07P085_中川吏乃

平成２４
平成２４年度新潟薬科大学薬学部卒業研究
２４年度新潟薬科大学薬学部卒業研究Ⅱ
年度新潟薬科大学薬学部卒業研究Ⅱ
論文題目
エストロゲン関連受容体
エストロゲン関連受容体アゴニスト
関連受容体アゴニスト gsk4716 による
精巣上体への
精巣上体への内分泌撹乱作用
への内分泌撹乱作用の
内分泌撹乱作用の検討
Examination of endocrine disruption on the epididymis
by estrogen related receptor agonist gsk4716
公衆衛生学研究室 6 年
０７P
０７P０８５
中川吏乃
（指導教員：
指導教員：佐藤浩二）
浩二）
要旨
内分泌撹乱物質の研究において、ジエチルスチルベストロール(diethylstilbestrol： DES)
はエストロゲン作用を持つ化合物の代表として、これまでに多くの研究が行われている。DES
は1938年にDoddsらによって発表された初の合成非ステロイド性エストロゲンである。1930年
代後半から1970年代にかけて、妊婦に流産予防や妊娠合併症治療薬として広く使用された。
しかし、DES胎内曝露児及びその母親の徹底的な追跡調査を通して、これらの被曝露者が、
がん、奇形、生殖障害など多様な影響を被っている事実が明らかとなり、現在は使用が中止さ
れている。また、DESを使用した妊婦やその子供のみならず、経世代的に影響を与えているこ
とを示唆するデータもある。そのため、現在でも疫学調査が続けられており、その作用メカニズ
ムに関する研究はエストロゲン作用を持つ内分泌撹乱物質を研究する際のモデルともなって
いる。マウスなどの哺乳類の実験動物を使用したモデルでは、胎児期や新生児期にDESを投
与すると、雌における腟上皮の不可逆的な角質化や子官癌、雄における精子形成の異常など
が確認されている。
これまでDESの作用は内在性のエストロゲンの17β‐estradiol (E2)と同じく、エストロゲンレ
セプター(Estrogen Receptor: ER)を介するものが主であると考えられてきていた。しかし、E2
はERを介する作用しか示さないのに対し、DESはERに加えてエストロゲン関連レセプター
(Estrogen Related Receptor: ERR)にも結合することから、ERRを介す作用も存在すると考
えられている。
そこで本研究ではDESの内分泌撹乱作用におけるER以外の作用点としてリガンドが結合
しない状態で転写活性化能を持つERRに着目し、ERRβ、ERRγの特異的なアゴニストである
gsk4716を用いて研究を行った。新生児期マウスにDES、gsk4716、E2を投与し、精巣上体
における各種ER、ERRのmRNA発現量、ERRβタンパク質の発現をリアルタイムRT‐PCR法
及びウェスタンブロッティング法を用いて定量的に解析した。
その結果、精巣上体において、DESとE2、sk4716を投与したときでERRの発現が増減し
ている事が分かった。
2
キーワード
1．内分泌撹乱物質
2．DES
3．E2
4．gsk4716
5．ERR
6．精巣上体
7．ホルモン
8．ERRβ
9. mRNA 発現量
10. ER
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目次
1．略語一覧・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・5
2．はじめに・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・6
3．材料および方法・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・8
4．結果・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・10
5．考察・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・14
謝辞・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・15
引用文献・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・16
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1．略語一覧
DES： diethylstilbestrol
E2： 17β‐estradiol
ER： estrogen receptor
ERR: estrogen related receptor
shp： small heterodimer partner
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2．はじめに
我々の体内では、様々な種類のホルモンが働いている。ホルモンとは、内分泌腺から血中
に分泌される生理活性物質で特定の器官の調節を行っている。また、体内で作られるホルモ
ン以外に、体外から摂取する食物にもホルモン様作用を示す食品成分や合成化学物質が含
まれ、非意図的に摂取している場合がある。逆に、疾病の治療や避妊などの目的で合成ホル
モン剤などの医薬品を積極的に摂取する場合もある。このように内分泌系への薬理作用を期
待して開発された医薬品の一つにジエチルスチルベストロール(diethylstilbestrol： DES)が
挙げられる｡
DES は 1938 年に Dodds らによって発表された初の合成非ステロイド性エストロゲンである。
1930 年代後半から 1970 年代にかけて、妊婦に流産予防や妊娠合併症治療薬として広く使
