイプに利用可能な製品をリストします。
参考： アッセイは、目的とするターゲットに特異的です。マスターミックスには、PCR
反応を行うために必要なその他のコンポーネントが含まれています。
設計済み／
検証済みアッセイ
製品
属性
TaqMan® SNP
Genotyping Assays
• 高密度でゲノムワイドなマーカー範囲用設計済みアッセイ。
• スクリーニング、関連解析、候補領域、候補遺伝子やファイン
マッピング研究用。
• 便利な単一チューブ形式。
TaqMan® Drug
Metabolism Genotyping
Assays
• 各種の薬物代謝酵素や薬物トランスポーターをコードする
220 種類に及ぶ遺伝子の多型を検出。
• 一塩基多型（SNP）、挿入／欠失（in/del）や多塩基多型（MNP）
の研究用。
Pre-Developed TaqMan®
Assay Reagents for Allelic
Discrimination
• ジェノタイプに応じて精製した、特異的な突然変異用 DNA サ
ンプル。ほとんどのアッセイで 2 つのアレル間の一塩基多型
（SNP）の判別が可能。
• ジェノタイピングの精度を高めるため、マイナーグルーブバイ
ンダー（MGB）を添加。
• アレル 1 および 2 コントロール DNA を含み、各測定において
各ホモ接合体信号が発生するように設計。
• 密閉チューブシステムにより、PCR 後の操作やゲルが不要。
TaqMan® Genotyping
Master Mix
SNPジェノタイピングアプリケーションでエンドポイント蛍光検
出に最適化されています。
• 特異的なクラスターと高いコール率により、明確なアレル識別
が可能。
• 優れた PCR 前および後の安定性により、ハイスループットセッ
トアップと解析を実現。
• TaqMan® SNP Genotyping Assays により検証済み。
• 全アッセイに同一試薬を用いることで、アッセイの実施を簡素
化。
TaqMan® 2✕ Universal
PCR Master Mix （with
または without AmpErase®
UNG）
• cDNA または DNA をテンプレートに用いる TaqMan® アッセイ
で最適性能を発揮。
• 優れたアッセイ能を保証するコンポーネントを含む。
• 全アッセイに同一試薬を用いることで、アッセイの実施を簡素
化。
参考： ジェノタイピング実験では、Fast または SYBR® Green マスターミックスやプロ
トコルは使用できません。
設計済み／検証済みアッセイを用いて実験を設計する際のガイドラインについては、
4-10 ページをご参照ください。
4-6
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
第 4 章 ジェノタイピング実験
カスタムアッセイ
製品
属性
Custom TaqMan® SNP
Genotyping Assays
•
•
•
•
TaqMan® Genotyping
Master Mix
SNPジェノタイピングアプリケーションでエンドポイント蛍光検
出に最適化されています。
いかなる生物体でも一塩基多型（SNP）の検出が可能。
6 塩基までの挿入／欠失（in/del）を検出。
6 塩基までの多塩基多型（MNP）を検出。
便利な単一チューブ形式。
• 特異的なクラスターと高いコール率により、明確なアレル識別
が可能。
• 優れた PCR 前および後の安定性により、ハイスループットセッ
トアップと解析を実現。
• TaqMan® SNP Genotyping Assays により検証済み。
• 全アッセイに同一試薬を用いることで、アッセイの実施を簡素
化。
TaqMan® 2✕ Universal
PCR Master Mix （with
または without AmpErase®
UNG）
• cDNA または DNA をテンプレートに用いる TaqMan® アッセイ
で最適性能を発揮。
• 優れたアッセイ能を保証するコンポーネントを含む。
• 全アッセイに同一試薬を用いることで、アッセイの実施を簡素
化。
参考： ジェノタイピング実験では、Fast または SYBR® Green マスターミックスやプロ
トコルは使用できません。
カスタムアッセイを用いて実験を設計する際のガイドラインについては、4-14 ページを
ご参照ください。
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
4-7
第 4 章 ジェノタイピング実験
4-8
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
第 4 章 ジェノタイピング実験
セクション 4.2
設計ガイドライン
本セクションの内容：
設計済み／検証済みアッセイ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-10
TaqMan® SNP Genotyping Assays. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-10
TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-11
Pre-Developed TaqMan® Assay Reagents for Allelic Discrimination . . . . . . . 4-12
マスターミックスの選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-13
実験の設計 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-14
カスタムアッセイ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-14
Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-14
マスターミックスの選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-16
実験の設計 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4-16
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
4-9
第 4 章 ジェノタイピング実験
設計済み／検証済みアッセイ
ワークフロー
Applied Biosystems の設計済み／検証済みアッセイを用いてジェノタイピング実験を設
計する際、Applied Biosystems は、以下のワークフローに従うようお勧めします。
1. アッセイを選択します。
• TaqMan® SNP Genotyping Assays（下記）
• TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays（4-11 ページ）
• TaqMan® Pre-Developed Assays Reagents for Allelic Discrimination（4-12
ページ）
2. マスターミックスを選択します（4-13 ページ）。
3. StepOne™ ソフトウェアを用いて実験を設計します（4-14 ページ）。
TaqMan® SNP Genotyping Assays
製品の説明
TaqMan® SNP Genotyping Assays は、ヒト一塩基多型（SNP）のジェノタイピング研
究用のプライマーとプローブのセットを包括的に含むアッセイです。
このアッセイには、次の特徴があります。
• TaqMan® 試薬を用いて、精製したゲノム DNA サンプル中の特定の SNP アレルを
増幅、検出します。
• アッセイはすべて、Applied Biosystems のインフォマティックスパイプラインとソ
フトウェアの他、Celera Genomics 社や公共のデータベースを用いて設計されてい
ます。
• Applied Biosystems TaqMan® マスターミックスを用いて、広範なサーマルサイク
リング条件により、最適な性能を発揮するように設計されています。
製品の必要条件
TaqMan SNP Genotyping Assays では、以下が必要です。
• 次の 3 コンポーネント：
– 1 から 20ng の精製したゲノム DNA サンプル。
– 20✕、40✕、または 80✕ の SNP Genotyping Assay Mix（各多型に固有）。各アッ
セイは、対象の SNP を増幅する配列特異的なフォワードプライマーとリバース
プライマーに加え、2 種類の TaqMan MGB プローブを含みます。一方のプロー
ブは VIC® 色素でラベルされており、アレル 1 配列を検出します。他方のプロー
ブは FAM™ 色素でラベルされており、アレル 2 配列を検出します。
– TaqMan® Genotyping Master Mix または TaqMan® 2✕ Universal PCR Master
Mix（with または without AmpErase® UNG）。
• 結果を得るための PCR 増幅およびエンドポイント読み取り。
4-10
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
第 4 章 ジェノタイピング実験
利用可能なアッセイ
TaqMan SNP Genotyping Assays は、TaqMan® Pre-Designed SNP Genotyping Assays
として入手可能です。
• 450 万を超える種類の設計済みのゲノムワイドなアッセイがあり、そのうち 350 万
がヒト HapMap SNP アッセイ、70,000 がヒト cSNP アッセイ、160,000 が検証済
みヒトアッセイおよび 10,000 がマウスアッセイです。
• 小、中、大サイズあり。
• Made to Order（すなわち、注文後に製造）。
詳細について
• 最新の製品および各製品の使用方法については、Applied Biosystems ウェブサイト
をご覧ください：
http://www.allsnps.com/
または
http://www.appliedbiosystems.com/
（TaqMan® 製品）から、
［TaqMan® SNP
a. ホームページの［TaqMan® Products］
Genotyping Assays］を選択します。
（設計
b. ［SNP Genotyping Assays］ページの［Pre-Designed/Validated Assays］
®
済み／検証済みアッセイ）で、
［TaqMan SNP Genotyping Assays］を選択
します。
• TaqMan SNP Genotyping Assays を使って PCR 反応を調製する方法については、
『TaqMan® SNP Genotyping Assays Protocol』をご参照ください。
TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays
製品の説明
TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays は、薬物代謝関連遺伝子の SNP、挿入
や欠損（インデル）、多塩基多型（MNP）のジェノタイピング研究用のプライマーとプ
ローブのセットを包括的に含む Inventoried アッセイです。
このアッセイには、次の特徴があります。
• TaqMan 試薬を用いて、精製したゲノム DNA サンプル中の特定の多型を増幅、検
出します。
• Applied Biosystems のインフォマティックスパイプラインとソフトウェアの他、公
共の SNP データベースによるゲノム情報や公共のゲノムアセンブリーデータを用
いて設計されています。
• Applied Biosystems TaqMan® マスターミックスを用いて、最適な性能を発揮する
ように設計されています。
製品の必要条件
TaqMan Drug Metabolism Genotyping Assays には、以下が必要です。
• 次の 3 コンポーネント：
– 3 から 30ng の精製したゲノム DNA サンプル。
– 20✕ の Drug Metabolism Genotyping Assay Mix（各多型に固有）。各アッセイ
は、対象の多型配列を増幅する配列特異的なフォワードプライマーとリバースプ
ライマーに加え、2 種類の TaqMan MGB プローブを含みます。一方のプローブ
は VIC 色素でラベルされており、アレル 1 配列を検出します。他方のプローブ
は FAM 色素でラベルされており、アレル 2 配列を検出します。
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
4-11
第 4 章 ジェノタイピング実験
– TaqMan® Genotyping Master Mix または TaqMan® 2✕ Universal PCR Master
Mix（with または without AmpErase® UNG）。
• 結果を得るための PCR 増幅およびエンドポイント読み取り。
詳細について
• 最新の製品および各製品の使用方法については、Applied Biosystems ウェブサイト
をご覧ください：
http://www.allsnps.com/
または
http://www.appliedbiosystems.com/
（TaqMan® 製品）から、
［TaqMan® SNP
a. ホームページの［TaqMan® Products］
Genotyping Assays］を選択します。
（設計
b. ［SNP Genotyping Assays］ページの［Pre-Designed/Validated Assays］
®
済み／検証済みアッセイ）で、［TaqMan Drug Metabolism Genotyping
Assays］を選択します。
• TaqMan SNP Genotyping Assays を使って PCR 反応を調製する方法については、
『TaqMan® Drug Metabolism Genotyping Assays Protocol』をご参照ください。
Pre-Developed TaqMan® Assay Reagents for Allelic Discrimination
製品の説明
Pre-Developed TaqMan® Assay Reagents for Allelic Discrimination（TaqMan® PDARs
for AD）は、特異的なアレル識別用に最適化された Inventoried アッセイです。
このアッセイには、次の特徴があります。
• TaqMan 試薬を用いて、精製したゲノム DNA サンプル中の特定の多型を増幅、検
出します。
• Applied Biosystems TaqMan® マスターミックスを用いて、広範なサーマルサイク
リング条件により、最適な性能を発揮するように設計されています。
製品の必要条件
TaqMan PDARs for AD には、次の 3 つのコンポーネントが含まれます。
• 2 から 20ng の精製したゲノム DNA サンプル。
• 10✕ の Allelic Discrimination Assay Mix（各多型に固有）。各アッセイは、対象の
多型配列を増幅する配列特異的なフォワードプライマーとリバースプライマーに
加え、2 種類の TaqMan MGB プローブを含みます。一方のプローブは VIC 色素で
ラベルされており、アレル 1 配列を検出します。他方のプローブは FAM 色素でラ
ベルされており、アレル 2 配列を検出します。
• TaqMan® Genotyping Master Mix または TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix
（with または without AmpErase® UNG）
。
参考： 各アッセイは、アレル 1 および 2 コントロール DNA を含み、各測定において各
ホモ接合体信号が発生するように設計されています。
詳細について
• 最新の製品および各製品の使用方法については、Applied Biosystems ウェブサイト
をご覧ください：
http://www.allsnps.com/
4-12
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
第 4 章 ジェノタイピング実験
または
http://www.appliedbiosystems.com/
（TaqMan® 製品）から、
［TaqMan® SNP
a. ホームページの［TaqMan® Products］
Genotyping Assays］を選択します。
（設計
b. ［SNP Genotyping Assays］ページの［Pre-Designed/Validated Assays］
済み／検証済みアッセイ）で、
［TaqMan® Pre-Developed Assay Reagents
for Allelic Discrimination (TaqMan® PDARs for AD)］を選択します。
• TaqMan PDARs for Allelic Discrimination を使って PCR 反応を調製する方法につ
い て は、
『Pre-Developed TaqMan® Assay Reagents Allelic Discrimination
Protocol』をご参照ください。
マスターミックスの選択
利用可能な
マスターミックス
ジェノタイピング実験用 Applied Biosystems 調製済み／検証済みアッセイは、以下のマ
スターミックスを用いるように設計されています。
• TaqMan PDARs for AD には、TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix（with
AmpErase® UNG）が含まれています。
• TaqMan SNP Genotyping Assays および Custom TaqMan SNP Genotyping Assays
は、以下の試薬と一緒に使用できます。
マスターミックス
部品番号
TaqMan® Genotyping Master Mix、1-Pack（1 × 10 mL）、
400 反応
4371355
TaqMan® Genotyping Master Mix、1 Bulk Pack（1 × 50 mL）、
2000 反応
4371357
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、200 反応
4304437
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、2000 反応
4326708
10-Pack、TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix
4305719
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、No AmpErase®
UNG、200 反応
4324018
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、No AmpErase®
UNG、2000 反応
4326614
10-Pack、TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix,
No AmpErase® UNG
4324020
参考： ジェノタイピング実験では、Fast または SYBR® Green マスターミックスやプロ
トコルは使用できません。
詳細について
TaqMan マスターミックスの使用に関しては、以下をご参照ください。
• TaqMan® Genotyping Master Mix Protocol
• TaqMan® Universal PCR Master Mix Protocol
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
4-13
第 4 章 ジェノタイピング実験
実験の設計
StepOne ソフト
ウェアの使用
Applied Biosystems 設計済み／検証済みアッセイでは、StepOne ソフトウェアを用いて
ジェノタイピング試験の設計を行ってください。StepOne ソフトウェアは、自動的に以
下の量を計算します。
• 反応ミックスコンポーネント
• サンプル希釈液
［Design Wizard］
（設計
参考： StepOne ソフトウェアで SNP アッセイを選択するには、
（高度
ウィザード）の［SNP Assays］（SNP アッセイ）画面または［Advanced Setup］
なセットアップ）の［Plate Setup］（プレートのセットアップ）画面を開きます。［SNP
Assays］（SNP アッセイ）画面または［Plate Setup］（プレートのセットアップ）画面
で、ライブラリからアッセイを選択するか、または新たにアッセイを作成します。
詳細について
StepOne および StepOnePlus システムで行うジェノタイピング実験の設計や実施の方法
に つ い て は、
『 Applied Biosystems StepOne™ お よび StepOnePlus™ Real-Time PCR
Systems ジェノタイピング実験入門ガイド』をご参照ください。
カスタムアッセイ
ワークフロー
Applied Biosystems カスタムアッセイを用いてジェノタイピング実験を設計する際、
Applied Biosystems は、以下のワークフローに従うことをお勧めします。
1. アッセイとして Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays（下記）を注文します。
2. マスターミックスを選択します（4-16 ページ）。
3. StepOne ソフトウェアを用いて実験を設計します（4-16 ページ）。
Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays
製品の説明
Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays は、TaqMan プローブとプライマーのセット
で、お客様から提示のあった配列情報に基づいて Custom TaqMan® Genomic Assays
