1538 ブラジルの小児下痢症患者か らの腸管付着性大腸菌(局 在性) の検出 と分離菌 の血 清型 大 阪府 立 公 衆衛 生 研 究 所 塚 本 定 三 木 本 達 雄 ブ ラジル ペ ル ナ ム ブ コ大学 マ ル セ ロ ・マ ガ リ エ ス 京 都大 学 医 学部 竹 Key words: 田 文 (平 成4年7月10日 受 付) (平成4年8月7日 受 理) enteroadherent serotype, 美 Escherichia coli , localized adherence, diarrhea. 要 旨 付 着 性 大 腸 菌(局 在 性)の 検 出 をNataro et al.が 報 告 したDNA (EAF)プ ロ ー ブを 用 い た コ ロ ニ ー ハ イ ブ リダ イ ゼ ー シ ョン 法 で 試 み ,HeLa細 胞 へ の 付 着 性 と比 較 し た 結 果,EAFプ ロ ー ブ 法 は感 受 性 特難 , に お い て培 養 細 胞 付 着 性 を 調 べ る 方 法 と比 べ て遜 色 な か った .そ こで,ブ ラ ジ ル の 小 児 下 痢 症 患 者 お よ び 健 康 者 お の お の126名 を 対 象 に,付 着 性 大 腸 菌 の 検 出 を 試 み た .EAF陽 性 の大腸 菌 は下痢 症患 者 の うち29名(23.0%),健 康 者 の う ち15名(11 .9%)か ら検 出 さ れ た が ,そ の う ち の お の お の23名(18.3%), 血 清 型 に属 す る も の で あ っ た.そ の た め,EAF陽 血 清 型 に属 す る 大 腸 菌 は 下 痢 症 との 関 連 性 が 深 い も の と想 像 され た .検 出 頻 度 の 高 い 血 清 0111: H2,0119: H6で あ るが ,こ れ ら は す べ てEPECの 血 清 型 嘱 す る も の で,そ 7名(5.6%)か ら 分 離 され たEAF陽 性 でEPECの 型 は055:H-, の な か で も0111:H2は る.ま た,EAF陽 性菌を まEPECの 下 痢症 患者 のみ に検 出 された ため 性 でEPECの 血 清型 に属 さない が ,他 の 血 清 型 に 比 べ て 病 原 性 が 強 い と 思 わ れ ,検 出頻 度 が 高 か っ た088:H25は 下痢 原性 が疑 わ れ る. 序 文 着 形 態 の 違 い か ら 局 在 性(localized),拡 下 痢 を 惹 起 さ せ る 大 腸 菌 は 下 痢 原 性 大 腸 菌 と総 称 さ れ,腸 管 病 原 性 大 腸 菌(EPEC),腸 大 腸 菌(EIEC),毒 素 原 性 大 腸 菌(ETEC),腸 出 血 性 大 腸 菌(EHEC)の4種 最 近 に な っ て,EIEC, も該 当 せ ず,し 管侵入性 管 類 が 知 られ て いた ETEC, か もHeLaお EHECの . いず れ に よ びHEp-2細 胞 に付 (diffuse)お 散 性 よ び 集 合 性(aggregative)の3種 に 分 類 さ れ て い る2)4).今 回 は,そ に 付 着 す る 大 腸 菌 の 検 出 を,ブ 類 の うち の局 在 性 ラジ ル の 小 児 の 下 痢 症 患 者 お よ び 健 康 者 を 対 象 に,DNAプ ロー ブ に よ る コ ロ ニ ー ハ イ ブ リダ イ ゼ ー シ ョ ン 法 に よ り 試 み,培 養 細 胞 付 着 性 を 調 べ る 方 法 と比 較 し た . 着 す る 大 腸 菌 が 下 痢 症 患 者 か ら 見 い 出 さ れ1)2),腸 さ ら に 検 出 さ れ た 菌 株 の 血 清 型 を 調 べ ,EAECと 管 付 着 性 大 腸 菌(Enteroadherent EPECの coli, EAEC)と Escherichia 名 付 け ら れ た3).EAECは 別 刷 請 求先:(〒537)大 その付 阪 市東 成 区 中道 一 丁 目3-69 大 阪府 立 公 衆衛 生 研 究所 塚本 定三 関 連 性 お よ び病 原 性 に つ い て も考 察 し た. 