用された[1]。しかし、生まれてきた子供に膣・頚部明細胞腺がんや膣扁平上皮の変化といっ
た様々な生殖異常を誘発することが明らかとなり、現在は使用が中止されている[2]。しかし、Ｄ
ＥＳを使用した妊婦やその子供のみならず、孫の世代に至るまで発癌率などの上昇を示唆す
るデータがあり、現在でも疫学調査が続けられ、その経世代的に及ぶ作用機序に関心がもた
れている[3]。
このため、DESの作用メカニズムに関する研究はエストロゲン作用を持つ内分泌撹乱物質
を研究する際のモデルともなっている。実際、マウスなどの哺乳類の実験動物を使用したモデ
ルでは、胎児期や新生児期にDESを投与すると、雌における腟上皮の不可逆的な角質化や
子宮癌、雄における精子形成の異常などが確認されている。また、成長後のマウスでも、雄の
生殖器官において遺伝子発現の変化を起こしていることが確認されている[4]。
これまでDESによる内分泌撹乱作用は内在性エストロゲンの17β‐estradiol (E2)と同じく、
エストロゲンレセプター(Estrogen Receptor : ER)を介するものが主であると考えられてきた。
しかし、E2はERを介する作用しか示さないのに対し、DESはERに加えてエストロゲン関連レ
セプター(Estrogen Related Receptor : ERR)にも結合することから、ERRを介した作用も存
在するのではないかと考えられている。ERRはERとの相同性を元にクローニングされた核内
受容体スーパーファミリーのメンバーであり、ERRα、ERRβ、ERRγの3種類のサブタイプが存
在する。これらはいずれもERα、ERβと異なり、内在性エストロゲンであるE2には結合しないが、
リガンドが結合しない状態で転写活性化能を持っている。現在のところ、内在性のリガンドは見
つかっておらず、オーファンレセプターに分類されている。
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マウスの新生仔にDESやE2を投与したところ、DESの投与では精巣における精子形成に
大きな異常を起こしたのに対し、等用量のE2では殆ど異常が見られなかったことやcDNAマイ
クロアレイを用いた解析において、DESとE2の投与では発現が変化する遺伝子に明らかな違
いがあったことが報告されている[5]。
DESの内分泌撹乱作用におけるERの意義を明らかにするため、ERα及びERβのノックア
ウトマウスを用いて新生児にDESを投与したところ、ERαのノックアウトマウスでは野生型で見
られたような生殖器の異常がほぼ完全に抑制されたという報告がなされている[6]。この報告か
ら、DESによる生殖器の異常の誘発には少なくともERαが存在することが本質的に重要である
と認識出来る。しかし、DESとE2の内分泌撹乱作用を比較するとDESの方が強力であること
から、ERαを介する作用に加えて、ERRを介する作用が相加的に働いている可能性が考えら
れる。これまではERRに対する選択的なリガンドがなかったため、ERRを介する作用の研究
があまり進んでいなかったが、近年、ERRに対する選択的なアゴニストやインバースアゴニスト
が合成されるようになったことで、状況が変化し始めている。
我々のこれまでの研究で、新生児期DES投与によって、マウスの精巣上体において、RRβ
のmRNAの著明な発現増加が観察されており、このことはDESの内分泌撹乱作用にERRが
何らかの関与をしていることを示唆している。
そこで本研究ではDESの内分泌撹乱作用におけるERα以外の作用点としてリガンドが結合
しない状態で転写活性化能を持つERR（特にERRβ）に着目して精巣上体における解析を行
った。DESはERRα、ERRβ、ERRγの3種類に対してインバースアゴニストとして働くことが知
られている。本研究ではERRβ、ERRγの2種類に対してアゴニストとして働くgsk4716（ERα、
ERβには結合しない）を単独、またはDESと同時に投与することにより、とDES投与同様の結
果になるかどうかを検討した。新生児期マウスにDES、gsk4716、E2を投与し、精巣上体にお
ける各種ER、ERRのmRNA発現量、ERRβタンパク質の発現をリアルタイムRT‐PCR法及び
ウェスタンブロッティング法を用いて定量的に解析した。
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3．材料および方法
1）内分泌撹乱モデルマウスの作成
C57BL/6マウスの新生児に生後1日日から5日日までコーン油に溶解したDES、E2、ま
たはgsk4716を投与した。投与量は3 µg/pup/dayとした。また、gsk4716およびDESを同
時に投与する群も作成し、投与量はそれぞれ3 µg/pup/dayとした。対照群にはコーン油
のみを投与した。生後６日日に死亡させ、精巣上体、精巣を採取した。また、投与終了後、
生後2か月まで観察する群も作成した。
2）永久プレパラートの作成と染色法
薬剤の投与終了後、生後2か月のマウスから取り出した精巣上体を10％ホルマリン固定
液で1晩固定した後、エタノール、キシレンで脱水し、パラフィンに包埋した。ミクロトームで
切片を作成し、キシレン、エタノールでパラフィンを除去し、ヘマトキシリン・エオジン染色を
行い、脱水した後、透徹・封入を行った。
3） RNA抽出と逆転写
マウスから取り出した精巣上体をRNAiso Plus 500 µL中でホモジナイズした。そのホモ
ジネートにクロロホルム100 µLを添加してよく混和し、12000g、4℃、15分間遠心した。透
明な水層を採取し、イソプロパノール500µLを添加し、よく混和することでtotal RNAを回収