サービスが設計、合成、調製したものです。Custom TaqMan SNP Genotyping Assays
によって、以下が可能となります。
操作
いかなる生物体でも一塩基多型（SNP）に関
するジェノタイピング試験を実施
具体例
AGTTCATCCATGGTCA -->
AGTTCATACATGGTCA
AGTTCAT[C/A]CATGGTCA と表記
ジェノタイピング試験で 6 塩基までの挿入／
欠失（in/del）を検出
AGTTCATCCATGGTCA -->
AGTTCATGGTCA
AGTTCAT[CCAT/*]GGTCA と表記
ジェノタイピング試験で 6 塩基までの多塩基
多型（MNP）を検出
AGTTCATCCGGTCA -->
AGTTCATATGGTCA
AGTTCAT[CC/AT]GGTCA と表記
4-14
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
第 4 章 ジェノタイピング実験
このアッセイには、次の特徴があります。
• TaqMan 試薬を用いて、精製したゲノム DNA（gDNA）中の特定の多型を増幅、検
出します。
• 独自のアッセイ設計ソフトウェアを用いて開発されています。
• Applied Biosystems TaqMan® マスターミックスを用いて、広範なサーマルサイク
リング条件により、最適な性能を発揮するように設計されています。
製品の必要条件
Custom TaqMan SNP Genotyping Assays では、以下が必要です。
• ターゲット SNP 配列に関する提出用ファイル。無償の File Builder ソフトウェアを
使用して提出用ファイルを作成し、Custom TaqMan® Genomic Assays サービスに
当該ファイルを提示してください。
• 次の 3 コンポーネント：
– ウェル当たり 1 から 20ng の精製した gDNA サンプル。
– 40✕ SNP Genotyping Assay または 80✕ SNP Genotyping Assay（各多型に固
有）
。各アッセイは、対象の SNP を増幅する配列特異的なフォワードプライマー
とリバースプライマーに加え、2 種類の TaqMan MGB を含みます。一方のプ
ローブは VIC 色素でラベルされており、アレル 1 配列を検出します。他方のプ
ローブは FAM 色素でラベルされており、アレル 2 配列を検出します。
– TaqMan® Genotyping Master Mix または TaqMan® Universal PCR Master Mix
（with または without AmpErase® UNG）
。
• 結果を得るための PCR 増幅およびエンドポイント読み取り。
詳細について
• 最新の製品および各製品の使用方法については、Applied Biosystems ウェブサイト
をご覧ください：
http://www.allsnps.com/
または
http://www.appliedbiosystems.com/
（TaqMan® 製品）から、
［TaqMan® SNP
a. ホームページの［TaqMan® Products］
Genotyping Assays］を選択します。
b. ［SNP Genotyping Assays］ページの［Custom Assays］（カスタムアッセイ）
から、［Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays］を選択します。
『Custom TaqMan®
• Custom TaqMan SNP Genotyping Assays の注文方法については、
Genomic Assays Protocol: Submission Guidelines』をご参照ください。
• Custom TaqMan SNP Genotyping Assays を使って PCR 反応を調製する方法につ
いては、
『Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays Protocol』をご参照ください。
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
4-15
第 4 章 ジェノタイピング実験
マスターミックスの選択
利用可能な
マスターミックス
ジェノタイピング実験用の Applied Biosystems Made to Order アッセイは、以下のマス
ターミックスを用いるように設計されています。
マスターミックス
部品番号
TaqMan® Genotyping Master Mix、1-Pack（1 × 10 mL）、400 反応
4371355
TaqMan® Genotyping Master Mix、1 Bulk Pack（1 × 50 mL）、2000 反応
4371357
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、200 反応
4304437
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、2000 反応
4326708
10-Pack、TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix
4305719
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、No AmpErase® UNG、200 反応
4324018
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、No AmpErase® UNG、2000 反応
4326614
10-Pack、TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix, No AmpErase® UNG
4324020
参考： ジェノタイピング実験では、Fast または SYBR® Green マスターミックスやプロ
トコルは使用できません。
詳細について
TaqMan マスターミックスの使用に関しては、以下をご参照ください。
• TaqMan® Genotyping Master Mix Protocol
• TaqMan® Universal PCR Master Mix Protocol
実験の設計
StepOne ソフト
ウェアの使用
Applied Biosystems カスタムアッセイでは、StepOne ソフトウェアを用いてジェノタイ
ピング試験の設計を行ってください。StepOne ソフトウェアは、自動的に以下の量を計
算します。
• 反応ミックスコンポーネント
• サンプル希釈液
［Design Wizard］
（設計
参考： StepOne ソフトウェアで SNP アッセイを選択するには、
（高度
ウィザード）の［SNP Assays］（SNP アッセイ）画面または［Advanced Setup］
なセットアップ）の［Plate Setup］（プレートのセットアップ）画面を開きます。［SNP
Assays］（SNP アッセイ）画面または［Plate Setup］（プレートのセットアップ）画面
で、ライブラリからアッセイを選択するか、または新たにアッセイを作成します。
詳細について
StepOne および StepOnePlus システムで行うジェノタイピング実験の設計や実施の方法に
ついては、
『Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems
ジェノタイピング実験入門ガイド』をご参照ください。
4-16
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
5
有無実験
本章の内容：
セクション 5.1 有無実験について . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-3
セクション 5.2 設計ガイドライン . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-9
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
5-1
第 5 章 有無実験
5-2
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
第 5 章 有無実験
セクション 5.1
有無実験について
本セクションの内容：
概要 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-4
アッセイタイプの選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-6
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
5-3
第 5 章 有無実験
概要
有無実験とは？
有無実験とは、特定の核酸配列（ターゲット）がサンプル中に存在するか、しないかを
決定するエンドポイントアッセイです。ターゲットの実際の量は定量できません。
有無実験は、ウイルスやバクテリアなどの病原体が存在するか、しないかを検出するた
めに広く使用されています。例えば、有無実験を用いて、ハンバーガー肉中に Salmonella
菌が存在するかどうかを調べることができます。結果は、Salmonella 菌が存在するか、
しないかであって、菌の定量は行えません。
コンポーネント
有無実験用の PCR 反応には、以下のコンポーネントが含まれます。
• サンプル － ターゲットの存在が未知のサンプル。
• 反復 － 同じコンポーネントと容量を含む同一の反応。
• 内在性ポジティブコントロール（IPC）－ PCR 反応に添加する短い合成 DNA テン
プレート。IPC を使用して、真の陰性結果と、PCR 阻害剤や不適切なアッセイセッ
トアップ、試薬や装置の不具合が影響した反応とを区別できます。
参考： 有無実験は、IPC を加えなくとも行えます。しかし、IPC によって、PCR の
失敗を陰性の試験結果と判断する誤りを防止できます。
• ネガティブコントロール － サンプルテンプレートの代わりに蒸留水やバッファー
を含むウェル。ターゲットの増幅は、ネガティブコントロールウェルでは起こりま
せん。
有無実験用の PCR 反応液は、StepOne ソフトウェアによって、3 種類の方法でセット
アップができます。
セットアップ
IPC セットアップ
ウェルタイプ
3 種類のウェルがあります。
• Unknown-IPC wells（未知の IPC ウェル）－ ウェルには、サンプルテ
ンプレートと IPC テンプレートが含まれます。ターゲットの存在は不明
です。
• Negative control-IPC wells（ネガティブコントロール IPC ウェル）－
ウェルには、PCR 反応液中にサンプルテンプレートの代わりに IPC テン
プレートと蒸留水または緩衝液が含まれます。ネガティブコントロール
IPC ウェルでは IPC テンプレートのみが増幅します。反応にサンプルテン
プレートが含まれないからです。別称「IPC+」です。
• Negative control-blocked IPC wells（ネガティブコントロールブロッ
ク済み IPC ウェル）－ ウェルには、PCR 反応液中にサンプルテンプレー
トの代わりに IPC 遮断剤が含まれます。増幅はネガティブコントロール
ブロック済み IPC ウェルでは起きません。反応にサンプルテンプレート
が含まれず、IPC の増幅が遮断されるからです。別称「no amplification
control（NAC）（増幅しないコントロール）」です。
IPC なしの
シングル
プレックス
セットアップ
5-4
2 種類のウェルがあります。
• Unknown wells（未知のウェル）－ ウェルには、サンプルテンプレート
が含まれます。ターゲットの存在は不明です。
• Negative controls（ネガティブコントロール）－ ウェルには、サンプル
テンプレートの代わりに蒸留水やバッファーが含まれます。
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
第 5 章 有無実験
セットアップ
IPC なしの
マルチ
プレックス
セットアップ
ウェルタイプ
2 種類のウェルがあります。
• Unknown-Unknown wells（未知－未知ウェル）－ ウェルには、サンプ
ルテンプレートが含まれます。ターゲットの存在は不明です。
• Negative control-Negative control wells（ネガティブコントロール－
ネガティブコントロールウェル）－ ウェルには、サンプルテンプレート
の代わりに蒸留水や緩衝液が含まれます。
エンドポイント検出と
PCR 後プレート
読み取り
有無実験は、エンドポイント実験であって、PCR が完了した後に蛍光データが収集され
ます。
有無実験の仕組み
PCR 中、蛍光プローブは、テンプレート DNA 上のフォワードプライマー部位とリバー
有無実験のトラブルシューティングを行うため、Applied Biosystems StepOne™ および
StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems を用いてリアルタイム PCR を実施することが
できます。PCR 増幅に StepOne™ および StepOnePlus™ システムを用いる場合には、PCR
前読み取りと PCR 後読み取りとを個別に実施してください。
スプライマー部位との間にある相補的なターゲットに対して、特異的にアニーリングし
ます。その後伸長中に、AmpliTaq Gold® DNA Polymerase は、ターゲットを含む各サ
ンプル中のハイブリダイズしたプローブを開裂します。各一致プローブの開裂により、
レポーター色素は、クエンチャー色素から分離し、レポーター色素の蛍光が増加します。
PCR サイクリング後に、StepOne™ および StepOnePlus™ 装置は、PCR 増幅中に発生し
た蛍光を読み取ります。この蛍光信号を用いて、各サンプル中にターゲットが存在する
か、しないかを決定します。レポーター信号は、以下の式により、パッシブリファレン
スの蛍光に対してノーマライズが行われます。
Rn (TT)
=
ターゲットテンプレート配列の蛍光強度
パッシブリファレンスの蛍光強度
Rn (IPC) =
内在性ポジティブコントロールの蛍光強度
パッシブリファレンスの蛍光強度
IPC の取り込み
IPC は、低コピー数の構成核酸を検出するために反応プレートに加えられる、もう一つ
の TaqMan® プローブとプライマーのセットです。同じ反応ウェル中の IPC とターゲッ
トは、同時に増幅されます。ウェルに増幅が起こらない場合には、StepOne™ ソフトウェ
アは、IPC の陽性信号を用いて、ウェルに増幅が起こらなかったのはターゲットテンプ
レートが存在しなかったからであって、分注時の誤操作や抑制によるものではないこと
を確認します。
参考： 有無実験は、IPC を加えなくとも行えます。しかし、IPC によって、PCR の失敗
を陰性の試験結果と判断する誤りを防止できます。
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
5-5
第 5 章 有無実験
ワークフロー
StepOne システムおよび StepOnePlus システムで実験を行う前に、以下のように実験の
準備を行います。
1. アッセイタイプを選択します（下記）。
2. 選択したアッセイタイプに関する設計ガイドラインを確認します（セクション 5.2
（5-9 ページ））。
アッセイタイプの選択
StepOne ソフトウェアで実験を設計する場合には、有無実験として、以下のアッセイタ
イプを選択できます。
• Inventoried/Made to Order（在庫／注文生産）（5-7 ページ）
• カスタム（5-8 ページ）
本セクションでは、各アッセイタイプに利用可能な製品をリストします。
参考： アッセイは、目的とするターゲットに特異的です。マスターミックスには、PCR
反応を行うために必要なその他のコンポーネントが含まれています。
5-6
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
第 5 章 有無実験
Inventoried/Made
to Order
（在庫／注文生産）
アッセイ
製品
属性
TaqMan® Gene Expression
Assays
• ヒト、マウス、ラット、Arabidopsis、Drosophila、C. elegans、
C. familiares（イヌ）および M. mulatta（アカゲザル）遺伝子
用の調製済み遺伝子特異的プライマーとプローブのセット
• プローブは、FAM™ 色素ラベル MGB プローブ
• 便利な単一の 20✕ チューブで提供
• Inventoried（在庫）または Made to Order（注文生産）アッセ
イとして入手可能
TaqMan® Endogenous
Control Assays
• 最適化、調製済み、そのまま使用可能な内在性コントロール
アッセイ
• ヒト、マウス、ラット、Arabidopsis、Drosophila およびあら
ゆる真核生物種用のコスト効果が高い遺伝子発現定量
• FAM™ 色素と VIC® 色素ラベルの選択が可能（プライマー制限）
参考：FAM™ 色素ラベル化
TaqMan® Endogenous
Control Assays は、
Inventoried TaqMan Gene
Expression Assays として
含まれています。
Custom TaqMan® Gene
Expression Assays
TaqMan® Gene Expression
Master Mix
•
•
•
•
あらゆる種または生物
自由にターゲットを選択
プローブは、FAM™ 色素ラベル MGB プローブ
便利な単一の 20✕ チューブで提供
リアルタイム PCR により、通常の実験や特殊な実験で正確な定
量を行う場合に使用
• ターゲットの 1 コピーまで検出する優れた検出精度
• 1 回の反応中に含まれる 2 つのターゲットを一緒に増幅するマ
ルチプレックス PCR
• 同じ遺伝子ファミリーに属する遺伝子の区別が可能な高い特
異性
• Custom TaqMan® Gene Expression Assays により検証済み
• 全アッセイに同一試薬を用いることで、アッセイの実施を簡素
化
TaqMan® 2✕ Universal
PCR Master Mix （with
または without AmpErase®
UNG）
• cDNA または DNA をテンプレートに用いる TaqMan® アッセイ
で最適性能を発揮
• 優れたアッセイ能を保証するコンポーネントを含む
• 全アッセイに同一試薬を用いることで、アッセイの実施を簡素
化
重要！ Applied Biosystems は、TAMRA™ 色素をレポーターやクエンチャーとして
StepOne システムで使うことはお勧めしません。TAMRA 色素は、StepOnePlus システ
ムでレポーターやクエンチャーとして使えます。
参考： 有無実験では、Fast または SYBR® Green マスターミックスやプロトコルは使用
できません。
Inventoried/Made to Order（在庫／注文生産）アッセイを用いて実験を設計する際のガ
イドラインについては、（5-10 ページ）をご参照ください。
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
5-7
第 5 章 有無実験
カスタムアッセイ
製品
属性
カスタム TaqMan® プローブ
とプライマー
• あらゆる種または生物
• 色素ラベル、クエンチャーおよび合成スケールを自由に選択
• Applied Biosystems のアッセイ設計ガイドラインに従い、Primer
Express® Software で使用
Primer Express® Software
リアルタイム PCR 用のプライマーとプローブを設計するソフト
ウェア
TaqMan® Gene Expression
Master Mix
リアルタイム PCR により、通常の実験や特殊な実験で正確な定
量を行う場合に使用
• ターゲットの 1 コピーまで検出する優れた検出精度
• 1 回の反応中に含まれる 2 つのターゲットを一緒に増幅するマ
ルチプレックス PCR
• 同じ遺伝子ファミリーに属する遺伝子の区別が可能な高い特
異性
• Custom TaqMan® Gene Expression Assays により検証済み
• 全アッセイに同一試薬を用いることで、アッセイの実施を簡素
化
TaqMan® 2✕ Universal
PCR Master Mix （with
または without AmpErase®
UNG）
• cDNA または DNA をテンプレートに用いる TaqMan® アッセイ
で最適性能を発揮
• 優れたアッセイ能を保証するコンポーネントを含む
• 全アッセイに同一試薬を用いることで、アッセイの実施を簡素
化
重要！ Applied Biosystems は、TAMRA™ 色素をレポーターやクエンチャーとして
StepOne システムで使うことはお勧めしません。TAMRA 色素は、StepOnePlus システ
ムでレポーターやクエンチャーとして使えます。
参考： 有無実験では、Fast または SYBR® Green マスターミックスやプロトコルは使用
できません。
カスタムアッセイを用いて実験を設計する際のガイドラインについては、
（5-16 ページ）
をご参照ください。
5-8
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
第 5 章 有無実験
セクション 5.2
設計ガイドライン
本セクションの内容：
Inventoried/Made to Order（在庫／注文生産）アッセイ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
TaqMan® Gene Expression Assays. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Custom TaqMan® Gene Expression Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents. . . . . . . . . . . . . . . . .