材 料 と方 法 材 料:ブ ラ ジ ル の 東 北 部,ペ ル ナ ム ブ コ州 レシ 感 染 症 学雑 誌 第66巻 第11号 1539 腸管付着性大腸菌の検 出と血清型 フ ェ市 に お け る0∼3歳 の 小 児 下 痢 症 患 者,お び 同 年 齢 の 健 康 者 お の お の126名 3∼5個 か ら,1名 につ き ロ ー ブ を 用 い た コ ロ ニ ーハ イ ブ リダ イ ゼ ー シ ョ ン 試 験:局 分 離 した554株 に つ い て,EAFプ の 局 在 性 付 着 を 調 べ,結 adherence factor, EAF)を 検 出 す る た め の プ ロー 性 の 両 者 で 陽 性(弱 ブ(EAFプ ロ ー ブ)は,ク ロ ー ニ ン グ され た プ ラ は43株,陰 り 調 整 し た.プ 1-Bam H1 P〕dCTPを B. Kaper博 ラ ス ミ ッ ド pJPN16よ ling system, Amersham)に 取 り 出 し,〔 α-32 報 告5)に 準 じ た.ト を 接 種 し て 一 夜 培 養 し,フ 1.0 MTris MNaCl, K ロ ー ブ を 用 い て常 法 に 従 っ て ハ 実 施 し,オ for- ー トラ ジ ナ グ ラ フ ィー に よ 培 養 細 胞:Scaletsky et 報 告2)に 準 じ, 胞 を プ ラ ス チ ッ ク チ ェ ン ノミー ス ラ イ ドで37℃,48時 回PBSで 間,5%CO2存 上 の 後 の実 ロー ブ に よ る ハ イ ブ リダ イ ゼ ー シ ョ ン 試 験 を 用 い て 実 施 し,陽 性 を示 した 株 につ い て 胞 へ の 局 在 性 付 着 を 確 認 し た.Table2 (23.0%),健 痢 症 患 者126名 康 者126名 の う ち29名 の う ち15名(11.9%)か 性 の 大 腸 菌 が 検 出 さ れ た.こ ら れ らEAF陽 性 の 大 腸 菌 を 検 出 し た 下 痢 症 患 者 の う ち,23名 (18.3%)か ら 分 離 さ れ たEAF陽 性 菌 はEPECの 血 清 型 に 属 す る も の で あ っ た が,6名(4.8%)か 性 菌 はEPECの さ な い も の で あ っ た.一 方,健 血 清型 に属 康 者 に つ い て は, した.供 calf 加 え たEagle MEM serum, Table 1 Sensitivity and specificity probe in detecting Escherichia ized adherence to HeLa cells 在 下 で 培 養 した.3 洗 浄 し,2%fetal mannoseを of the EAF coli with local- 1%D- mediumと 交 換 試 菌 を ト リ プ ト ソ イ 液 体 培 地 で37℃,18 時 間 培 養 し た も の をEagle し て1/20に MEM mediumに 対 な る よ う に 加 え,37℃,30分,5%CO2 で 培 養 し た.PBSで5回 medium 洗 浄 し,上 を 加 え,37℃,3時 記 のEagle 間,5%CO2で Table 培 養 し た.そ ル 固 定,ギ の 後,PBSで3回 洗 浄 し,メ タノー ム ザ 染 色 を 行 っ て 検 鏡 し た. 血 清 型 別:0お 定 し た.0型 よ びH型 別 に よ り血 清 型 を 決 別 は100℃,1時 間 加 熱 した も の に つ い て01∼170ま た.H型 あ っ た.以 胞 を 用 い て細 胞 へ の局 在 性 付 着 を 観 察 し た.HeLa細 MEM al.の れ ら 細 胞 付 着 性 は 高 い 一 致 率 を 示 し た の で,以 験 はEAFプ るい 存 在 した.こ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン 試 験 とHeLa ら 分 離 さ れ たEAF陽 り結 果 を 得 た. HeLa細 結 果 か ら,ハ EAF陽 の 後, 50% 示 した もの で あ っ た.ま た, 2つ の 方 法 で の 一 致 率 は99.5%で に 示 し た よ う に,下 それ ぞれ処 stringency, 胞 付着 胞 で 陰 性 を 示 し た も の,あ は そ の 逆 が お の お の2株,1株 HeLa細 Tris+1.5 間 固 定 し た.そ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン(high mamide)を 1.0M (2mg/ml)で 燥 後,80℃,2時 標 識 し たEAFプ の上に供試菌 ィ ル タ ー を0.5M (pH7.0), Proteinase 理 し,乾 et al.