した。抽出したRNAは吸光光度計で濃度を測定した。TURBO DNA-free Kit（Ambion）
を用いてRNA試料に含まれるゲノムDNAを除去した。精製したtotal RNAを用いて、
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit （Applied Biosystems）を用いて
25℃10分間、37℃120分間、85℃5秒間の条件でcDNAを合成し、定量PCRに用いた。
4） Real-Time PCR
前述の cDNA に Sterile H2O を加えて 5 倍に希釈した。表１に示したプライマーを用い
て Real-Time PCR を行った。以下の内容で反応液を作成した。
Template cDNA
Forward Primer
5 µL
0.1 µL
Reverse Primer
0.1 µL
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2x SYBR Premix Ex TaqⅡ
10 µL
Sterile H2O
4.8 µL
Real-Time PCR はすべて Mini opticon（Bio-Rad）を用いて行った。また、結果のノー
マライズには β-actin を用いた。
表１. 使用したプライマーの配列
ERRα-F
5’-ACA AAC GGC GGC CAG AGG TG
ERRα-R
5’-CCA CCA GCA GAT GCG ACA CCA
ERRβ-F
5’-CCC AAG CGC CTG TGC CTC GT
ERRβ-R
5’-GTG GCC CGG GCA GTT GTA CTC G
ERRγ-F
5’-TGT CCC CGA CAG TGA CAT CAA AGC
ERRγ-R
5’-CCA TGC ACT CTG GAG GAG GCT CA
ERα-F
5’-TCG GCT GCG CAA GTG TTA CGA
ERα-R
5’-TGG CAG CCC TCA TGT CTC CTG A
ERβ-F
5’-TCC GTC TGG CCA ACC TCC TG
ERβ-R
5’-CGA AGC GTG TGA GCA TTC AGC A
shp-F
5’-CCG GCC ACA ACC CTC ACT GG
shp-R
5’-GCA CGG AGG CCT GGC ACA T
β-actin-F
5’-AGC TGC GTG TGG CCC CTG AG
β-actin-R
5’-GGG ACA GCA CAG CCT GGA GG
5） Western blot法
生後6日の精巣上体サンプルからタンパク質を抽出し、Bio‐Rad Protein Assayを用い
て定量を行った。10% Sodium dodecyl sulfate (SDS)添加のpolyacrylamide gelにて
電気泳動を行った後、polyvinilidene difluoride (PVDF)膜(Nippon Genetics)に転写し、
スキムミルク(Wako)で一晩ブロッキングを行った。1次抗体としてERRβ（ぺルセウスプロテ
オミクス)を1時間作用させ、2次抗体としてgoat anti-mouse IgG-HRP (Santa cruz
Biotechnology)を1時間作用させた後、ECL Plus Western Blotting Detection
System (GE HealthCare)により発光させ、ChemiDoc XRS‐J (Bio-Rad)で検出した。
その後、Quantity Oneソフトウェア(Bio-Rad)にて定量した。
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4．結果
組織学的な解析では、新生児期にgsk4716とDESの同時投与群、DES、E2、gsk4716、
各種薬剤を投与した後、2ヶ月齢で精巣上体を取り出してヘマトキシリン・エオジン染色を行っ
た。しかし、固定条件や使用したパラフィンの質、実験者の手技等の問題があり、毒性を正しく
評価できる程度の切片を得ることができなかった。対照群（コーン油投与群）とDES投与群の
組織像をFig. 1に示した。
新生児期マウスに5日間各種薬剤を投与し、生後6日の精巣上体でERRβのmRNA発現
量を解析したところ、対照群では発現が見られなかったが、以前の我々の結果と同様、DES
投与群では発現が見られた。さらに、gskとDES同時投与群ではDES投与群の4倍程度の発
現量であった。また、E2投与群でも若干の発現がみられた（Fig. 2）。さらに、他の関連が深い
レセプターであるERRα、ERRγ、ERα、ERβ、shpについてmRNA発現量を解析した結果、
ERRγのE2投与群で16倍、shpのgskとDES同時投与群で6倍増加していたがそれ以外の遺
伝子の発現は有意に変化しなかった。（Fig. 3）
精巣上体においてDES投与群とgskとDES同時投与群のERRβのmRNA発現量が増加し
ていたことから、次はタンパク質の量に着目し、ウェスタンブロット法による定量解析を行った。
その結果、DES投与群ではERRβタンパク質が減少していた。gsk4716投与群とgskとDES同
時投与群では対照群とほぼ変わらず、E2投与群のみタンパク質の発現量が増加していた
（Fig. 4）。
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A
B
Fig.1 生後2か月における対照群の精巣上体の組織像（A）およびDES投与群の精巣上体の
組織像（B）。
Fig. 2 定量PCR法を用いて解析した、生後6日マウスの精巣上体におけるERRβの
mRNA発現量。