5-10
5-10
5-12
5-13
マスターミックスの選択 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-15
実験の設計 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-16
カスタムアッセイ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5-16
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
5-9
第 5 章 有無実験
Inventoried/Made to Order（在庫／注文生産）アッセイ
ワークフロー
StepOne™ ソフトウェアで Inventoried/Made to Order アッセイタイプを選択する場合に
は、Applied Biosystems は、以下のワークフローによることをお勧めします。
1. アッセイを選択します。
• TaqMan® Gene Expression Assays（下記）
• Custom TaqMan® Gene Expression Assays（5-12 ページ）
2. TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents を使用します（5-13 ペー
ジ）。
参考： 有無実験は、IPC を加えなくとも行えます。しかし、IPC によって、PCR の
失敗を陰性の試験結果と判断する誤りを防止できます。
3. マスターミックスを選択します（5-15 ページ）。
4. StepOne ソフトウェアを用いて実験を設計します（5-16 ページ）。
TaqMan® Gene Expression Assays
製品の説明
TaqMan® Gene Expression Assays は、ヒト、マウス、ラット、Arabidopsis、Drosophila、
C. elegans、C. familiares（イヌ）および M. mulatta（アカゲザル）遺伝子の有無実験を
行うために開発された、Inventoried/Made to Order のプローブとプライマーのセットを
包括的に含むアッセイです。
このアッセイには、次の特徴があります。
• このアッセイは、TaqMan® 試薬を用いて cDNA サンプル中のターゲットを増幅し、
検出します。
• このアッセイは、自動化デザインと品質管理されたパイプラインにより設計されて
います。Inventoried アッセイは、製造後在庫管理されており、Made to Order アッ
セイは、設計済みで注文があった後に製造されます。
• Applied Biosystems TaqMan® マスターミックスを用いて、広範なサーマルサイク
リング条件により、最適な性能を発揮するように設計されています。
• 可能な場合には、エクソン－エクソン結合部とクロスするプローブを設計すること
により、ゲノム DNA を増幅することなくターゲット cDNA の増幅が行えます（アッ
セイ ID に m サフィックスが表示される）。
製品の必要条件
TaqMan Gene Expression Assays には、以下が必要です。
• 次の 3 コンポーネント：
– ウェル当たりの cDNA サンプル（RNA から変換）量は 1 ～ 100 ng で、各測定
ウェル中の cDNA 量は同じ。
– 20✕ Gene Expression Assay Mix（各ターゲットに特異的）。各アッセイミック
スは、調製済み 20✕ ミックス中に、2 つの非ラベル PCR プライマーと FAM™ 色
素ラベル TaqMan® MGB（マイナーグルーブバインダー）プローブを含みます。
1✕ の最終濃度は、プローブが 250 nM、各プライマーは 900 nM です。
– TaqMan® Gene Expression Master Mix または TaqMan Universal PCR Master
Mix（with または without AmpErase UNG）。
5-10
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
第 5 章 有無実験
利用可能なアッセイ
TaqMan Gene Expression Assays は、ヒト、マウス、ラット、Arabidopsis、Drosophila、
C. elegans、C. familiares（イヌ）および M. mulatta（アカゲザル）遺伝子用に利用でき
ます。部品番号は、
• Inventoried アッセイは PN 4331182
• Made to Order アッセイは PN 4351372
アッセイ名のプレフィックスは、アッセイ対象種を表しています。Hs は Homo sapiens
（ヒト）、Mm は Mus musculus（マウス）、Rn は Rattus norvegicus（ラット）、At は
Arabidopsis thaliana、Dm は Drosophila melanogaster、Ce は C. elegans、Cf は
C. familiares（イヌ）、Rh は M. mulatta（アカゲザル）です。
アッセイ名のサフィックスは、以下の表に示すようなアッセイの特徴を示します。
サフィックス
説明
_m
このアッセイのプローブはエクソン結合部に広がるため、ゲノム DNA を検出
しません。
_s
このアッセイのプライマーおよびプローブは単一エクソン内で作用するよう設
計されており、ゲノム DNA を検出します。
_g
このアッセイのプライマーおよびプローブは単一エクソン内で作用する可能性
があり、ゲノム DNA を検出する可能性があります。
_mH
このアッセイは、配列相同性が高い遺伝子ファミリーに属するトランスクリプ
ト用に設計されています。このアッセイでは、ターゲット遺伝子と最も類似し
た配列相同性を有する遺伝子との間で、10 CT から 15 CT の差が出ます。その
ため、サンプル中にターゲットトランスクリプトと最も相同性が高いトランス
クリプトに同数のコピーがあった場合、最も相同性が高いトランスクリプトの
1000 から 30,000 倍の感度でターゲットトランスクリプトを検出できます。
_sH
_gH
_u
このアッセイのアンプリコンはエクソン結合部に広がり、プロ－ブはそのうち
の一つのエクソン内に完全に配置されます。
TaqMan® Endogenous Control Assays
TaqMan® Endogenous Control Assays は、以下により入手可能です。
• Inventoried TaqMan Gene Expression Assays（PN 4331182）－ 各アッセイには、
1 本の調製済み 20✕ チューブ中に、FAM™ 色素ラベル TaqMan® MGB プローブを
含みます。
• ヒト、マウスおよびラット種用個別コントロールアッセイ（部品番号は多岐）－ 各
アッセイには、FAM™ 色素ラベル TaqMan® MGB プローブ、VIC® 色素ラベル
TaqMan® MGB プローブまたは TAMRA™ 色素ラベルプローブを含みます。VIC 色
素ラベルを含む TaqMan Endogenous Controls では、プライマーが制限されます。
重要！ Applied Biosystems は、TAMRA™ 色素をレポーターやクエンチャーとして
StepOne システムで使うことはお勧めしません。TAMRA 色素は、StepOnePlus システ
ムでレポーターやクエンチャーとして使えます。
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
5-11
第 5 章 有無実験
詳細について
• 最新の製品および各製品の使用方法については、Applied Biosystems ウェブサイト
をご覧ください：
http://www.appliedbiosystems.com/
（TaqMan® 製品）から、
［TaqMan® Gene
a. ホームページの［TaqMan® Products］
Expression Assays］を選択します。
b. ［Gene Expression Assays & Arrays］のページで、
（個別のアッセイ）にて TaqMan® Gene Expression
• ［Individual Assays］
Assays を選択します。このオプションを選択すると、FAM 色素ラベル化
プローブを含む TaqMan Endogenous Control Assays をはじめとして、全
TaqMan Gene Expression Assays へリンクされます。
または
• ［Individual Control Assays］（個別のコントロールアッセイ）にて
「TaqMan® Endogenous Control Assays」を選択します。このオプショ
ンを選択すると、個別の TaqMan Endogenous Control Assays（FAM 色素
ラベル化 TaqMan MGB プローブ、VIC 色素ラベル化 TaqMan MGB プ
ローブ、または TAMRA 色素ラベル化プローブを含む）へリンクされます。
『Using TaqMan®
• Custom TaqMan Endogenous Control Assays についての情報は、
Endogenous Control Assays to Select an Endogenous Control for Experimental
Studies Application Note』をご参照ください。
• TaqMan Gene Expression Assays を使って PCR 反応を調製する方法については、
『TaqMan® Gene Expression Assays Protocol』をご参照ください。
Custom TaqMan® Gene Expression Assays
製品の説明
Custom TaqMan® Gene Expression Assays は、TaqMan プローブとプライマーのセット
で、お客様から提示のあった配列情報に基づいて Custom TaqMan® Genomic Assays
サービスが設計、合成、調製したものです。Custom TaqMan Gene Expression Assays
を使うと、どのような生物の遺伝子やスプライシング変異でも有無実験を実施できます。
このアッセイには、次の特徴があります。
• TaqMan® 試薬を用いて cDNA サンプル中のターゲットを増幅し、検出します。
• 独自のアッセイ設計ソフトウェアを用いて開発されています。
• Applied Biosystems TaqMan® マスターミックスを用いて、広範なサーマルサイク
リング条件により、最適な性能を発揮するように設計されています。
製品の必要条件
Custom TaqMan Gene Expression Assays には、以下が必要です。
• ターゲット配列に関する提出用ファイル。無償の File Builder ソフトウェアを使用
して提出用ファイルを作成し、Custom TaqMan® Genomic Assays サービスに当該
ファイルを提示してください。
• 次の 3 コンポーネント：
– ウェル当たりの cDNA サンプル（RNA から変換）量は 1 ～ 100 ng で、各測定
ウェル中の cDNA 量は同じ。
– 20✕ Gene Expression Assay または 60✕ Gene Expression Assay（各ターゲット
に特異的）。各アッセイは、調製済み 20✕ または 60✕ ミックス中に、2 種類の
ターゲット特異的プライマーと FAM™ 色素ラベル TaqMan MGB プローブを含
みます。1✕ の最終濃度は、プローブが 250 nM、各プライマーは 900 nM です。
5-12
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
第 5 章 有無実験
– TaqMan® Gene Expression Master Mix または TaqMan Universal PCR Master
Mix（with または without AmpErase UNG）。
詳細について
• 最新の製品および各製品の使用方法については、Applied Biosystems ウェブサイト
をご覧ください：
http://www.appliedbiosystems.com/
（TaqMan® 製品）から、
［TaqMan® Gene
a. ホームページの［TaqMan® Products］
Expression Assays］を選択します。
b. ［Gene Expression Assays & Arrays］ページの［Individual Assays］（個別の
アッセイ）で［TaqMan® Gene Expression Assays］を選択します。
『Custom TaqMan®
• Custom TaqMan Gene Expression Assays の注文方法については、
Genomic Assays Protocol: Submission Guidelines』をご参照ください。
• Custom TaqMan Gene Expression Assays を使って PCR 反応を調製する方法につ
いては、
『Custom TaqMan® Gene Expression Assays Protocol』をご参照ください。
TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents
製品の説明
Applied Biosystems TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents には、以
下が含まれます。
• 設計済みのプライマーとプローブを含む内在性ポジティブコントロール（IPC）
• IPC DNA テンプレート
• IPC 遮断コントロール
試薬は、以下の作用を示すように設計されています。
• 陰性結果のタイプを区別します。
– ターゲットが陰性で、IPC が陽性の場合、ターゲットは存在していません。
– ターゲットが陰性で、IPC も陰性の場合、PCR の抑制が起こっていることを示
します。
• 内在性コントロールの増幅が起こらないようにします。
• ターゲットの増幅を低下することなく、IPC とターゲットの共増幅を可能にします。
• VIC® 色素ラベルプローブにより IPC を検出します。
• FAM™ 色素ラベルプローブによりターゲットを検出します。
• 広範なサーマルサイクリング条件で、TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix
（with または without AmpErase® UNG）を用います。
製品の必要条件
TaqMan Exogenous Internal Positive Control Reagents Kit には、次のコンポーネントが
必要です。
• DNA サンプル
• 目的のターゲット用 TaqMan アッセイ
• TaqMan 2✕ Universal PCR Master Mix（with または without AmpErase UNG）
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
5-13
第 5 章 有無実験
利用可能なキット
Applied Biosystems から、以下の TaqMan Exogenous Internal Positive Control Reagent
Kit が発売されています。
キット
部品番号
TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents with TaqMan® 2✕
Universal PCR Master Mix (with VIC® dye)
4308320
TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents
4308323
®
参考：このキットを使っている場合は、次の TaqMan 試薬のいずれかを別途
購入する必要があります。
• TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix (PN 4304437)
• TaqMan® PCR Core Reagents Kit (PN N808-0228)
重要！ 上記のキットには、TAMRA™ 色素ラベル化プローブが含まれていますが、
Applied Biosystems は、TAMRA 色素をレポーターやクエンチャーとして StepOne シ
ステムで使うことはお勧めしません。当該キットは、StepOnePlus システムで使用でき
ます。TAMRA 色素は、StepOnePlus システムでレポーターやクエンチャーとして使え
ます。
詳細について
TaqMan Exogenous Internal Positive Control Reagent を使って PCR 反応を調製する方
法については、
『TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents Protocol』を
ご参照ください。
5-14
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
第 5 章 有無実験
マスターミックスの選択
利用可能な
マスターミックス
有無実験用の Applied Biosystems の Inventoried/Made to Order アッセイは、以下のマ
スターミックスを用いるように設計されています。
マスターミックス
部品番号
TaqMan® Gene Expression Master Mix、1-Pack（1 × 5 mL）、200 反応
4369016
TaqMan® Gene Expression Master Mix、10-Pack（10 × 5 mL）、2000 反応
4369542
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、200 反応
4304437
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、2000 反応
4326708
10-Pack、TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix
4305719
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、No AmpErase® UNG、200 反応
4324018
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、No AmpErase® UNG、2000 反応
4326614
10-Pack、TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、No AmpErase® UNG
4324020
TaqMan® PCR Core Reagents Kit
N808-0228
参 考： TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents with TaqMan® 2✕
Universal PCR Master Mix kit（PN 4308320）を購入になる場合は、マスターミックス
を別途購入する必要はありません。
参考： 有無実験では、Fast または SYBR® Green マスターミックスやプロトコルは使用
できません。
詳細について
TaqMan 試薬の使用に関しては、以下をご参照ください。
• TaqMan® Gene Expression Master Mix Protocol
• TaqMan® Universal PCR Master Mix Protocol
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
5-15
第 5 章 有無実験
実験の設計
StepOne ソフト
ウェアの使用
Applied Biosystems の Inventoried/Made to Order アッセイは、StepOne ソフトウェア
を用いて有無実験の設計を行います。StepOne ソフトウェアは、自動的に以下の量を計
算します。
• 反応ミックスコンポーネント
• コントロールとサンプル
• サンプル希釈液
参考： StepOne ソフトウェアで Inventoried/Made to Order アッセイタイプを選択するに
は、
［Design Wizard］
（設計ウィザード）または［Advanced Setup］
（高度なセットアッ
プ）で［Reaction Setup］
（反応セットアップ）画面を開き、
［Assay Type］
（アッセイタ
（在庫／注文生産）
イプ）ドロップダウンメニューから［Inventoried/Made to Order］
を選択します。
詳細について
『Applied
StepOne および StepOnePlusシステムによる有無実験の設計と実施については、
Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 有無実験入門ガイ
ド』をご参照ください。
カスタムアッセイ
ワークフロー
StepOne™ ソフトウェアで有無実験にカスタムアッセイを選択する場合には（すなわち、
独自にプライマーとプローブを設計する場合には）、Applied Biosystems のアッセイ設
計ガイドラインのワークフローに従うことをお勧めします。
1. Primer Express® Software を使って、プライマーとプローブを設計します（3-21
ページ）
。
2. 適切な試薬を選択します（3-24 ページ）。
重要！ Applied Biosystems は、
TAMRA™ 色素をレポーターやクエンチャーとして
StepOne システムで使うことはお勧めしません。TAMRA 色素は、StepOnePlus シ
ステムでレポーターやクエンチャーとして使えます。
有無実験では、Fast または SYBR® Green マスターミックスやプロトコルは使用で
きません。
3. 推奨されたサーマルサイクリング条件を用います（3-27 ページ）。
4. デフォルト設定のプライマーおよびプローブ濃度で開始します。必要に応じて、プ
ライマー濃度（3-30 ページ）およびプローブ濃度（3-33 ページ）を最適化します。
重要！ これらの手順に完全に従うと、本システムで迅速にアッセイを設計、最適化でき、
信頼性の高い結果が得られます。実験が高いレベルで成功するために、本システムを包
括的にご利用ください。Applied Biosystems のアッセイ設計ガイドラインの詳細につい
ては、付録 C をご覧ください。
参考： StepOne ソフトウェアで［Custom］
（カスタム）アッセイタイプを選択するには、
（高度なセットアップ）
［Design Wizard］（設計ウィザード）または［Advanced Setup］
から［Reaction Setup］
（反応セットアップ）画面を開き、
［Assay Type］
