2 x M13 Primer Mix I. 製品説明 ＊2） 本品は、Gene RED PCR Mix と組み合わせて使用すること ＊3） で、迅速かつ簡単に M13 プライマーを使用するコロニーPCR インサート DNA1 kbp あたり 10 sec.を目安にし、1 kb 以下の場合は 10 sec. にします。 ＊4） を行うことができる製品です。 コロニー（菌体、培地）は多量に持ち込まないで下さい。また、爪楊枝を 10 秒 以上浸したままにすると、反応液が爪楊枝に吸収されることがあります。 Gene RED PCR Mix には、Loading Dye がすでに含まれているため、PCR 溶液をそのまま電気泳動に使用できます。 II. 保存 V. M13 プライマーについて －20℃ M13 プライマーは、M13 系あるいは pUC 系ベクターのマルチ 凍結融解の繰り返しは避けて下さい。融解後はチューブに小 クローニングサイトの両端にアニーリングします。そのため、 分けし、－20℃での保存をお勧め致します。 M13 系ベクターにクローニングされた DNA 断片のインサート チェックやシークエンスする際のプライマーとして使用できま III. 製品内容 2 x M13 Primer Mix す。 1.2 ml x 2 本 (96 回用) *1) ＜M13 primer の pUC18 におけるアニーリング部位＞ ＊１) 本品には、PCR を 50µl の系で約 96 回行える量が含まれています。 ＜組成＞ M13 forward primer → 5' AAGTTGGGTA ACGCCAGGGT TTTCCCAGTC ACGACGTTGT AAAACGACGG 0.8 pmol/μl M13 forward primer (GTTTTCCCAGTCACGACGTT) 0.8 pmol/μl M13 reverse primer (GGAAACAGCTATGACCATGA) 0.1 mmol/l 3' TTCAACCCAT TGCGGTCCCA AAAGGGTCAG TGCTGCAACA TTTTGCTGCG 5' CCAGTGCCAA GCTTGCATGC CTGCAGGTCG ACTCTAGAGG ATCCCCGGGT Tris-HCl (pH 7.5) 3' GGTCACGGTT CGAACGTACG GACGTCCAGC TGAGATCTCC TAGGGGCCCA 〔Multi cloning sites〕 IV. 使用方法 5' ACCGAGCTCG AATTCGTAAT CATGGTCATA GCTGTTTCCT GTGTGAAATT ・ 本品以外に PCR 試薬の Gene RED PCR Mix（ニッポンジ 3' TGGCTCGAGC TTAAGCATTA GTACCAGTAT CGACAAAGGA CACACTTTAA ← M13 reverse primer ーン製）を用意します。 「大腸菌プラスミド（M13 系ベクター）のインサートチェック」 ① 必要本数分の Gene RED PCR Mix を 1.5 ml 容チュー ブに分取する。（1 反応あたり 25 µl） ② 2 x M13 Primer Mix を等量添加し、ピペッティングで軽 く混合する。 ③ 混合溶液を 50 µl ずつ PCR 用チューブに分注する。 ④ 爪楊枝またはチップでコロニーを軽く突いて、③の溶液 ＜主な M13 系ベクター（no insert）の PCR 増幅産物サイズ＞ ・ pUC18/19 ® 121 bp ・ pGEM -T easy 250 bp ・ pBluescript® Ⅱ 247 bp ・ λZAP® Ⅱ 244 bp ・ pT7Blue 172 bp ・ pT7Blue2 388 bp VI. トラブルシューティング 中で懸濁する。 トラブル ＜PCR 溶液調製＞ ⑤ Gene RED PCR Mix (2 x ) 25 μl 2 x M13 Primer Mix 25 μl 少量 Total 50 μl インサートの GC 含量が高い場合、変性温度を上げてみる 増幅しない、増 幅効率が悪い ローコピーベクターの場合には、 ①サイクル数を 25 →30 cycles に上げる ②伸長時間を、10 sec./kb → 20 sec./kb に伸ばす 直ちに PCR を行う。 ＜PCR サイクル＞ ⑥ 菌体、培地の持ち込み量を減らす ＊2） コロニー 対 策 バンドがスメア 菌体、培地の持ち込み量を減らす 94℃ 3 min. －になる PCR サイクル数を減らす（～25 cycles） 94℃ 20 sec. エキストラ 菌体、培地の持ち込み量を減らす 55℃ 20 sec. バンドがでる アニーリング温度を 2℃ずつ上げてみる 72℃ 10 sec./kb＊３） 25 cycles PCR 後、各反応液の５～10 μｌをそのままアガロースゲルにアプラ イし＊4）、電気泳動でチェックする。 本製品は、試薬（試験研究用）として販売しているものです。 医薬品の用途には使用しないでください。 株式会社ニッポンジーン 〒930-0834 富山市問屋町 1-8-7 TEL 076-451-6548 E-mail [email protected] http：//www.nippongene.com FAX 076-451-6547 HO1209
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