遺伝子解析システム Application Information No.3 CEQ / GeXP 繰り返し配列のあるPCR産物の ダイレクトシークエンス トランスフォーマントからダイレクトシークエンスをする時に、テンプレート中に繰り返し配列が存在すると、 きれいにシークエンスが読めないという症状があります。そこで原因と解決策を探ってみました。 ここまでは正確な配列が読める ここからクオリティが低下 まずはプラスミド DNA をテンプレートとした PCR 産物のダイレクトシークエンスがあったので、 プラスミド DNA を精製してこれをテンプレートとしてシークエンスを実施しました。 正確な配列が読める 読めなかった位置以降の配列も問題なく配列を 読むことができた。 シークエンステンプレートになにか原因がありそう・・・ ⇒プラスミド DNA→PCR 産物になる段階でテンプレートに何らかの問題が発生しているのでは？ Materials & Methods ルーチンワークで使用している DNA Polymerase で PCR 産物を作成し、精製後にその PCR 産物をシークエンス し、人為的にトラブルを再現しました。 ① PCR 産物の確認 #1 #8 アガロースゲル泳動で 1 本の明瞭なバンドが 確認されたので、シークエンスしてみると･･･ ② この PCR 産物をシークエンスすると、初めと同じような結果が得られました。 正確な配列が読める コールが等間隔 ここから読めない コールが不均一 T の繰り返し配列を DNA polymerase が Replicate している時に 酵素がスリップし、T の繰り返し配列後に複数の PCR 産物ができ ている（テンプレートのコンタミが生じている）。 Result & Discussion 繰り返す配列を増幅する際に DNA Polymerase がスリップし、その結果 PCR テンプレートがコンタミネーションして いるようです。 そこで PCR を行う際に Proof reading 機能のついた High Fidelity DNA polymerase を使用してテンプレートを作成し、 シークエンス反応を行いました。 High Fidelity DNA polymerase とは？ 間違って組み込まれた塩基を正しい塩基に修正する 3’→5’エキソヌクレアーゼ（校正）活性がある酵素 ① PCR 産物の確認 #1 #8 アガロースゲル泳動で 1 本の明瞭なバンドが 確認されました。 ② High Fidelity DNA polymerase を使用することで、シークエンスデータのクオリティが改善されました。 正確な配列が読める コールが等間隔 ここからもきれいにシークエンスが読める コールが等間隔 Conclusion 繰 り 返 し 配 列 が 予 測 さ れ る テ ン プ レ ー ト を PCR 作 成 す る 場 合 、 3’ → 5’ エ キ ソ ヌ ク レ ア ー ゼ 活 性 の あ る DNA polymerase の使用は、正確なシークエンスをえるためにも有用な手段です。 AI-C-003_0802a
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