（アッセイタイ
（カスタム）を選択します。
プ）ドロップダウンメニューで［Custom］
5-16
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
計算式
A
A
本付録の内容：
標準曲線法を用いた標準偏差の計算 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A-2
比較法を用いた標準偏差の計算 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A-5
比較 CT（∆∆CT）実験用計算式 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A-7
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
A-1
付録 A 計算式
標準曲線法を用いた標準偏差の計算
具体例
サンプルとリファレンスサンプルの比較
ノーマライズ済みターゲット量（下表の c-mycN）は、単位がない数値で、異なるサンプ
ル中に含まれるターゲットの相対量を比較するために用いることができます。この比較
を行う一つの方法は、サンプルの一つをリファレンスサンプルに指定することです。下
表では、脳をリファレンスサンプルとして指定しています。脳は、ターゲットの発現レ
ベルが最も低かったため、恣意的に選択しました。
相対標準曲線実験結果
下表の各 c-mycN 値を脳の c-mycN 値で割って、最終列の数値が得られます。この結果に
より、腎臓サンプルは脳サンプルと比較して、c-myc mRNA の量が 5.5× 、肝臓では
34.2× 、肺では 15.7× であることが分かります。
相対値を決定するためには、以下のステップを行います。
1. 下表より c-myc および GAPDH の平均値を出します。
2. c-myc の平均値を GAPDH の平均値で割ります。
3. リファレンスサンプルを指定します。
4. サンプルの平均値をリファレンスサンプルの平均値で割ります。
総 c-myc Raji RNA 量
（ng）
総 GAPDH Raji RNA 量
（ng）
0.033
0.51
0.043
0.56
0.036
0.59
0.043
0.53
0.039
0.51
0.040
0.52
平均
0.039±0.004
0.54±0.034
腎臓
0.40
0.96
0.41
1.06
0.41
1.05
0.39
1.07
0.42
1.06
0.43
0.96
0.41±0.016
1.02±0.052
組織
脳
平均
A-2
c-mycN
（GAPDH に対し
ノーマライズ）‡
c-mycN
（脳に対する相対値）§
0.07±0.008
1.0±0.12
0.40±0.025
5.5±0.35
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
付録 A 計算式
組織
肝臓
平均
肺
平均
総 c-myc Raji RNA 量
（ng）
総 GAPDH Raji RNA 量
（ng）
0.67
0.29
0.66
0.28
0.70
0.28
0.76
0.29
0.70
0.26
0.68
0.27
0.70±0.036
0.28±0.013
0.97
0.82
0.92
0.88
0.86
0.78
0.89
0.77
0.94
0.79
0.97
0.80
0.93±0.044
0.81±0.041
c-mycN
（GAPDH に対し
ノーマライズ）‡
c-mycN
（脳に対する相対値）§
2.49±0.173
34.2±2.37
1.15±0.079
15.7±1.09
‡ c-mycN 値は、
c-myc の平均値を GAPDH の平均値で割って求めます。商の標準偏差は、c-myc および GAPDH 値の標準偏差から計算しま
す。「計算式」（A-4 ページ）をご参照ください。
§ 脳に対する c-mycN の相対値を計算するには、リファレンスサンプル値による割り算を行います。この割り算は、任意定数による割り
算なので、この結果の cv は c-mycN の cv と同じです。
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
A-3
付録 A 計算式
計算式
c-mycN 値は、c-myc の平均値を GAPDH の平均値で割って求めます。商の標準偏差は、
次の式により、c-myc および GAPDH 値の標準偏差から計算します。
cv =
2
cv 1 + cv 22
ここで、
stddev
cv = --s- = ---------------------------meanvalue
X
例として、A-2 ページにある表の脳サンプルを使うと、
cv 1 = 0.004
------------0.039
および
0.034
cv 2 = ------------0.54
2
cv =
2
⎛ 0.004
-------------⎞ + ⎛ 0.034
-------------⎞ = 0.12
⎝ 0.039⎠
⎝ 0.54 ⎠
次の関係が成立するので、
cv = --sX
s = ( cv ) ( X )
s = ( 0.12 ) ( 0.07 )
s = 0.008
A-4
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
付録 A 計算式
比較法を用いた標準偏差の計算
具体例
A-2 ページの表に示す c-myc および GAPDH mRNA 量を求めるために用いた CT デー
タを使って、∆∆CT の計算方法を説明します。下表に、ヒトの脳、腎臓、肝臓および肺サ
ンプルによる CT 平均値を示すとともに、これらの CT 値を用いて ∆CT、∆∆CT および cmyc mRNA の相対量を決定する方法を示します。これらの結果は、標準曲線法により求
めた c-myc の相対量にほぼ合致します。
c-myc の
CT 平均値
GAPDH の
CT 平均値
∆CT
c-myc–GAPDH‡
∆∆CT
∆CT–∆CT, 脳 §
c-mycN
（脳に対する相対値）#
脳
30.49±0.15
23.63±0.09
6.86±0.17
0.00±0.17
1.0
(0.9–1.1)
腎臓
27.03±0.06
22.66±0.08
4.37±0.10
–2.50±0.10
5.6
(5.3–6.0)
肝臓
26.25±0.07
24.60±0.07
1.65±0.10
–5.21±0.10
37.0
(34.5–39.7)
肺
25.83±0.07
23.01±0.07
2.81±0.10
–4.05±0.10
16.5
(15.4–17.7)
組織
‡ ∆CT 値は、GAPDH の CT 平均値を c-myc の CT 平均値から差し引いて求めます。差の標準偏差は、c-myc および GAPDH 値の標準偏
差から計算します。
「計算式」
（A-6 ページ）をご参照ください。
§ ∆∆CT の計算には、リファレンスサンプルの ∆CT 値による引き算が含まれます。この引き算は、任意定数による引き算なので、∆∆CT
の標準偏差は、∆CT 値の標準偏差と同じです。
# 脳に対する c-mycN の範囲は、2 –∆∆CT に ∆∆CT + s および ∆∆CT – s を代入して求めることができます。ここで、s は、∆∆CT 値の標準
偏差です。
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
A-5
付録 A 計算式
計算式
∆CΤ 値は、GAPDH の CT 平均値を c-myc の CT 平均値から差し引いて求めます。差の標
準偏差は、次の式により、c-myc および GAPDH 値の標準偏差から計算します。
2
s =
2
s1 + s2
ここで、
s は標準偏差です。
例として、A-5 ページの表にある脳サンプルを使うと、
s 1 = 0.15
および
s 2 = 0.09
s=
A-6
2
2
( 0.15 ) + ( 0.09 ) = 0.17
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付録 A 計算式
比較 CT（∆∆CT）実験用計算式
計算式
内在性コントロールに対してノーマライズしたターゲット量のリファレンスサンプル量
に対する相対比率は、以下により計算されます。
2 –∆∆CT
計算式の導出
PCR の指数関数的増幅を示す式は、
Xn = Xo × ( 1 + EX )n
ここで、
• xn = n サイクルにおけるターゲット分子数
• xo = 最初のターゲット分子の数
• Ex = ターゲット増幅効率
• n = サイクル数
• Xo = 最初のターゲット分子の数
threshold cycle（CT）は、増幅したターゲット量が特定の閾値に達するサイクル数です。
よって、
X T = X o × ( 1 + E X ) CT, X = K X
ここで、
• xT = ターゲット分子の閾値数
• CT, X = ターゲット増幅の threshold cycle
• KX = 定数
内在性コントロール反応に対しても同じようにして、
R T = R o × ( 1 + E R ) CT, R = K R
ここで、
• RT = リファレンス分子の閾値数
• Ro = 最初のリファレンス分子の数
• ER = リファレンス増幅効率
• CT, R = リファレンス増幅の threshold cycle
• KR = 定数
XT を RT で割ると、次の式が得られます。
C
X o × ( 1 + E X ) T, X K X
X
- = ------ = K
-----T- = ----------------------------------------C
RT
R o × ( 1 + E R ) T, R K R
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A-7
付録 A 計算式
XT および RT の正確な値は、以下の要素によって変わります。
• プローブに使用したレポーター色素
• 配列がプローブの蛍光特性に及ぼす影響
• プローブの開裂効率
• プローブの純度
• 蛍光の閾値の設定
そのため、定数 K は 1 であるとは限りません。
ターゲットとリファレンスとで増幅効率が等しいと仮定すると、
EX = ER = E
C
–C
Xo
----- × ( 1 + E ) T, X T, R= K
Ro
すなわち、
XN × ( 1 + E )
∆C T
=K
ここで、
• XN = XO/RO（ノーマライズしたターゲット量）
• ∆CT = CT, X – CT, R（ターゲットとリファレンスの threshold cycle 数の差）
上式を変換すると、次の式が得られます。
XN = K × ( 1 + E )
– ∆C T
最後に、サンプル（q）に対する XN をリファレンスサンプル（cb）に対する XN で割ると、
– ∆C
X N, q
K × ( 1 + E ) T, q == ( 1 + E ) –∆∆CT
------------ = ------------------------------------------– ∆C
X N, cb
K × ( 1 + E ) T, cb
ここで、
• ∆∆CT = ∆CT, q – ∆CT, cb
Applied Biosystems のアッセイ設計ガイドラインに従って設計、最適化を行ったアンプ
リコン（サイズ <150 bp）では、増幅効率がほぼ 1 となります。それゆえ、内在性コン
トロールに対してノーマライズしたターゲット量のリファレンスサンプル量に対する相
対比率は、次の式で表されることになります。
2 –∆∆CT
A-8
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
マルチプレックス PCR における
プライマーの制限
B
B
正確なマルチプレックスアッセイを行うためには、ある種類の増幅が他の増幅を大きく
超えないことが重要になります。そうでないと、量の多い種類の増幅によって、量の少
ない種類の増幅がうまく起こらなくなります。量の少ない種類が効率よく増幅しない場
合、実験が不正確な結果となります。また、極端な場合には、量の少ない種類が全く検
出されないこともあります。このような状況を防ぐには、量の多い種類を増幅するプラ
イマー濃度を制限して、CT に到達後に増幅を停止することが必要となります。
プライマーの制限によって、両方のアッセイに共通する反応コンポーネントを使い切る
ことがないので、量の少ない種類が効率よく増幅できます。量の多い種類が不明な場合
には、マルチプレックス PCR を行う前に、両ターゲットを別のチューブに入れて測定し
て、量の多い種類を特定する必要があります。いずれの種類も一貫して量が多いわけで
はない場合には、両方の増幅に対してプライマーの制限を行うべきです。
ターゲットおよび
リファレンスの
相対量に関する検討
ターゲットおよび内在性コントロールの増幅に対してプライマー制限を行う場合には、
両種の相対量を考慮しなければなりません。定量実験では、rRNA を内在性コントロー
ルとして使用することができます。全 RNA 中の rRNA 濃度は、ターゲット mRNA 濃度
よりも常に高いので、ターゲットと rRNA の両方を増幅するマルチプレックス反応では、
rRNA プライマーの濃度だけを制限する必要があります。
プライマー制限
マトリックス
プライマー制限濃度を決定するため、テンプレートの初期量を最小にして、フォワード
プライマーおよびリバースプライマー濃度の組み合わせ（マトリックス）により測定を
行います。その目的は、CT 値に影響を及ぼすことなく、アッセイの ∆Rn 値を低下させ
るプライマー濃度を特定することです。以下の表に、フォワードプライマーおよびリバー
スプライマー濃度を 20から 100 nMまで変化させた推奨組み合わせパターンを示します。
参考： 設計基準に従うことによって、プライマー制限濃度を見つけやすくなりますが、
アッセイによっては見つからない場合もあります。プライマー制限マトリックス実験に
よってプライマー制限濃度を決定できない場合には、プライマーを少なくとも 1 つ再設
計するか、別のチューブで反応を測定することが必要となります。
フォワードプライマー：
リバースプライマー：
100 nM
100 nM
100 nM
80 nM
100 nM
60 nM
100 nM
40 nM
100 nM
20 nM
フォワードプライマー：
リバースプライマー：
80 nM
100 nM
80 nM
80 nM
80 nM
60 nM
80 nM
40 nM
80 nM
20 nM
フォワードプライマー：
リバースプライマー：
60 nM
100 nM
60 nM
80 nM
60 nM
60 nM
60 nM
40 nM
60 nM
20 nM
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
B-1
付録 B
マルチプレックス PCR におけるプライマーの制限
フォワードプライマー：
リバースプライマー：
100 nM
100 nM
100 nM
80 nM
100 nM
60 nM
100 nM
40 nM
100 nM
20 nM
フォワードプライマー：
リバースプライマー：
40 nM
100 nM
40 nM
80 nM
40 nM
60 nM
40 nM
40 nM
40 nM
20 nM
フォワードプライマー：
リバースプライマー：
20 nM
100 nM
20 nM
80 nM
20 nM
60 nM
20 nM
40 nM
20 nM
20 nM
具体例
プライマー制限マトリックス実験結果を図 B-1（B-3 ページ）に示します。
• 図 B-1a では、プライマー濃度を約 50 nM 以下にした場合にのみ、CT 値に影響が
見られます。プラトー領域は、適切なプライマー制限濃度を見つけることができる
領域です。この領域では、CT 値（およびそれに対応する定量値）は変化しません
が、∆Rn 値とそれに対応した生成物の収率は大きく低下します。
• 図 B-1b は、プライマー濃度と ∆Rn 値との対応関係を示します。図から、フォワー
ドプライマーおよびリバースプライマー濃度を減少することによって、生成物の収
率が低下することが分かります。
この例では、プライマー制限濃度として、フォワードプライマーおよびリバースプライ
マー濃度を 50 nM 以上とすることが適当です。強い発生信号によってソフトウェアがマ
ルチコンポーネンティングを正確に行えるようアッセイがプライマー制限をしている場
合でも、プローブ濃度は最適レベルに保つことが必要です。
B-2
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
付録 B
マルチプレックス PCR におけるプライマーの制限
図 B-1 プライマー制限マトリックス実験の結果
(a) は、フォワードプライマーおよびリバースプライマー濃度によって CT 値が変化する
様子を示します。図示したプラトー領域は、CT 値が一定になる領域です。
(b) は、∆Rn 値がプライマー濃度の減少により低下する様子を示します。
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
B-3
付録 B
B-4
マルチプレックス PCR におけるプライマーの制限
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
アッセイ設計ガイドライン
アッセイ設計ガイド
ラインについて
C
C
独自にアッセイ（プライマーとプローブ）を設計する際には、Applied Biosystems の
アッセイ設計ガイドラインに従うことをお勧めします。アッセイ設計ガイドラインに
よって、以下のことが可能となります。
1. Primer Express® Software を用いたプライマーとプローブの設計 － Primer Express
Software は、デフォルト設定のパラメータを用いて、自動的にプライマーとプロー
ブのセットを選びます。
2. 適切な試薬の選択 － 数種類の TaqMan® および SYBR® Green試薬が利用可能です。
使用する試薬は、アッセイタイプに応じて変わります。
3. 推奨サーマルサイクリング条件の使用 － サンプル（DNA/cDNA、1 ステップ PCR
用 RNA、2 ステップ PCR 用 RNA）に対して推奨されるサーマルサイクリング条
件を使用します。
参考： Fast 試薬用のサーマルサイクリング条件は、標準試薬用のサーマルサイクリ
ング条件と異なります。
4. デフォルト設定によるプライマーとプローブ濃度の使用またはプライマーとプ
ローブ濃度の最適化 － Applied Biosystems のアッセイ設計ガイドラインを使用す
ると、デフォルト設定による非マルチプレックス最適化アッセイ用プライマーとプ
ローブ濃度を使用したり、プライマーとプローブ濃度を最適化することができま
す。
重要！ これらの手順に完全に従うと、本システムで迅速にアッセイを設計、最適化でき、
信頼性の高い結果が得られます。実験が高いレベルで成功するために、本システムを包
括的にご利用ください。
参考： Applied Biosystems のアッセイ設計ガイドラインに従った場合でも、すべての
アッセイで同じレベルの性能と感度が保証されるわけではありません。最も綿密に設定
された設計パラメータであっても、異なる 2 アッセイシステム間の違いに対応できない
場合があります。
定量実験の総括
一般論として、定量実験にアッセイ設計ガイドラインを使用する場合には、次のように
総括できます。
• TaqMan アッセイでは、DNA または cDNA をテンプレートに使用する際、プライ
マー濃度を 900nM、プローブ濃度を 250nM とすると、ほとんどの場合に再現性の
ある高感度のアッセイが行えます。
• SYBR® Green I Dye は、検出反応が非特異的なので、最適化を行わない場合には
注意が必要です。しかし、ガイドラインに完全に準拠し、DNA または cDNA をテ
ンプレートに使用する際には、フォワードプライマーおよびリバースプライマー濃
度をそれぞれ 50nM とすると、特異性が高く、強い増幅が行われます。融解曲線ま
たはゲル解析を使って、非特異的生成物の形成をチェックして、この確認を行って
ください。
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
C-1
付録 C アッセイ設計ガイドライン
• TaqMan アッセイでは、ほとんどの場合にターゲット数が 50 コピー未満でも正確
に検出、定量ができ、更に高い感度も可能です。
• SYBR Green 試薬も性能は同等ですが、非特異的生成物が形成することによって、
検出限界が上昇する可能性があります。
ジェノタイピング
実験の総括
一般論として、ジェノタイピング実験にアッセイ設計ガイドラインを使用する場合には、
次のように総括できます。
プライマー濃度を 900nM、プローブ濃度を 200nM、ゲノム DNA 量を 1 から 20ng とす
ることによって、再現性があり感度が高いアッセイ結果が得られます。
C-2
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
試薬部品番号
D
D
本付録の内容：
定量実験 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . D-2
ジェノタイピング実験 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . D-5
有無実験 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . D-7
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
D-1
付録 D 試薬部品番号
定量実験
Inventoried/Made to Order（在庫／注文生産）アッセイ
アッセイ
製品
部品番号
TaqMan® Gene Expression Assays
TaqMan® Endogenous Control Assays
参考：FAM™ 色素ラベル化 TaqMan® Endogenous
Control Assays は、Inventoried TaqMan Gene
Expression Assays として含まれています。
最新の製品および各製品の使用方法に
ついては、Applied Biosystems ウェブサ
イトをご覧ください：
http://www.appliedbiosystems.com/
Custom TaqMan® Gene Expression Assays
マスターミックス
マスターミックス
部品番号
TaqMan® Gene Expression Master Mix、1-Pack（1 × 5 mL）、200 反応
4369016
TaqMan® Gene Expression Master Mix、10-Pack（10 × 5 mL）、2000 反応
4369542
TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix（2✕）、No AmpErase® UNG、
