岐阜薬科大学特別研究費報告書 (2008) 1 ―平成２０年度岐阜薬科大学特別研究費（プロジェクト）― ドラッグデリバリーシステム(DDS)を利用した点眼薬の後眼部への薬物移行竹内洋文１．緒 1) 言わが国では急速な高齢化に伴い緑内障、糖尿病網膜症、、原英彰 2) 討を行ってきた。その結果、本年度の研究において、蛍光物質であるクマリンで標識したリポソームを調製し、マウ加齢黄斑変性症、網膜色素変性症などの後眼部疾患が急増スや培養細胞におけるリポソームの挙動を評価し、薬物送し（推定潜在患者数 1000 万人）、有効な薬物療法が望まれ達に必要な微粒子の設計要件をほぼ明らかにした。その概ている。最も好ましい剤形としては点眼を挙げることが出要を以下に報告する。来る。しかし、眼は眼球表面及び内部の組織を保護するた２．実めに涙液層での希釈と分解、房水の流れによる排泄など外部からの進入物質に対する巧妙な防御機構を備えており、後眼部に特異的に薬物を送達させることは非常に困難で験蛍光標識リポソームの調製リポソームの調製は薄膜水和法にて行った。リン脂質、ある。現在、これらの疾患のように後眼部への薬物送達が負電荷脂質、コレステロール、蛍光標識物質としてクマリ必要な場合には、臨床的に硝子体内への注射、結膜下へのンを用いた脂質薄膜を水和することでマイクロサイズの注射あるいはプラグ（薬液を染み込ませたデバイス）を硝 MLV（multilamellar vesicle）を調製した。得られた MLV 子体内に埋め込むなどの方法が取られている。いずれの方をエクストルーダーもしくは超音波処理を施すことで平法も、眼球に傷をつけること、繰り返し投与できないこと、均粒子径が約 100nm のサブミクロンサイズリポソーム副作用の回避が難しいことなどの多くの問題を抱えてい (ssLip)を調製した。る。このような背景から、後眼部への非侵襲的な薬物送達原子間力顕微鏡（AFM）を用いたリポソームの液中での形状観察の開発は極めて重要な研究課題となっている。原らのグル蒸留水中に分散させた ssLip を AP（3-aminopropylethoxy ープは、緑内障の病態である視神経･網膜の神経細胞保護 silane）で表面修飾したマイカに吸着させ、液中タッピン作用を目的とした眼底疾患治療薬の研究開発の過程で、緑グモードにて観察を行った。内障治療薬であるチモロールや塩酸ブナゾシンは、点眼す角結膜上皮細胞を用いたリポソームの安全性評価ることによって眼底にこれら薬物が到達することを見出ヒト角膜上皮細胞（HCE-T）、ヒト結膜上皮細胞（Chang した。また、そのルートは外眼部を通って強膜から眼底に conjunctiva cell）を 96well plate に播種し、７日間培養した到達することを明らかにした。一方、竹内らのグループでものを用いた。リポソーム懸濁液を投与後、MTS 試験には、微粒子薬物キャリアーの研究を遂行する過程で、適切て評価した。な微粒子設計を行うと、粘膜組織内にも粒子が取り込まれ、マウスを用いたリポソームの後眼部への送達の評価その結果薬物送達が可能であることを見出してきた。また、蛍光標識リポソーム 3μl をマウスに点眼投与し、眼球眼粘膜においても同様な微粒子薬物キャリアーの効果が摘出後、眼球の凍結切片を作成し蛍光顕微鏡で観察するこあることを見出し、培養細胞でその安全性のデータを蓄積とで行った。また網膜の IPL（inner plexiform layer）の蛍してきた。光強度を ImageJ により定量的に評価した。本研究では、両グループがこれまでの研究成果を吟味し、系統的に微粒子キャリアーの有効性を証明し、新しい後眼部薬物送達用ＤＤＳを開発することを目的として検 1) ３．結果・考察脂溶性蛍光物質を封入した種々のリポソームをマウス岐阜薬科大学薬物送達学大講座製剤学研究室、2) 岐阜薬科大学生体機能解析学大講座薬効解析学研究室（〒502-8585 岐阜市三田洞東５丁目６－１）1) Laboratory of Pharmaceutical Engineering, Department of Drug Delivery Technology and Science, 2) Laboratory of Molecular Pharmacology, Department of Biofunctional Evaluation, Gifu Pharmaceutical University (5-6-1 Mitahora-higashi, Gifu 502-8585, JAPAN) 竹内洋文ら：ドラッグデリバリーシステム(DDS)を利用した点眼薬の後眼部への薬物移行 2 に点眼投与後 30 分の、網膜の蛍光顕微鏡写真を Fig.1 に示す。これらの写真から、粒子径をサブミクロンサイズに (a) H/P = 0.31 (b) H/P = 0.81 制御したリポソームの場合は、網膜において粒子の蛍光が観察され、後眼部へリポソームが到達していることが明らかとなった。