の リプ ト ソイ 寒 天 培 地 上 に ニ ト ロ セ ル ロ ー ス フ ィル タ ー を 置 き,そ NaOH, label- よ り標 識 し て 用 い た. 供 試 菌 の コ ロ ニ ー プ ロ ヅ トはMoseley 示 した. 陽 性 ± を 含 む)を 性 を 示 し た も の は508株 か わ ら ずHeLa細 りSal 用 い て マ ル チ プ ラ イ ム 法(DNA 果 をTable1に 胞 へ ハ イ ブ リダ イ ゼ ー シ ョン試 験 で 陽 性 で あ る に もか 士 よ り分 与)よ fragment(1.0-kb)を ロー ブ を 用 い ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン 試 験 とHeLa細 在 性 の 付 着 因 子(EPEC ス ミ ッ ド PJpN16(J. 績 た ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン 試 験 とHeLa細 の 大 腸 菌 を 分 離 し て 試 験 に 供 し た. DNAプ 成 よ で の 自家 免 疫 血 清 を 用 い て実 施 し 別 はH1∼56の 従 っ て 行 っ た. 平 成4年11月20日 抗 血 清 を 用 い て 常 法6)に 2 Detection coli by EAF probe and 126 age-matched of enteroadherent in 126 infants healthy Escherichia with diarrhea controls, in Brazil 塚本 1540 Table 3 Serotypes coli isolated of enteroadherent 定三 他 Escherichia 考 by EAF probe 察 下 痢 症 の発 症 に は 原 因菌 が 腸 管 内 で 増 殖 す る こ とが 前 提 条 件 で あ るが,そ れ に先 立 って 菌 が 腸 管 内 に定 着(粘 膜 細 胞 に 付 着)し な け れ ば な らな い. 古 くか ら,乳 幼 児 の 下 痢 症 の原 因 菌 と して 発 見 さ れ た に もか か わ らず,そ いEPECに HeLa細 の発 症 機 作 が 明 らか で な つ い て は,そ の 多 くがHEp-2お よび 胞 に 付 着 す る こ と,お よび そ の 付 着 形 式 に は 局 在 性,拡 散 性 の2種 類 が あ る こ とが報 告 さ れ て い る1)2).し か し,こ れ ら細 胞 に 付 着 す る もの はEPEC以 外 の大 腸 菌 に も み られ,さ ら に最 近 に な って 報 告 され た 細 胞 へ 集 合 性 に付 着 す る大 腸 菌 は,ほ と ん ど す べ てEPECの 血 清 型 に属 さ な い4)7).この よ うな細 胞 へ 付 着 す る大 腸 菌 を 総 称 し て 腸 管 付 着 性 大 腸 菌 と言 わ れ て い るが,そ の なか で も局 在 性 に付 着 す る も の は特 に 下 痢 症 との 関 連 * Non-adherent to HeLa 性 が 強 い と考 え られ て い る8)9). cells そ こ で,今 回 は局 在 性 に付 着 す る大 腸 菌 の検 出 7名(5.6%)か EPECの ら 分 離 さ れ たEAF陽 性 菌 は 血 清 型 に 属 す る も の で あ り,残 (6.3%)か ら 分 離 さ れ たEAF陽 た よ う に,EAF陽 31株(1名 H2 -(2株) H(8株), H6 EPECの 086: 0111: , 0119: 0142: H6 (1株)で H6 H40 (8株), H-(1株), 0153: H45 (2株), 088: (4株), H6 H25 OUT: H-(2株)で の 大 腸 菌45株 ば,す た. を 比 べ て み る と,2つ 胞 に 対 す る付 着 性H の方 法 で の 一 致 率 は99.5% で あ っ た.