250 反応
4352042
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、200 反応
4304437
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、2000 反応
4326708
10-Pack、TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix
4305719
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、No AmpErase® UNG、200 反応
4324018
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、No AmpErase® UNG、2000 反応
4326614
10-Pack、TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、No AmpErase® UNG
4324020
カスタムアッセイ
アッセイ
製品
カスタム TaqMan® プローブとプライマー
部品番号
最新の製品および各製品の使用方法に
ついては、Applied Biosystems ウェブサ
イトをご覧ください：
http://www.appliedbiosystems.com/
D-2
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
付録 D 試薬部品番号
DNA または
cDNA の定量
試薬
TaqMan® 試薬
キット
TaqMan® Gene Expression Master Mix, 1-Pack
（1 × 5 mL）、200 反応
4369016
TaqMan® Gene Expression Master Mix、10-Pack
（10 × 5 mL）、2000 反応
4369542
TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix（2✕）、
No AmpErase® UNG、250 反応
4352042
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、200 反応
4304437
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、2000 反応
4326708
10-Pack、TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix
4305719
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、
No AmpErase® UNG、200 反応
4324018
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、
No AmpErase® UNG、2000 反応
4326614
10-Pack、TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、
No AmpErase® UNG
4324020
TaqMan® PCR Core Reagents Kit、200 反応
SYBR® Green 試薬
部品番号
N808-0228
Power SYBR® Green PCR Master Mix (1 mL)、
40 反応
4368577
Power SYBR® Green PCR Master Mix (5 mL)、
200 反応
4367659
Power SYBR® Green PCR Master Mix
（10 × 5 mL)、2000 反応
4368708
Power SYBR® Green PCR Master Mix（50 mL）、
2000 反応
4367660
SYBR® Green PCR Master Mix（1 mL）40 反応
4344463
SYBR® Green PCR Master Mix（5 mL）、200 反応
4309155
SYBR® Green PCR Master Mix（50 mL）、
2000 反応
4334973
SYBR® Green PCR Core Reagents、200 反応
4304886
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
D-3
付録 D 試薬部品番号
1 ステップ RT-PCR
を用いる RNA 定量
試薬
TaqMan® 試薬
キット
部品番号
TaqMan® One-Step RT-PCR Master Mix Reagents
Kit
4309169
TaqMan® EZ RT-PCR Core Reagents
参考：高温 RT ステップが必要な場合には、TaqMan
EZ RT-PCR Core Reagents を使用してください。
SYBR® Green 試薬
2 ステップ RT-PCR
を用いる RNA 定量
試薬
TaqMan®
試薬
Power SYBR® Green RT-PCR Reagents Kit
4368711
SYBR® Green RT-PCR Reagents
4310179
ステップ
部品番号
4369016
TaqMan® Gene Expression Master
Mix、10-Pack（10 × 5 mL）、2000 反
応
4369542
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master
Mix
4304437
TaqMan® Fast Universal PCR Master
Mix（2✕）、No AmpErase® UNG
4352042
High-Capacity cDNA Reverse
Transcription Kit
4374966
TaqMan® Reverse Transcription
Reagents
N808-234
RT ステップと
PCR ステップの
両方
TaqMan® Gold RT PCR Kit
N808-232
PCR ステップ
のみ
Power SYBR® Green PCR Master Mix
4367659
SYBR® Green PCR Master Mix
4309155
High-Capacity cDNA Reverse
Transcription Kit
4374966
TaqMan® Reverse Transcription
Reagents
N808-234
Power SYBR® Green RT-PCR
Reagents Kit
4368711
SYBR® Green RT-PCR Reagents
4310179
RT ステップ
のみ
RT ステップと
PCR ステップの
両方
D-4
キット
TaqMan® Gene Expression Master
Mix、1-Pack（1 × 5 mL）、200 反応
PCR ステップ
のみ
RT ステップ
のみ
SYBR® Green
試薬
N808-0236
®
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
付録 D 試薬部品番号
ジェノタイピング実験
設計済み／検証済みアッセイ
アッセイ
製品
部品番号
TaqMan® SNP Genotyping Assays
®
TaqMan Drug Metabolism Genotyping Assays
Pre-Developed TaqMan® Assay Reagents for Allelic
Discrimination
マスターミックス
最新の製品および各製品の使用方法に
ついては、Applied Biosystems ウェブサ
イトをご覧ください：
http://www.appliedbiosystems.com/
マスターミックス
部品番号
TaqMan® Genotyping Master Mix、1-Pack（1 × 10 mL）、400 反応
4371355
TaqMan® Genotyping Master Mix、1 Bulk Pack（1 × 50 mL）、2000 反応
4371357
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、200 反応
4304437
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、2000 反応
4326708
10-Pack、TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix
4305719
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、No AmpErase® UNG、200 反応
4324018
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、No AmpErase® UNG、2000 反応
4326614
10-Pack、TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、No AmpErase® UNG
4324020
参考： ジェノタイピング実験では、Fast または SYBR® Green マスターミックスやプロ
トコルは使用できません。
カスタムアッセイ
アッセイ
製品
Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays
部品番号
最新の製品および各製品の使用方法に
ついては、Applied Biosystems ウェブサ
イトをご覧ください：
http://www.appliedbiosystems.com/
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
D-5
付録 D 試薬部品番号
マスターミックス
マスターミックス
部品番号
TaqMan® Genotyping Master Mix、1-Pack（1 × 10 mL）、400 反応
4371355
TaqMan® Genotyping Master Mix、1 Bulk Pack（1 × 50 mL）、2000 反応
4371357
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、200 反応
4304437
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、2000 反応
4326708
10-Pack、TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix
4305719
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、No AmpErase® UNG、200 反応
4324018
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、No AmpErase® UNG、2000 反応
4326614
10-Pack、TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、No AmpErase® UNG
4324020
参考： ジェノタイピング実験では、Fast または SYBR® Green マスターミックスやプロ
トコルは使用できません。
D-6
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
付録 D 試薬部品番号
有無実験
Inventoried/Made to Order（在庫／注文生産）アッセイ
アッセイ
製品
部品番号
TaqMan® Gene Expression Assays
最新の製品および各製品の使用方法に
ついては、Applied Biosystems ウェブサ
イトをご覧ください：
TaqMan® Endogenous Control Assays
参考：FAM™ 色素ラベル化 TaqMan® Endogenous
Control Assays は、Inventoried TaqMan Gene
Expression Assays として含まれています。
http://www.appliedbiosystems.com/
Custom TaqMan® Gene Expression Assays
TaqMan
Exogenous IPC
試薬
キット
部品番号
TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents with TaqMan® 2✕
Universal PCR Master Mix（with VIC® dye）
4308320
TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents
4308323
参考：このキットを使っている場合は、次の
購入する必要があります。
TaqMan®
試薬のいずれかを別途
• TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix（PN 4304437）
• TaqMan® PCR Core Reagents Kit（PN N808-0228）
重要！ 上記のキットには、TAMRA™ 色素ラベル化プローブが含まれていますが、
Applied Biosystems は、TAMRA 色素をレポーターやクエンチャーとして StepOne シ
ステムで使うことはお勧めしません。当該キットは、StepOnePlus システムで使用でき
ます。TAMRA 色素は、StepOnePlus システムでレポーターやクエンチャーとして使え
ます。
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
D-7
付録 D 試薬部品番号
マスターミックス
マスターミックス
部品番号
TaqMan® Gene Expression Master Mix、1-Pack（1 × 5 mL）、200 反応
4369016
TaqMan® Gene Expression Master Mix、10-Pack（10 × 5 mL）、2000 反応
4369542
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、200 反応
4304437
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、2000 反応
4326708
10-Pack、TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix
4305719
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、No AmpErase® UNG、200 反応
4324018
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、No AmpErase® UNG、2000 反応
4326614
10-Pack、TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、No AmpErase® UNG
4324020
TaqMan® PCR Core Reagents Kit
N808-0228
参 考： TaqMan® Exogenous Internal Positive Control Reagents with TaqMan® 2✕
Universal PCR Master Mix kit（PN 4308320）を購入になる場合は、マスターミックス
を別途購入する必要はありません。
参考： 有無実験では、Fast または SYBR® Green マスターミックスやプロトコルは使用
できません。
カスタムアッセイ
アッセイ
製品
カスタム TaqMan® プローブとプライマー
部品番号
最新の製品および各製品の使用方法に
ついては、Applied Biosystems ウェブサ
イトをご覧ください：
http://www.appliedbiosystems.com/
D-8
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
付録 D 試薬部品番号
DNA または
cDNA の定量
キット
部品番号
TaqMan® Gene Expression Master Mix、1-Pack（1 × 5 mL）、200 反応
4369016
TaqMan® Gene Expression Master Mix、10-Pack（10 × 5 mL）、2000 反応
4369542
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、200 反応
4304437
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、2000 反応
4326708
10-Pack、TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix
4305719
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、No AmpErase® UNG、200 反応
4324018
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、No AmpErase® UNG、2000 反応
4326614
10-Pack、TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix、No AmpErase® UNG
4324020
TaqMan® PCR Core Reagents Kit、200 反応
N808-0228
参考： 有無実験では、Fast または SYBR® Green マスターミックスやプロトコルは使用
できません。
1 ステップ RT-PCR
を用いる RNA 定量
キット
部品番号
TaqMan® One-Step RT-PCR Master Mix Reagents Kit
4309169
TaqMan® EZ RT-PCR Core Reagents
N808-0236
ス テ ップ が 必 要 な 場合 に は、TaqMan®
参 考：高 温 RT
Reagents を使用してください。
EZ RT-PCR Core
参考： 有無実験では、Fast または SYBR® Green マスターミックスやプロトコルは使用
できません。
2 ステップ RT-PCR
を用いる RNA 定量
ステップ
PCR ステップのみ
RT ステップのみ
RT ステップと
PCR ステップの両方
キット
部品番号
TaqMan® Gene Expression Master Mix、
1-Pack （1 × 5 mL）、200 反応
4369016
TaqMan® Gene Expression Master Mix、
10-Pack（10 × 5 mL）、2000 反応
4369542
TaqMan® 2✕ Universal PCR Master Mix
4304437
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit
4374966
TaqMan® Reverse Transcription Reagents
N808-234
TaqMan® Gold RT PCR Kit
N808-232
参考： 有無実験では、Fast または SYBR® Green マスターミックスやプロトコルは使用
できません。
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
D-9
付録 D 試薬部品番号
D-10
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
参考文献
Afonina, I., Zivarts, M., Kutyavin, I., et al. 1997. Efficient priming of PCR with
short oligonucleotides conjugated to a minor groove binder. Nucleic Acids Res.
25:2657–2660.
Förster, V. T. 1948. Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Ann.
Physics (Leipzig) 2:55–75.
Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P.S., and Griffith, R. 1992. Simultaneous
amplification and detection of specific DNA sequences. Biotechnology 10:413–417.
Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G., and Watson, R. 1993. Kinetic PCR:Real time
monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology 11:1026–1030.
Kutyavin, I.V., Lukhtanov, E.A., Gamper, H.B., and Meyer, R.B. 1997.
Oligonucleotides with conjugated dihydropyrroloindole tripeptides: base
composition and backbone effects on hybridization. Nucleic Acids Res.
25:3718–3723.
Kwok, S. and Higuchi, R. 1989. Avoiding false positives with PCR. Nature
339:237–238.
Livak, K.J., and Schmittgen, T.D. 2001. Analysis of Relative Gene Expression Data
Using Real-Time Quantitative PCR and the 2–∆∆CT Method. Methods 25:402–408.
Longo, M.C., Berninger, M.S., and Hartley, J.L. 1990. Use of uracil DNA
glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions. Gene
93:125–128.
Saiki, R.K., Scharf, S., Faloona, F., et al. 1985. Enzymatic amplification of β-globin
genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.
Science 230:1350–1354.