点眼投与してない反対側の網膜では蛍光は観察されず、全身血流を介して網膜部位に到達しているのではないことも確認された。また、リポソームがマイクロオーダーの場合には後眼部で蛍光物質は観察されず、粒子径が後眼部送達の重要な要因であることが示された。 (a) GCL IPL (b) GCL IPL Fig. 2. AFM images of ssLip adsorbed onto surface-modified mica (scale: 4 µm2 ×200 nm). (a) EPC ssLip, (b) DSPC ssLip. (c) より硬い粒子として、サブミクロンサイズの蛍光標識 GCL IPL ポリスチレンナノ粒子を選択し、同様に点眼投与したが、網膜において粒子の蛍光が観察されなかった。ポリスチレンナノ粒子はサイズも 100nm であり、前述の硬さ指標値 (d) (e) (f) GCL IPL GCL GCL IPL IPL は、ほぼ 1 であることが確認されている。このようなポリマー粒子では後眼部移行が認められなかったことから、微粒子の構成成分には生体と親和性の高いものを用いる必 50µm 要性があることが示唆された。網膜の IPL（inner plexiform layer）の蛍光強度を ImageJ により定量化し、経時的な変化を評価した。その結果、い Fig. 1. Epifluorescence microscopic images of the retina 30 min after eyedrop administration. (a) Untreated, (b) contralateral eye, (c) EPC MLV, (d) DSPC MLV, (e) EPC ssLip, (f) DSPC ssLip. GCL: ganglion cell layer, IPL: inner plexiform layer. ずれの測定時間においても、DSPCssLip が最高値を示し、また、MLV リポソームの場合は、いずれの時間においてもほとんど蛍光が観察されなかった。また、ssLip の場合、点眼後 30 分でピーク値を示し、その後は急激な蛍光強度の低下が認められた。これらの経時変化に関しては、今後 Fig.1 に示すように、EPC を用いた ssLip をマウスに点眼投与したときに比べて DSPC を用いた ssLip を点眼投与さらに検討をする必要があると考えている。角結膜上皮細胞を用いたリポソームの安全性評価ではしたときの方が網膜においてより強い蛍光が観察された。細胞生存率の顕著な低下は認められず、リポソームは安全 DSPC は EPC より脂質二重膜としての相転移温度が高く、性の高いキャリアーであることが示された。一般にはその脂質膜構造が rigid であるとされている。す以上の結果は、点眼による後眼部への薬物送達が可能なわち、同じサブミクロンサイズリポソームであってもであることを強く示すものである。本年度の検討により後 rigid なリポソームの方が後眼部送達機能が高いことを示眼部薬物送達を目的とした点眼用薬物微粒子キャリアー唆している。の設計に関して、サイズ、硬さというファクターが重要で我々の研究室では、サブミクロンサイズのリポソームあるという設計指針を明確にすることができた。後眼部へのこの rigidity（硬さ）を AFM を用いたリポソームの形状の移行過程に関しては、まだ明確な実験結果は得られてい観察に基づいて表現できることを明らかにしている。すなないが、全眼に関して蛍光顕微鏡観察を行うと、角膜付近わち、AFM 観察のために基板上に固定された時点で、柔の透過は認められず、結膜近傍での高い蛍光が観察されてらかいリポソームは変形し、測定される粒子径（高さ方向）おり、前眼部から徐々にリポソーム粒子が移行しているこが減少すると考えられる。従って、別途液中で動的光散乱とが示唆されている。さらに検討を加え、この移行メカニ法により測定した粒子径と比較することにより、この変形ズムは明らかにしていきたい。また、実際の薬物封入リポ度を評価し、変形が大きいものを柔らかい粒子と判定するソームでの後眼部移行性評価も開始しており、本微粒子キことができる。本手法を用いて今回検討したリポソームのャリアーの薬物治療における有効性がより明らかになっ硬さ評価を行ったところ、Fig.2 に示すように、リン脂質ていくことが期待される。として EPC を用いた ssLip では潰れた形状が観察され硬さ指標値は小さくなり、DSPC を用いたリポソームでは半球状の粒子が観察され、硬さ指標値は増大し、rigid な粒子であることを明確にできた。謝辞：本研究の実験に中心的に携わった製剤学研究室廣中耕平君、薬効解析学研究室井口勇太君、種々ご協力いただいた嶋澤雅光准教授（薬効解析学）、戸塚裕一准教授（製剤学）の各位に感謝します。