こ れ は,EAFプ ロー ブ に よ る腸 管 付 着 お い て,培 養 細 胞 に対 す る付 着 性 に 比 べ て遜 色 な ロー ブを 用 い る方 法 は,培 養 細 胞 で 付 着 性 を 観 察 す る よ り,成 績 を得 る ま で の 時 間 が か な り短 縮 され,か つ,結 果 の判 定 が 比 較 的 容 易 で あ る.EAFプ , あった. に,オ ロー ブ の か わ り リゴ ヌ ク レオ チ ドプ ロー ブを 用 い た方 法 も 報 告 さ れ て い るが11),いず れ に して も,プ ロ ー ブを , 標 識 す るた め に32Pを 用 い る こ と か ら,放 射 線 取 扱 い 施 設 や 標 識 プ ロー ブの 使 用 期 限 な ど の問 題 が 持 つ血 血 清型 に属 さな い に もか ぼ し ば 検 出 さ れ た .こ れ らEAF陽 の う ち,OUT:H-の2株 べ てHeLa細 シ ョン試 験 の 結 果 とHeLa細 は す べ て 下 痢 症 患 者 か ら で あ り, はEPECの か わ ら ず,し 088: 持 つ 血 清 群(H2 ロー ブ に よ る コ ロ ニ ー ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー い こ とを 示 して い る.EAFプ 性 で H2(1株) 健 康 者 か ら の 検 出 は な か っ た.ま た,088を 清 群 の5株 H (1株), (4株), ロー ブを 用 性 大 腸 菌 の検 出 法 が,感 受 性 お よび 特 異 性 の 点 に 0111: は040:H19(2 こ れ ら の 血 清 型 の うち,0111を H6,H-)の11株 H34 血清 方,EAF陽 H7(1株), OUT: 検 出)の 0127: あ っ た.一 1株), 示 し (1株), 血 清 型 に 属 さ な い14株 株),051: OUT: (6株), EAFプ 血 清型 に属 す る か ら血 清 型 の 異 な る2株 型 は,055: 0111: 性 でEPECの 報 告 したEAFプ い て 行 い,培 養 細 胞 に よ る方 法 と比 較 して み た. り8名 性 菌 はEPECの 血 清 型 に 属 さ な い も の で あ っ た .Table3に をNataroetal.10)の 性 を 除 け 胞 へ の局 在 性 付 着 が観 察 され あ り,今 後 は非 放 射 性 物 質 に よ る プ ロ ー ブ の標 識 を検 討 す べ き で あ ろ う.な お,2つ の方 法 で 一 致 し な か った3株 ロー ブ に よ る に つ い て は,EAFプ も の は付 着 遺 伝 子,HeLa細 胞 に よ る もの は細 胞 へ の 付 着 とい う検 出す る対 象 物 が 異 な っ て い るせ い か も しれ な い. ブ ラ ジ ル の 小 児 下 痢 症 患 者 お よ び健 康 者 か ら 感 染 症 学 雑誌 第66巻 第11号 1541 腸管付着性大腸菌の検出 と血清型 EAFプ ローブを用 いて局 在 性 の腸管 付着 性大 腸 菌 を 検 出 して み る と,前 者 か ら23.0%,後 11.9%も のEAF陽 者か ら 性 の 大 腸 菌 が検 出 され た.こ の 成 績 か らみ る と,ブ ラ ジ ル の 小 児 下 痢 症 の 原 因 と して局 在 性 の 腸管 付 着 性 大 腸 菌 は か な り重 要 な 比 重 を 占め て お り,ま た,健 康 者 か ら も よ く検 出 され る こ と よ り,本 菌 は ブ ラ ジル に深 く浸 透 して い る こ とが 考 え られ る9)12).この 傾 向 は他 の 研 究 者 の ブ ラ ジル に お け る成 績 に も見 られ,さ ラジ ル 以 外 で も メ キ シ コ,チ ら に,ブ リな どで も 同様 な成 績 が 報 告 さ れ て い る8)13).これ らの こ とか ら,本 菌 は 中 南 米 を 中 心 と した地 域 に広 く分 布 し て い る も の とお もわ れ る. EAF陽 性 の 大 腸 菌 の うち で もEPECの 血清 型 に 属 す る 大 腸 菌 を検 出 した もの は,下 痢 症 患 者 で は18.3%,健 康 者 で は5.6%で あ る こ とか ら,こ れ ら の大 腸 菌 は,他 の研 究 者 も指 摘 して い る通 り14), 下 痢 症 との 関 連 性 が か な り深 い も の と推 定 で き る.今 回 の 私 達 の 成 績 で はEAF陽 検 出頻 度 の高 い 血 清 型 は055: 0119: H6で あ るが,こ 性 の大 腸菌 で H-, 0111: H2, れ ら はす べ てEPECの 血 清 型 に 属 す る も の で あ り,そ の な か で も0111: H2は 下 痢 症 患 者 の み に しか検 出 され な か った.