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
参考文献- 1
参考文献
参考文献- 2
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
用語集
StepOne™ ソフトウェアの機能で、実験を自分の実験設計に従ってセットアップできま
（高度なセットアップ） す。Advanced Setup（高度なセットアップ）により、実験の設計やセットアップが自由
Advanced Setup
に行えます。
AIF
Assay ID
（アッセイ ID）
AutoDelta
（オートデルタ）
「アッセイ情報ファイル（AIF）」をご参照ください。
Applied Biosystems が TaqMan® Gene Expression Assay や TaqMan® SNP Genotyping
Assay に割り当てる識別名。
サイクリングステージ内のその後の各サイクルでステップの温度や時間を増減する測定
方法の設定。AutoDelta がサイクリングステージで有効の場合、設定はサーマルプロファ
イル内のアイコンで示されます。
• AutoDelta オン：
• AutoDelta オフ：
CT
「Threshold cycle（CT）
」をご参照ください。
delta Rn（∆Rn）
「ベースライン修正したノーマライズ済み レポーター（∆Rn）
」をご参照ください。
Design Wizard
（設計ウィザード）
実験のセットアップを補助する StepOne™ ソフトウェアの機能で、希望の実験設計を入
力すると、最良の実施法を表示します。
Diluted Sample
［Reaction Setup］
（反応
StepOne™ ソフトウェアでは、このソフトウェアフィールドは、
Concentration
セットアップ）画面の［Sample Dilution Calculations］
（サンプル希釈計算）タブに表
（10✕ for Reaction Mix） 示されます。このフィールドに、すべての実験サンプルについて、反応ミックスに添加
（希釈サンプル濃度（反応 するサンプルの濃度を入力します。“10✕ for Reaction Mix”（反応ミックスでは 10 倍）
は、反応ミックスのサンプルまたはスタンダード成分が 10✕ 濃度であるとソフトウェア
ミックスでは 10 倍））
が仮定することを示します。例えば、希釈サンプル濃度 50.0 ng/µL（10✕）の場合、反
応の最終サンプル濃度は 5 ng/µL（1✕）です。
EFF%
Inventoried アッセイ
「増幅効率（EFF%）
」をご参照ください。
過去に製造され、品質管理仕様に合格し、在庫保管される TaqMan® Gene Expression
Assays および TaqMan® SNP Genotyping Assays。
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
用語集- 1
用語集
IPC
IPC+
有無実験における内在性ポジティブコントロール（IPC）の略語。StepOne™ ソフトウェ
アでは、IPC を含むが IPC 遮断剤を含まないウェル内の IPC ターゲットのタスク。「内
在性ポジティブ コントロール（Internal positive control：IPC）
」をご参照ください。
「ネガティブコントロール IPC ウェル」をご参照ください。
IPC 遮断剤
PCR 反応に添加して内在性ポジティブコントロール（IPC）の増幅をブロックする試薬。
Made-to-order
注文後に製造する TaqMan® Gene Expression Assay または TaqMan® SNP Genotyping
Assay。製造品質管理仕様に合格したアッセイのみ出荷されます。
アッセイ
PCR 後の読み取り
ジェノタイピングおよび有無実験で使用する装置での測定の一部で、増幅後に行われま
す。ジェノタイピング実験では、PCR 後の読み取り時に収集した蛍光データをアレル識
別プロットに表示し、アレルコールに使用します。有無実験では、PCR 後の読み取り時
に収集した蛍光データを有無プロットに表示し、検出コールに使用します。別称「エン
ドポイント読み取り」。
PCR 前の読み取り
ジェノタイピングおよび有無実験で使用する装置での測定の一部で、増幅前に行われま
す。PCR 前の読み取りは、オプションですが、選択することをお勧めします。PCR 前
の読み取りで収集した蛍光データを使用して、PCR 後の読み取りで収集した蛍光データ
をノーマライズすることができます。
Pure Dye
QuickStart
（クイックスタート）
「カスタム色素」および「システム色素」参照。
StepOne™ および StepOnePlus™ システムの機能で、プレートセットアップ情報を入力し
なくても実験を実施できます。QuickStart には、装置の電源がオンであり、装置コン
ピュータ間の接続を変更していないコロケーションレイアウトが必要となります。
R2 値
回帰係数。標準曲線内の回帰直線から計算します。R2 値は、標準曲線回帰直線と、スタ
ンダード反応の各 CT データポイントとのフィットの近似を示します。値が 1.00 なら、
回帰直線とデータポイントとの完全フィットを示します。
refSNP ID
リファレンス SNP（refSNP）クラスタ ID を識別する数字。国立バイオテクノロジー情
報センター（NCBI）にあるヌクレオチド配列変異の一塩基多型データベース（dbSNP）
により作成されます。refSNP ID は、Applied Biosystems Store で Applied Biosystems
SNP Genotyping Assay の検索に使用できます。別称「rs 番号」。
Remote Monitor
StepOne™ ソフトウェアの機能で、StepOne™ または StepOnePlus™ 装置を監視できます。
（遠隔監視）
用語集- 2
遠隔監視により、装置のステータスを監視したり、実験を装置に転送したり、リアルタ
イムで増幅プロットや温度プロットを監視したり、結果をコンピュータにダウンロード
できます。StepOne または StepOnePlus 装置は、
［Remote Monitor］
（遠隔監視）では操
作できません。
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
用語集
Rn
ROX™ 色素
rs 番号
Sample Library
「ノーマライズ済み レポーター（Rn）
」をご参照ください。
Applied Biosystems が製造し、StepOne™ および StepOnePlus™ システムで事前キャリ
ブレーションされている色素。ROX 色素は、パッシブリファレンスとして使用されます。
「refSNP ID」をご参照ください。
StepOne™ ソフトウェアでのサンプルのコレクション。サンプルライブラリには、サンプ
（サンプルライブラリ） ル名とサンプルの色が含まれます。
Sample or Standard
［Reaction Setup］
（反応セッ
StepOne™ ソフトウェアでは、この反応コンポーネントは、
（反応ミックス計算）タブに表示されま
（10✕）（サンプルまたは トアップ）画面の［Reaction Mix Calculations］
スタンダード（10 倍）） す。本ソフトウェアは、反応ミックスへ添加するサンプルまたはスタンダードが 10✕ 濃
度であると仮定します。例えば、反応量 20 µL の場合、1 反応の計算サンプルまたはス
タンダード量は 2 µL です。
SNP
SNP Assay Library
（SNP アッセイライ
「一塩基多型」の略語。SNP は、一塩基の違いや一塩基の挿入や欠失などです。
StepOne™ソフトウェアで、ジェノタイピング実験に追加するSNPアッセイのコレクショ
ン。ライブラリの SNP アッセイには、SNP アッセイ名や SNP アッセイカラーの他、各
ブラリ）
アレルに対してアレル名や塩基、レポーター、クエンチャーおよびアレルカラーが含ま
れます。ライブラリ中の SNP アッセイには、アッセイ ID や SNP アッセイに関するコ
メントを追加することができます。
SNP アッセイ
ジェノタイピング実験で使用する、SNP 増幅用プライマーと、異なるアレルの検出用の
2 プローブを含む PCR 反応。
SYBR® Green 試薬
ターゲット増幅用の 2 つのプライマーと、二本鎖 DNA 検出用 SYBR® Green 色素から
なる PCR 反応コンポーネント。
TaqMan® 試薬
ターゲット増幅用プライマーと、ターゲット増幅検出用 TaqMan® プローブからなる PCR
反応コンポーネント。
Target Library
StepOne™ ソフトウェアで、実験に追加するターゲットのコレクション。ライブラリの
（ターゲットライブラリ） ターゲットには、ターゲット名、レポーター、クエンチャーとサンプルの色が含まれま
す。ライブラリのターゲットには、さらにターゲットに関するコメントを追加すること
ができます。
Threshold cycle
（CT）
Tm
蛍光レベルが増幅プロットの閾値と一致する PCR サイクル数。
「融解温度（Tm）
」をご参照ください。
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
用語集- 3
用語集
VeriFlex™ 技術
StepOnePlus™ 装置には、個別に熱制御可能な VeriFlex™ ブロックが 6 個あり、96 サン
プルウェルに対して温度の異なる 6 つのゾーンを設定できます。StepOne™ ソフトウェア
で VeriFlex ブロックを有効にすると、各 VeriFlex ブロックに異なる温度を設定できるよ
うになります。
y 切片
標準曲線で、回帰直線が y 軸と交わる点。y 切片は、量が 1 のサンプルに対する期待
Threshold cycle（CT）を示します。
アッセイ
StepOne™ および StepOnePlus™ システムにおいて、ターゲット増幅用プライマーと、増
幅したターゲットを検出する試薬を含む PCR 反応ミックス。
アッセイミックス
Applied Biosystems TaqMan® Gene Expression Assay や TaqMan® SNP Genotyping
Assay に含まれる PCR 反応コンポーネント。アッセイミックスには、ターゲット増幅用
プライマーと、ターゲット増幅検出用 TaqMan® プローブが含まれます。
アッセイ情報ファイル
（AIF）
各アッセイのご注文ごとに CD で発送されるデータファイル。ファイル名には、プレー
ト上のバーコード番号が含まれます。AIF 内の情報は、タブ区切りフォーマットで提供
されます。
アレル
あるターゲットで、集団内に見られる異なる複数のシーケンス。
アレル識別プロット
PCR 後の読み取りで収集したデータの表示。アレル識別プロットはアレル 1 プローブか
らのノーマライズ済みレポーター信号を、アレル 2 プローブからのノーマライズ済みレ
ポーター信号に対してプロットしたグラフです。
アンプリコン
PCR で増幅する DNA セグメント。
域外値
あるデータセットで、その他より有意に小さいか大きいデータポイント。
ウェル拒絶
ソフトウェアが解析時に実行し、特定フラッグがウェルに適用された場合に、それらの
ウェルを以後の解析から除外する操作。拒絶したウェルは、拒絶の時点までの結果を示
します。
ウェル削除
再解析前に、1 つ以上のウェルを解析から削除する操作。削除したウェルにはアルゴリ
ズムが適用されないので、削除したウェルの結果は出ません。
エンドポイント
読み取り
温度プロット
「PCR 後の読み取り」をご参照ください。
StepOne™ ソフトウェアによる、StepOne™ または StepOnePlus™ 装置測定時のサンプル、
装置カバー、装置ブロックの温度表示。
回帰係数
用語集- 4
標準曲線での回帰直線からの計算値。R2 値、傾き、y 切片があります。回帰係数を使用
し、スタンダードからの結果品質を評価できます。「標準曲線」も参照。
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
用語集
回帰直線
標準曲線および相対標準曲線実験で、標準曲線の最も良くフィットするライン。回帰直
線の計算式：
CT = m [log (Qty)] + b
m は傾き、b は y 切片、Qty はスタンダード量です。
「回帰係数」をご参照ください。
開始量
解離曲線
カスタム色素
StepOne™ ソフトウェアで標準曲線を設定する際の、最大または最小の量に相当します。
「融解曲線」をご参照ください。
提供元が Applied Biosystems でない色素。StepOne™ および StepOnePlus™ システムで
は、カスタム色素を実験に使用できます。カスタム色素を使用する場合には、そのカス
タム色素を Dye Library に追加し、カスタム Dye キャリブレーションを行う必要があり
ます。
重要！ Applied Biosystems は、TAMRA™ 色素をレポーターやクエンチャーとして
StepOne™ システムで使うことはお勧めしません。TAMRA 色素は、StepOnePlus™ シス
テムでレポーターやクエンチャーとして使えます。
傾き
回帰係数。標準曲線内の回帰直線から計算します。傾きは、アッセイの PCR 増幅効率を
示します。傾きが –3.32 の場合、100% の増幅効率を示します。
「増幅効率（EFF%）
」お
よび「回帰直線」をご参照ください。
希釈液
サンプルやスタンダードを PCR 反応に添加する前の希釈に使用する試薬。希釈液には、
水やバッファーが使われます。
希釈係数
逆転写酵素
キャリブレータ
空間キャリブレーション
「シリアル係数」をご参照ください。
RNA を cDNA に変換する酵素。逆転写酵素の PCR 反応への添加により、1 ステップ
RT-PCR を実施できます。
「リファレンスサンプル」をご参照ください。
StepOne™ および StepOnePlus™ システムのキャリブレーションの 1 タイプで、システム
がサンプルブロック中のウェル位置をマッピングします。空間キャリブレーションの
データによって、ソフトウェアは測定中に、蛍光の増加を反応プレートの特定ウェルに
関連付けできます。
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
用語集- 5
用語集
クエンチャー
TaqMan® プローブの 3′ 末端に結合する分子。これにより、レポーターの蛍光信号放射
は、プローブがインタクトな時は阻止されます。TaqMan® 試薬には、非蛍光クエンチャー
- マイナーグルーブバインダー（NFQ-MGB）をクエンチャーとして使用できます。
SYBR®Green 試薬には、クエンチャーは使用しません。
重要！ Applied Biosystems は、TAMRA™ 色素をレポーターやクエンチャーとして
StepOne™ システムで使うことはお勧めしません。TAMRA 色素は、StepOnePlus™ シス
テムでレポーターやクエンチャーとして使えます。
ケミストリ
「試薬」をご参照ください。
コロケーション
レイアウト
このシステムレイアウトでは、StepOne™またはStepOnePlus™装置を黄色いケーブルで、
近接するコンピュータに直接接続します。このレイアウトでは、近接するコンピュータ
や装置のタッチスクリーンから StepOne™ ソフトウェアによる装置のコントロールがで
きます。
サーマルプロファイル
StepOne™またはStepOnePlus™装置測定のすべてのステップおよびステージにおける温
度、時間、ランプ、データ収集ポイントを指定する測定方法の一部。
サイクリングステージ
サイクル閾値
サンプル
サーマルプロファイル内で繰り返されるステージ。増幅ステージとも呼ばれます。サイ
クリングステージでは、AutoDelta 設定が可能です。
「増幅ステージ」をご参照ください。
「Threshold cycle（CT）
」をご参照ください。
テストするテンプレート。
［Reaction Setup］
（反応セッ
サンプル DNA（10✕） StepOne™ ソフトウェアでは、この反応コンポーネントは、
トアップ）画面の［Reaction Mix Calculations］
（反応ミックス計算）タブに表示されま
す。本ソフトウェアは、反応ミックスへの添加サンプル DNA が 10✕ 濃度であると仮定
します。例えば、反応量 20 µL の場合、1 反応の計算サンプル量は 2 µL です。
サンプル／
SNP アッセイ反応
ジェノタイピング実験の 1 つの PCR 反応でテストするサンプルと実施する SNP のアッ
セイの組み合わせ。各 PCR 反応には、サンプルと SNP の各 1 アッセイのみ含めること
ができます。
サンプル／
ターゲット反応
定量実験の 1 つの PCR 反応でテストするサンプルと実施する SNP のアッセイの組み合
わせ。［Design Wizard］
（設計ウィザード）で、1 回の PCR 反応には、1 つのターゲッ
トのみ検出と定量ができます。［Advanced Setup］
（高度なセットアップ）により、1 回
の PCR 反応において、複数のターゲットの検出と定量ができます。
用語集- 6
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
用語集
閾値
1. 増幅プロットでベースラインよりも高く、指数増幅領域内の蛍光レベル。閾値は、
自動で（「自動 CT」参照）
、また手動で（「手動 CT」参照）設定できます。
2. 有無実験で、StepOne™ ソフトウェアが検出コールを発信する蛍光レベル。
システム色素