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Fig. 3 生後6日マウスの精巣上体におけるERRα、ERRγ、ERα、ERβ、shpのmRNA発現
量。各遺伝子の対照群(コーン油投与群)における発現量を1とした。
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Fig. 4 生後6日マウスの精巣上体におけるERRβタンパク質の発現量。対照群(コーン油投与
群)における発現量を1とした。
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5．考察
本研究ではDESによる内分泌撹乱作用にERRを介する作用が関与しているか否かを明ら
かにするため、ERRβ、ERRγのアゴニストであるgsk4716を用いて解析を行った。ERRβの
mRNA発現量を見ると、gskとDES同時投与群ではDES群よりもさらに強くERRβの発現を誘
導していた（Fig. 2）。
ERRβの他、各種遺伝子についてmRNAの発現量を解析した。生後6日の精巣上体は1
mg程度と微量であり、RNA抽出、ゲノムDNA消化、逆転写、リアルタイムPCRという多くの段
階を経るうちに定量性が失われていったと考えられる。今回の実験では、等量のRNAから開
始して解析を進めたが、最終的なリアルタイムPCRの段階で内部標準遺伝子であるβアクチン
の量に100～1000倍以上の差が出た。また、リアルタイムPCRは同一サンプルをtriplicateで
行っていたが、ばらつきが非常に大きかった。これらのことから、正確な定量を行うには手技の
向上が必要なのはもちろんだが、一つのサンプルを数匹から十数匹のプールにすることが必
要だと考えられた。
ERRβタンパク質の解析では、DES投与群でmRNAの発現量が増加していたにも関わらず、
タンパク質の発現量が減少していた。この結果は当研究室の佐藤の研究でも見られ[7]、結果
が一致したと言える。可能性の一つとして、DESのインバースアゴニスト作用により転写共役因
子と解離して不活性化されたERRβタンパク質が分解され、フィードバック機構によりmRNAの
発現が増加している、ということが考えられる。一方、gskとDES同時投与ではgsk4716がDES
の作用と拮抗しているかのようにも見えるが、これについてはmRNA量が減少していた。
本研究により、gsk4716による内分泌撹乱作用を明らかにするという本来の目的は十分に
達成できなかったが、以前の当研究室での研究結果と今回の研究結果が一致するなど、有用
な情報を得られた。
14
謝辞
本研究にあたり、直接実験技術の御指導と多くの有益な御助言を頂きました佐藤浩二助教
に心より感謝いたします。
15
引用文献
1． Schrager S, Potter BE, Diethylstilbestrol exposure. Am Fam Physician 69:
69 2395‐
400, (2004)
2． Herbst AL, Ulfelder H, Poskanzer DC, Adenocarcinoma of the vagina.
Association of maternal stilbestrol therapy with tumor appearance in young
women． N Engl J Med 284:
284 878-81, (1971)
3． Titus‐Ernstorff L, Troisi R, Hatch EE, Hyer M, Wise LA, Palmer JR, Kaufman
R, Adam E, Noller K, Herbst AL, Strohsnitter W, Cole BE, Hartge P, Hoover RN,
Offspring of women exposed in utero to diethylstilbestrol(DES): a preliminary
report of benign and malignant pathology in the third generation. Epidemiology
19:
19 251‐7, (2008)
4． Sato K, Fukata H, Kogo Y, Ohgane J, Shiota K, Mori C, Neonatal exposure to
diethylstilbestrol alters the expression of DNA methyltransferases and
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53 331‐7,
(2006)
5． Adachi T, Koh KB, Tainaka H, Matsuno Y, Ono Y, Sakurai K, Fukata H, Iguchi
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6． Couse JE, Dixon D, Yates M, Moore AB, Ma L, Maas R, Korach KS, Estrogen
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238:
238 224‐38, (2001)
7. 佐藤舞子, Expression analysis of estrogen related receptor induced by neonatal
exposure to diethylstilbestrol. 平成23年度新潟薬科大学薬学部卒業研究
16

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