そ れ ゆ え に,EAF陽 性 で0111: H2の 血 清 型 を 持 つ も の の病 原 性 は他 の 血 清 型 に 比 べ て 強 い の で は な い か と思 わ れ る.ま た,局 在 性 付 着 を示 す 大 腸 菌 でEPECの 血 清 型 に属 さ な い もの に お い て も,有 志 家 へ の 経 口投 与 で 下 痢 を 起 こ させ た報 告 が あ る が15),今 回 の 調 査 で も特 に 検 出頻 度 の高 い088: H25の 血 清 型 は 下 痢 原 性 が 疑 わ れ る. 現 在,腸 管 付 着 性 大 腸 菌 はそ の 分 類 学 的 位 置 に お い てEPECと の関 係 でや や混乱 を きた してい る.す な わ ち,EPECの な か で 付 着 因 子 を 持 って い る もの と持 っ て い な い も の が あ り,前 者 をclass IEPEC,後 者 をclass II EPEC10),あ をEAF+EPEC,後 告14)や,EPECに 者 をEAF-EPECと るい は 前 者 す る報 関 係 な く付 着 因子 を 持 って い る ものす べ て を 腸 管 付 着 性 大 腸 菌 とす る説 が あ る3).付 着 因 子,特 に局 在 性 を 示 す もの を 持 った 大 腸 菌 が,中 南 米 を 中 心 に 小 児 下 痢 症 の 原 因菌 と し て 主 流 を 占 め て い る 可 能 性 が あ る こ とか ら考 え 平 成4年11月20日 て,腸 管 付 着 性 大 腸 菌 の 分 類 学 上 の位 置 づ け を 明 確 に す る 必 要 が あ る. 本 研 究 の実 施 に当 た り,EAFプ プ ラ ス ミッ ドpJPN16を yland大 学 のJ. B. Kaper博 ロ ー ブを作 製 す るた め の 分 与 い た だ い た ア メ リカMar士 に感 謝 します. 本 研 究 の一 部 は財 団法 人 大 同 生命 厚 生 事業 団 の 平成3年 度 医学 研 究 助成 を受 け て実 施 した. 文 献 1) Cravioto, A., Gross, R. J., Scotland, S. M. & Rowe, B.: An adhesive factor found in strains of Escherichia coli belonging the traditional infantile enteropathogenic serotypes. Curr. Micribiol., 3: 95-99, 1979. 2) Scaletsky, I.C. A., Silva, M. L.M. & Trabulsi, L. R.: Distinctive patterns of adherence of enteropathogenic Escherichia coli to Hela cells. Infect. Immun., 45: 534-536, 1984. 3) Mathewson, J. J., Johnson, P. C., DuPont, H.L., Morgan, D.R., Thornton, S. A., Wood, L. V. & Ericsson, C.D.: A newly recognized cause of travelers' diarrhea: Enteroadherent Escherichia coli. J. Infect. Dis., 151: 471-475, 1985. 4) Nataro, J. P., Kaper, J. B., Robins-Browne, R., Prado, V., Vial, P. A. & Levine, M. M.: Patterns of adherence of diarrheogenic Escherichia coli to HEp-2 cells. J. Pediatr. Infect. Dis., 6: 829-831, 1987. 5) Moseley, S. L., Huq, I., Alim, A. R.M. A., So, M., Samadpour-Motalebi, M. & Falk ow, S.: Detection of enterotoxigenic Escherichia coli by DNA colony hybridization. J. Infect. Dis., 142: 892-898, 1980. 