Applied Biosystems が製造し、StepOne™ または StepOnePlus™ システムで事前キャリ
ブ レ ー シ ョ ン さ れ て い る 色 素。実 験 に シ ス テ ム 色 素 を 使 用 す る 前 に、
［Instrument
Maintenance Manager］（装置メンテナンスマネージャ）でシステム Dye キャリブレー
ションが最新であることを確認してください。
StepOne システム用システム色素：
• FAM™ 色素
• JOE™ 色素
• ROX™ 色素
• SYBR® Green 色素
• VIC® 色素
StepOnePlus システム用システム色素：
FAM™ 色素
JOE™ 色素
NED™ 色素
ROX™ 色素
SYBR® Green 色素
TAMRA™ 色素
VIC® 色素
重要！ Applied Biosystems は、TAMRA™ 色素をレポーターやクエンチャーとして
StepOne™ システムで使うことはお勧めしません。TAMRA 色素は、StepOnePlus™ シス
•
•
•
•
•
•
•
テムでレポーターやクエンチャーとして使えます。
実験
StepOne™ または StepOnePlus™ システムでの測定実施のプロセス全体を指し、セット
アップ、測定、解析を含みます。StepOne および StepOnePlus システムを用いて実施で
きる実験のタイプ：
•
•
•
•
•
•
定量 - 標準曲線
定量 - 相対標準曲線
定量 - 比較 CT（∆∆CT）
融解曲線
ジェノタイピング実験
有無実験
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
用語集- 7
用語集
実験タイプ
StepOne™ または StepOnePlus™ システムを用いて実施できる実験のタイプ：
•
•
•
•
•
•
標準曲線法
比較 CT（∆∆CT）
相対標準曲線法
融解曲線（［Design Wizard］
（設計ウィザード）では使用できません）
ジェノタイピング実験
有無実験
実験タイプの選択は、セットアップ、測定、解析の画面に影響します。
実験名
自動 CT
実験セットアップ時に入力する名前で、実験の識別に使用します。実験名は 100 文字以
内とし、下記の文字は使用できません。スラッシュ（/）
、バックスラッシュ（\）
、大なり
記号（>）、小なり記号（<）
、アスタリスク（*）
、クエスチョンマーク（?）
、引用符（"）
、
バー（|）、コロン（:）、セミコロン（;）
この解析設定では、ソフトウェアが、増幅プロットのベースラインの開始および終了値
や閾値を計算します。ソフトウェアは、ベースラインと閾値を使用して Threshold cycle
（CT）を計算します。「Threshold cycle（CT）
」をご参照ください。
自動ベースライン
この解析設定では、ソフトウェアが、増幅プロットのベースラインの開始および終了値
を計算します。反応プレート中の特定のウェルに対して自動ベースライン設定を行えま
す。「ベースライン」をご参照ください。
試薬
ターゲット増幅と増幅検出に使用する PCR 反応コンポーネント。StepOne™ および
StepOnePlus™ システムで使用する試薬のタイプ：
• TaqMan® 試薬
• SYBR® Green 試薬
• その他の試薬
手動 CT
この解析設定では、ユーザーが閾値を入力し、自動ベースラインまたは手動ベースライ
ン 値 の ど ち ら か を 選 択 し ま す。ソ フ ト ウ ェ ア は、ベ ー ス ラ イ ン と 閾 値 を 使 用 し て
Threshold cycle（CT）を計算します。
手動ベースライン
この解析設定では、ユーザーが、増幅プロットのベースラインの開始および終了値を入
力します。反応プレート中の特定のウェルに対して手動ベースライン設定を行えます。
シリーズ
シリアル係数
「スタンダード 希釈シリーズ」をご参照ください。
StepOne™ ソフトウェアで、標準曲線における量のシーケンスを設定する数値。シリアル
係数と開始量から、標準曲線の各ポイントのスタンダード量が計算されます。例えば、
標準曲線の定義シリアル係数が 1：10 か 10✕ のときは、曲線での隣接 2 ポイント間の差
は 10 倍です。
用語集- 8
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
用語集
スタンダード
既知の標準量を含むサンプル。スタンダード反応は、定量実験で使用して標準曲線を作
成します。「標準曲線」および「スタンダード 希釈シリーズ」をご参照ください。
スタンダード
希釈シリーズ
標準曲線および相対標準曲線実験で、ある範囲の既知量を含むスタンダードのセット。
スタンダード希釈シリーズは、スタンダードを連続的に希釈して調製されます。例えば、
スタンダード原液から第一希釈ポイントを調製し、第一希釈ポイントから第二希釈ポイ
ントを調製します。スタンダード希釈シリーズの調製に必要な量は、StepOne™ ソフト
ウェアによって、希釈ポイント数、スタンダードの反復数、開始量、シリアル係数、ス
タンダード原液濃度から計算されます。「標準曲線」をご参照ください。
スタンドアロン
レイアウト
このシステムレイアウトでは、StepOne™ または StepOnePlus™ 装置は、黄色いケーブル
でコンピュータに接続されません 。このレイアウトの場合、装置のコントロールは、装
置のタッチスクリーンのみ可能です。USB ドライブやネットワーク接続により装置とコ
ンピュータ間のデータ転送を行います。
ステージ
サーマルプロファイル内で、1 つ以上のステップを含むステージ。3 種類のステージがあ
ります。ホールディングステージ（PCR 前の読み取りおよび PCR 後の読み取りを含む）、
サイクリングステージ（増幅ステージとも呼ばれる）および融解曲線ステージです。
ステップ
サーマルプロファイルのコンポーネント。サーマルプロファイル中の各ステップでは、
ランプ速度（融解曲線ステップのランプ増分）、ホールド温度、ホールド時間（時間幅）
の設定ができ、ステップのランプまたはホールド部分に関しデータ収集をオンまたはオ
フに設定できます。サイクリングステージのステップは AutoDelta ステータスによって
も定義されます。StepOnePlus™ システムには、VeriFlex™ ブロックが含まれており、各
ステップで 6 種類の温度（各 VeriFlex ブロックに一つ）を設定できます。
生データプロット
各光学フィルタの（ノーマライズしていない）生の蛍光シグナルによるプロット。
ゾーン
StepOnePlus™ 装置での測定中、個別に熱制御可能な VeriFlex™ ブロックに設定できる、
96 ウェル内の最高 6 つのサンプル温度領域の一つ。VeriFlex ブロックはそれぞれ異なる
温度設定をすることも、すべての VeriFlex ブロックを同じ温度にすることも可能です。
参考： 溶解曲線ステップでは、すべての VeriFlex ブロックを同じ温度に設定する必要が
あります
ゾーン境界線
個別に熱制御可能な 6 つの VeriFlex™ ブロックによって形成されるサンプルのゾーンの
境界。ゾーン境界線は、StepOne™ ソフトウェアのプレートレイアウトに濃赤色で表示さ
れます。
相対標準曲線法
サンプル中ターゲットの相対量を決定する方法。相対標準曲線法では、StepOne™ ソフト
ウェアにより、サンプル、リファレンスサンプル、標準希釈シリーズ中に含まれるター
ゲットや内在性コントロールの増幅を測定します。測定結果は、内在性コントロールに
よりノーマライズされます。標準希釈シリーズのデータを使用して標準曲線を作成しま
す。ソフトウェアは、標準曲線を用いて、サンプルおよびリファレンスサンプル中のター
ゲット量を外挿します。ソフトウェアは、各サンプル中のターゲット量とリファレンス
サンプル中のターゲット量とを比較することにより、各サンプル中ターゲットの相対量
を決定します。
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
用語集- 9
用語集
増幅
装置での測定の一部分で、PCR によりターゲットを増幅します。定量実験では、増幅時
に収集した蛍光データを増幅プロット表示し、データを結果計算に使用します。ジェノ
タイピング実験や有無実験では、増幅時に収集した蛍光データを増幅プロット表示し、
データを結果計算に使用することができます。
増幅効率（EFF%）
PCR 増幅の効率計算。増幅効率は、標準曲線での回帰直線の傾きを使って計算します。
傾きが −3.32 に近いとき、最適な 100% PCR 増幅効率を示します。増幅効率に影響する
要因には、次のものがあります。
• 標準量の範囲 – より精密度 • 正確度の高い効率測定を行うには、広範囲の標準量す
なわち 5 ～ 6 log（105 ～ 106）をご使用ください。
• スタンダードの反復数 – 不正確な分注の影響を低減し、より正確な効率測定を行う
ためには、反復を行います。
• PCR 阻害剤 – 反応中の PCR 阻害剤により、増幅効率が低下し、効率測定に影響が
生じる可能性があります。
増幅しないコントロール 「ネガティブコントロールブロック済み IPC ウェル」参照。
（NAC：No amplification
control）
増幅ステージ
装置での測定の一部分で、PCR によりターゲットを増幅します。増幅ステージは、サー
マルプロファイルのサイクリングステージとも呼ばれ、変性、プライマーのアニーリン
グ、重合反応の各ステップを繰り返します。
定量実験では、増幅ステージで収集した蛍光データを増幅プロット表示し、データを結
果計算に使用します。ジェノタイピング実験や有無実験では、増幅ステージで収集した
蛍光データを増幅プロット表示し、データを結果計算に使用することができます。
「サイ
クリングステージ」をご参照ください。
増幅プロット
PCR 増幅のサイクリングステージで収集したデータの表示。以下の形で表示できます。
• ベースライン修正したノーマライズ済みレポーター（∆Rn）対サイクル
• ノーマライズ済みレポーター（Rn）対サイクル
• Threshold cycle（CT）対ウェル
測定方法
StepOne™ または StepOnePlus™ 装置が実行する反応量とサーマルプロファイルの定義。
ターゲット
増幅および検出の対象となる核酸配列。
ターゲットカラー
StepOne™ システムで、ターゲットに割り当て、ターゲットをプレートレイアウトや解析
プロットで同定する色。
用語集- 10
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
用語集
タスク
StepOne™ ソフトウェアで、ターゲット／ SNP アッセイのウェルで実施する反応のタイ
プ。実施可能なタスク：
•
•
•
•
•
•
タッチスクリーン
未知のサンプル
ネガティブコントロール
スタンダード（標準曲線および相対標準曲線実験）
ポジティブコントロール（ジェノタイピング実験）
IPC（有無実験）
ブロック IPC（有無実験）
StepOne™またはStepOnePlus™装置をコントロールするためにタッチする装置のディス
プレイ。
定量方法
テンプレート
定量実験で、サンプルに含まれるターゲットの量を特定する方法。StepOne™ および
StepOnePlus™ システムでは、3 種類の定量方法が可能です。標準曲線法、相対標準曲線
法および比較 CT（∆∆CT）法。
StepOne™ ソフトウェアの［Design Wizard］（設定ウィザード）（および定量実験の
［QuickStart］（クイックスタート））で、PCR 反応に追加する核酸の種類。推奨テンプ
レートは、実験タイプにより異なります。
• 定量実験（標準曲線法、相対標準曲線および比較 CT 法）－ cDNA（相補 DNA）、
RNA、gDNA（ゲノム DNA）。
定量実験では、テンプレートの選択により、測定方法、反応セットアップ、物品リ
ストが変わります。
• ジェノタイピング実験 － 湿潤 DNA（gDNA もしくは cDNA）または乾燥 DNA
（gDNA もしくは cDNA）。
ジェノタイピング実験では、テンプレートの選択により、反応セットアップが変わ
ります。
• 有無実験 － DNA
Applied Biosystems は、有無実験で、DNA テンプレートを PCR 反応に添加する
ことをお勧めします。
テンプレートを含まない 「ネガティブコントロール（NC）」をご参照ください。
コントロール（NTC：
No template control）
データ収集
装置のコンポーネントが、反応プレートの各ウェルからの蛍光データを検出する装置の
測定プロセス。装置が信号を電子データに変換し、データは実験ファイルに保存されま
す。StepOne™ システムでは、データ収集ポイントは、サーマルプロファイル内のアイコ
ンで示されます。
• データ収集がオン：
• データ収集がオフ：
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
用語集- 11
用語集
内在性コントロール
実験中のすべての試験サンプルで、同様のレベルで発現すべきターゲットまたは遺伝子。
相対標準曲線および比較 CT（∆∆CT）実験では、内在性コントロールを用いて定量中の
ターゲットの蛍光シグナルをノーマライズします。ハウスキーピング遺伝子は、内在性
コントロールとして使用できます。「ハウスキーピング 遺伝子」をご参照ください。
有無実験で、PCR 反応に添加する短い合成 DNA テンプレート。IPC を使用して、真の
内在性ポジティブ
コントロール（Internal 陰性結果（すなわち、サンプル中にターゲットが存在しない）と、PCR 阻害剤や不適切
positive control：IPC） なアッセイセットアップ、試薬や装置の不具合が影響した反応とを区別できます。
ネガティブコントロール
IPC ウェル
有無実験で、IPC テンプレートおよびバッファーまたは水をサンプルの代わりに含む
ウェル。ネガティブコントロール IPC ウェルでは、IPC テンプレートのみが増幅します。
反応にサンプルが含まれないからです。別称「IPC+」
。
ネガティブコントロール
（NC）
StepOne™ ソフトウェアで、サンプルの代わりに水やバッファーを含むウェル内のター
ゲットや SNP アッセイに割り当てられるタスク。ターゲットの増幅は、ネガティブコン
トロールウェルでは起こりません。別称、
「テンプレートを含まないコントロール（NTC：
No template control）」。
ネガティブコントロール 有無実験で、PCR 反応のサンプルの代わりに IPC 遮断剤を含むウェル。増幅はネガティ
ブロック済み IPC ウェル ブコントロールブロック済み IPC ウェルでは起きません。反応にサンプルが含まれず、
IPC の 増 幅 が 遮 断 さ れ る か ら で す。別 称「増 幅 し な い コ ン ト ロ ー ル（NAC：No
amplification control）」。
ノーマライズ済み
レポーター（Rn）
パッシブリファレンスの蛍光信号にノーマライズした、レポーター色素からの蛍光信号。
ノーマライズ量
ターゲット量を内在性コントロールの量で除したもの。
ハウスキーピング
遺伝子
細胞の基本的な機能に関与し構成的に発現する遺伝子。ハウスキーピング遺伝子は、内
在性コントロールとして使用できます。「内在性コントロール」をご参照ください。
パッシブリファレンス
蛍光シグナルを生成する色素。パッシブリファレンス信号はすべてのウェルで一定なの
で、レポーター色素信号をノーマライズし、わずかなウェル間の濃度や量の違いによる
PCR に関連しない蛍光変動を補正するために使用されます。パッシブリファレンス信号
への正規化により、データ精度が高まります。
反応ミックス
テンプレート（サンプル、スタンダード、またはコントロール）以外のすべての PCR 反
応測定コンポーネントを含む溶液。
反復グループ
実験での同一反応のセット。
反復数
同一コンポーネントを同一量含む同一反応の総数。
用語集- 12
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
用語集
比較 CT（∆∆CT）法
サンプル中ターゲットの相対量を決定する方法。比較 CT（∆∆CT）法では、StepOne™ ソ
フトウェアにより、サンプルやリファレンスサンプル中のターゲットや内在性コント
ロールの増幅を測定します。測定結果は、内在性コントロールによりノーマライズされ
ます。ソフトウェアは、各サンプル中のターゲット量とリファレンスサンプル中のノー
マライズ済みターゲット量とを比較することにより、各サンプル中ターゲットの相対量
を決定します。
非蛍光クエンチャー マイナーグループバイ
ンダー（NFQ-MGB）
TaqMan® プローブの 3′ 末端に結合する分子。プローブがインタクトな時は、非蛍光ク
エンチャー（NFQ）は、レポーター色素からの蛍光信号の放射を阻止します。NFQ は
微分レポーター
（−Rn′ ）
標準曲線
蛍光を出さないので、生成されるバックグラウンド信号は低く、その結果、定量精度が
向上します。マイナーグループバインダー（MGB）は融解温度（Tm）を上げますが、
プローブ長は増えません。また、短いプローブも設計できます。
PCR 増幅でレポーターが生成したノーマライズ済み蛍光シグナル強度の負の一次微分。
微分レポーター（–Rn′ ）vs 温度融解曲線では、ノーマライズした、微分レポーターシグ
ナルは y 軸に表示されます。
標準曲線および相対標準曲線実験で：
• 標準量に対してプロットしたスタンダード反応からの CT 値のプロットで最も良く
フィットするライン。「回帰直線」も参照。
• ある範囲の既知量を含むスタンダードのセット。標準曲線反応からのデータを使用
して標準曲線を作成します。標準曲線は、希釈シリーズのポイント数、スタンダー
ドの反復数、開始量、シリアル係数で定義されます。
「スタンダード希釈シリーズ」
も参照。
標準曲線法
サンプル中ターゲットの絶対量を決定する方法。標準曲線法では、StepOne™ ソフトウェ
アにより、サンプル、リファレンスサンプル、標準希釈シリーズ中に含まれるターゲッ
トの増幅を測定します。標準希釈シリーズのデータを使用して標準曲線を作成します。
ソフトウェアは、標準曲線を用いて、サンプル中ターゲットの絶対量を外挿します。
「ス
タンダード」および「標準曲線」をご参照ください。
標準量
PCR 反応での既知量。
• 標準曲線実験では、スタンダードにおけるターゲット量。StepOne™ ソフトウェア
では、標準量の単位は、質量、コピー数、ウイルス量、その他のターゲット量など
の測定単位です。
• 相対標準曲線実験では、スタンダードにおける既知量。例えば、標準量は、cDNA
量や PCR 反応中の標準原液量などです。単位は相対標準曲線実験では無関係で、計
算では無効です。
フォワードプライマー
アンプリコンの 5′ 末端に隣接するオリゴヌクレオチド。PCR 反応ではリバースプライ
マーとフォワードプライマーを併用してターゲットを増幅します。
ブロックされた IPC
有無実験で、IPC 遮断剤（内在性ポジティブコントロール、IPC の増幅を遮断する）を
含む反応。StepOne™ ソフトウェアでは、IPC 遮断剤を含むウェル内の IPC ターゲット
のタスク。「ネガティブコントロールブロック済み IPC ウェル」をご参照ください。
プライマー／プローブ
ミックス
ターゲット増幅用プライマーと、ターゲット増幅検出用 TaqMan® プローブからなる PCR
反応コンポーネント。
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
用語集- 13
用語集
プライマーミックス
ターゲットを増幅するよう設計されたフォワードプライマーとリバースプライマーを含
む PCR 反応コンポーネント。
プレートレイアウト
反応プレートのグリッドの各ウェルと、割り当てられた内容物の図。StepOne™ システム
の場合、グリッドは 6 行 8 列です。StepOnePlus™ システムの場合、グリッドは 8 行 12
列です。
StepOne™ ソフトウェアでは、プレートレイアウトを選択ツールとして使用し、ウェル内
容物を割り当てたり、ウェル割り当ての表示や結果の表示ができます。プレートレイア
ウトは、印刷、レポートへの表示、エクスポートや、プレゼンテーション用のスライド
としての保存ができます。
ベースライン
増幅プロットにおいて、蛍光シグナルの変化が小さい PCR 初期サイクル中の蛍光レベル
に該当するライン。
ベースライン修正した
ノーマライズ済み
レポーター（∆Rn）
レポーターが生成したノーマライズ済み蛍光シグナルの強度。
1. リアルタイム PCR データを含む実験では、PCR 増幅の各サイクルでレポーターが生
成したノーマライズ済み蛍光シグナルの強度。∆Rn vs. Cycle 増幅プロットでは、各
サイクルの ∆Rn は次式により計算されます。
∆Rn（サイクル）= Rn（サイクル）− Rn（ベースライン）で、Rn = ノーマライズ済
みレポーター
2. ジェノタイピング実験や有無実験では、ノーマライズしたレポーター蛍光シグナル
値の、PCR 前読み取りと PCR 後読み取り間の差。アレル識別プロット（ジェノタ
イピング実験）や有無プロット（有無実験）では、∆Rn は、次式で計算します。
∆Rn = Rn（PCR 後読み取り）− Rn（PCR 前読み取り）で、Rn = ノーマライズ済み
レポーター
」をご参照ください。
「ノーマライズ済み レポーター（Rn）
ホールディング
ステージ
サーマルプロファイル内で、1 つ以上のステップを含むステージ。ホールディングステー
ジは、酵素の活性化や不活性化、反応物の培養のためサーマルプロファイルに追加でき
ます。
ポイント
標準曲線内の 1 つのスタンダード。標準曲線の各ポイントのスタンダード量は、開始量
とシリアル係数に基づいて計算されます。
ポジティブコントロール
ジェノタイピング実験で、ジェノタイプが既知であるホモ接合性またはヘテロ接合性の
DNA サンプル。StepOne™ ソフトウェアで、既知ジェノタイプのサンプルを含むウェル
内の SNP アッセイに割り当てたタスク。
マルチコンポーネント
プロット
指定したウェル内の各色素の全スペクトル構成を PCR 測定中表示するプロット。
未知－ IPC ウェル
有無実験で、未知のサンプルと内在性ポジティブコントロール（IPC）を含むウェル。
用語集- 14
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
用語集
未知の
StepOne™ソフトウェアで、テストするサンプルを含むウェル内のターゲットまたはSNP
アッセイに割り当てたタスク。
• 定量実験では、ターゲット量不明のサンプルを含むウェル内のターゲット用のタス
ク。
• ジェノタイピング実験では、ジェノタイプが不明のサンプルを含むウェル内の SNP
アッセイ用のタスク。
• 有無実験では、ターゲットの有無不明のサンプルを含むウェル内のターゲット用の
タスク。
融解温度（Tm）
融解曲線実験で、DNA の 50% が二本鎖であり、50% が一本鎖に解離する温度。Tm は
溶解曲線に表示されます。
融解曲線
融解曲線ステージで収集したデータのプロット。融解曲線のピークはターゲットの融解
温度（Tm）を示す場合があり、非特異的 PCR 増幅を特定できる場合もあります。
StepOne™ ソフトウェアでは、融解曲線は、ノーマライズ済みレポーター（Rn）対温度
か、微分レポーター（−Rn′ ）対温度で表示できます。別称「解離曲線」。
融解曲線ステージ
サーマルプロファイル内で、温度を段階的に上げて融解曲線を作成するステージ。
ランプ
装置実行時の温度変更レート。融解曲線ステップ以外では、ランプはパーセントで定義
します。融解曲線ステップでは、ランプは温度増分で定義します。サーマルプロファイ
ルのグラフィック表示では、ランプは対角線で示されます。
ランプ速度
装置実行中に発生する温度ランプの速度。使用できるランプ速度は Fast（高速）とスタ
ンダードです。
• Fast ランプ速度により最適な結果を得るために、Applied Biosystems は、TaqMan®
Fast 試薬を PCR 反応に使用することをお勧めします。
• 標準ランプ速度で最適な結果を得るためには、Applied Biosystems は、標準試薬を
PCR 反応に使用することをお勧めします。
重要！ ジェノタイピングまたは有無実験では、TaqMan Fast 試薬は使用できません。
リアルタイム PCR
PCR 時の蛍光データの収集プロセス。リアルタイム PCR データは、定量実験の結果計
算や、ジェノタイピング／有無実験結果のトラブルシューティングに使用します。
リバースプライマー
アンプリコンの 3′ 末端に隣接するオリゴヌクレオチド。PCR 反応ではリバースプライ
マーとフォワードプライマーを併用してターゲットを増幅します。
リファレンスサンプル
相対標準曲線および比較 CT（∆∆CT）実験で、相対定量結果の基礎とするサンプル。別
称「キャリブレータ」。
量
定量実験でサンプルに含まれるターゲットの量。絶対量には、コピー数、質量、モル濃
度、またはウイルス量があります。相対量は、サンプル中ノーマライズ済みターゲット
量と、リファレンスサンプル中ノーマライズ済みターゲット量との発現差です。
レポーター
増幅を検出する蛍光色素。TaqMan® 試薬では、レポーター色素は 5′ 末端に結合します。
SYBR® Green 試薬では、レポーター色素は SYBR® Green 色素です。
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
用語集- 15
用語集
用語集- 16
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
索引
記号
M
アンプリコン部位
プライマーの 3 猪亦 3-23
プローブの 5 猪亦 3-22
Made to Order アッセイタイプ 1-9
MSDS、入手 xii
MultiScribe Reverse Transcriptase、定義 3-26
数字
P
1 ステップ RT-PCR
RNA 定量 3-25, D-4, D-9
使用プライマー 3-9
説明 3-8
2 ステップ RT-PCR
RNA 定量 3-26, D-4, D-9
使用プライマー 3-9
説明 3-8
PCR、一般的留意事項 2-8
Primer Express Software
有無実験 5-16
定量実験 3-21
短いアンプリコン 3-22
Primer Express ソフトウェア
SNP アッセイ 1-10
R
A
［Advanced Setup］
（高度なセットアップ）ワークフ
ロー 1-9, 1-10
Applied Biosystems
テクニカルサポート xii
問い合わせ xii
文書に関するユーザーのフィードバック xii
C
Custom TaqMan Gene Expression Assays 3-18, 5-12
Custom TaqMan SNP Genotyping Assays 4-14
［Custom］（カスタム）アッセイタイプ 1-9, 1-10
RNA 定量
1 ステップ RT-PCR 3-25, D-4, D-9
2 ステップ RT-PCR 3-26, D-4, D-9
サーマルサイクリング条件 3-28, 3-29
RT-PCR
1 ステップ 3-8
2 ステップ 3-8
方法の比較 3-7, 3-9
S
StepOne システム
アッセイタイプ 1-9
実験タイプ 1-7
試薬タイプ 1-8
消耗品 1-4
データ収集 1-2
フィルタ 1-3
D
DDCT 実験。「比較 CT 実験」参照。
［Design Wizard］（設計ウィザード）ワークフロー 1-9,
1-10
DNA/cDNA 定量、サーマルサイクリング条件 3-28
SYBR Green 試薬 1-3
開発 2-5
仕組み 2-5
選択に際する留意事項 2-6
定量実験の最適化 3-31
G
G/C 含量、およびアンプリコン部位 3-22
T
I
Inventoried アッセイタイプ 1-9
IPC 5-4, 5-5
TaqMan Drug Metabolism Genotyping Assays 4-11
TaqMan Endogenous Control Assays 3-17
TaqMan Exogenous Internal Positive Control Reagents 5-13
TaqMan Gene Expression Assays 3-16, 5-10
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
索引 - 1
索引
TaqMan MGB プローブ 2-3
使用 2-4
TaqMan PDARs for AD 4-12
TaqMan SNP Genotyping Assays 4-10
TaqMan 試薬 1-3
開発 2-2
仕組み 2-2
実験タイプ 2-2
選択に際する留意事項 2-6
定義 5-4
マスターミックスの選択 5-15
え
エンドポイント実験
有無 5-5
ジェノタイピング 4-4
お
U
オンラインヘルプ。「ヘルプシステム」参照。
UNG、キャリーオーバーの最小限化 2-7
Universal Master Mix 試薬
ポリメラーゼの利点 3-26
か
あ
アッセイ設計ガイドライン
有無実験 5-16
サーマルサイクリング条件 3-27
ジェノタイピング実験 C-2
試薬の選択 3-24
説明 C-1
定量実験 3-21, C-1
プライマーとプローブ 3-21, 3-23
プライマー濃度の最適化 3-30
プローブ濃度の最適化 3-33
アッセイタイプ
［Custom］（カスタム）アッセイ 1-9, 1-10
Inventoried/Made to Order（在庫／注文生産）アッセ
イ 1-9
有無実験 5-6
ジェノタイピング実験 4-6
設計済み／検証済みアッセイ 1-10
選択 1-9
定量実験 3-12
アンプリコンの選択、短い 3-22
アンプリコン部位
G/C 含量 3-22
スクリーニング 3-22
選択 3-22
融解温度 3-22
う
有無実験
IPC の取り込み 5-5
IPC 無添加で実施 5-4
TaqMan 試薬 2-2
アッセイタイプ 5-6
カスタムアッセイタイプ用アッセイ設計ガイドライ
ン 5-16
カスタムアッセイタイプ用試薬の選択 3-24, D-3, D-9
コンポーネント 5-4
仕組み 5-5
設計 5-16
索引 -2
カスタムアッセイタイプ
有無実験 5-16
定量実験 3-21
き
キャリーオーバー、UNG で最小限化 2-7
さ
サーマルサイクリング条件
1 ステップ RT-PCR 3-28
2 ステップ RT-PCR 3-29
DNA/cDNA 定量 3-28
RNA 定量 3-28
最小限、DNA 汚染 2-7
最適化 3-33
サンプル 4-4, 5-4
実験のコンポーネント 3-5, 3-6
し
ジェノタイピング実験
TaqMan 試薬 2-2
アッセイ設計ガイドラインの総括 C-2
アッセイタイプ 4-6
コンポーネント 4-4
仕組み 4-4
設計 4-14, 4-16
説明 4-4
装置 4-4
不一致 4-5
マスターミックスの選択 4-13, 4-16
色素結合、方法 2-5
実験の設計
有無 5-16
ジェノタイピング 4-14, 4-16
定量 3-20, 3-21
試薬
SYBR Green 試薬 1-8
TaqMan 試薬 1-8, 2-2
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
索引
カスタムアッセイタイプの選択 D-3, D-9
カスタムアッセイタイプ用の選択 3-24
選択 1-8, 2-6
その他の蛍光ベース 1-8
留意事項 2-6
消耗品
使用可能な 1-4
「必要な物品」も参照。 1-4
な
内在性コントロール
実験のコンポーネント 3-6
ね
ネガティブコントロール 4-4
ネガティブコントロール、実験のコンポーネント 3-5, 3-6,
5-4
す
スタンダード
実験のコンポーネント 3-5
は
スタンダード希釈シリーズ
実験のコンポーネント 3-5
反復、実験のコンポーネント 3-5, 3-6
反復 4-4, 5-4
せ
ひ
設計済み／検証済みアッセイタイプ 1-10
比較 CT 実験
コンポーネント 3-6
説明 3-6
「定量実験」も参照。 3-6
そ
相対標準曲線実験
コンポーネント 3-5
説明 3-5
「定量実験」も参照。 3-5
非特異的生成物、SYBR Green 色素使用に伴う汚染 2-7
その他の蛍光ベース試薬 1-8
標準曲線実験
コンポーネント 3-5
説明 3-5
「定量実験」も参照。 3-5
て
ふ
定量実験
SYBR Green 試薬 2-4, 3-31
TaqMan 試薬 2-2
アッセイ設計ガイドラインの総括 C-1
アッセイタイプ 3-12
解説 3-4
カスタムアッセイタイプ用アッセイ設計ガイドライ
ン 3-21
カスタムアッセイタイプ用試薬の選択 3-24, D-3, D-9
試薬タイプの選択 3-12
設計 3-20, 3-21
相対標準曲線 3-5
定量方法の選択 3-5
比較 3-7
比較 CT 3-6
標準曲線 3-5
マスターミックスの選択 3-19
リアルタイム PCR 3-4
データ
データ収集について 1-2
テキスト表記法 viii
テクニカルサポート、問い合わせ xii
と
トレーニング、情報 xii
不一致、ジェノタイピング実験における 4-5
プライマー
1 ステップ RT-PCR 3-9
2 ステップ RT-PCR 3-9
設計ガイドラインの要約 3-23
濃度のデフォルト値 3-30
ヘアピンループ 3-9
プライマーの制限、マルチプレックスアッセイ 3-10
プライマーマトリックス
使用方法 3-30
制限の定義 B-1
制限例 B-2
プローブ
設計ガイドラインの要約 3-23
プローブ濃度の最適化 3-33
利用可能な TaqMan MGB プローブ 2-4
文書、関連 ix
へ
ヘアピンループ、プライマー選択 3-9
ヘルプシステム、アクセス xi
ほ
ポジティブコントロール 4-4
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
索引 - 3
索引
本ガイドを使用する際の前提 viii
本書で使用する表記法 viii
ま
マスターミックス
有無実験用の選択 5-15
ジェノタイピング実験用に選択 4-13, 4-16
定量実験に選択 3-19
マルチプレックス PCR
rRNA プライマー B-1
シングルプレックスとの比較 3-10
説明 3-10
プライマーの制限 3-10
み
短いアンプリコン、選択 3-22
ゆ
融解温度、およびアンプリコン部位 3-22
ユーザーの注意を促す語句、説明 viii
ユーザーのフィードバック、Applied Biosystems の文書に
関する xii
り
リアルタイム PCR
TaqMan 検出プロセス 2-2
定量実験 3-4
リファレンスサンプル
実験のコンポーネント 3-5, 3-6
索引 -4
Applied Biosystems StepOne™ および StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems 試薬ガイド
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総合検査案内書参照

No.9 「抗酸菌」

非常勤職員（時給） - 国立感染症研究所

センター生物～解説～ - livedoor Blog

審査要旨（PDF/82KB）

Super-Kamiokande今後の計画

ファイル名:07 サイズ:214.53 KB