6) Ewing, W. H.: Edwards and Ewing's Identification of Enterobacteriace, 4th Ed., Elsevier Science Publishing Co., New York, 1986. 7) Vial, P. A., Robins-Browne, R., Lior, H., Prado, V., Kaper, J. B., Nataro, J. P., Maneval, D., Elsayed, A. & Levine, M. M.: Characterization of enteroadherent-aggregative Escherichia coli, a putative agent of diarrhea' disease. J. Infect. Dis., 158: 70-79, 1988. 8) Levine, M. M., Prado, V., Robins-Browne, R., Lior, H., Kaper, J. B., Moseley, S. L., Gicquelais, K., Nataro, J. P., Vial, P. & Tall, B.: Use of DNA probe and HEp-2 cell adherence assay to detect diarrheagenic Escherichia coli. J. Infect. Dis., 158: 224-228, 1988. 9) Gomes, T. A.T., Blake, P. A. & Trabulsi, L. 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Escherichia coli Exhibiting Localized Pattern among Infants with Diarrhoea in Brazil ―Incidence and Prevalence of of Serotypes― Teizo TSUKAMOTO & Tatsuo KIMOTO Osaka Prefectural Institute of Public Health Marcelo MAGALHAES Laboratorio de Immunopatologia Keizo Asami, Universidade Federal de Pernambuco , Brazil Yoshifumi TAKEDA Department of Microbiology, Faculty of Medicine, Kyoto University The incidence of enteroadherent Escheridhia coli exhibiting localized adherence to HeLa cells was investigated using the EAF probe (Nataro et al ., J. Infect. Dis., 152: 560-563, 1985)among 126 infants below 3 years of age along with 126 age-matched healthy controls in Brazil . The EAF probe proved to be sensitive and specific in detection of enteroadherent E . coli. EAF-probe positive E. coli was isolated from 23.0%of the infants with acute diarrhoea while the corresponding rate of isolation from healthy controls was 11.9%.EAF-probe positive E. coli strains belonging to the classical enteropathogenic E . coli (EPEC) serogrpoups were more often associated with diarrheal cases (18.3%)than with strains isolated from control healthy infants (5.6%).The predominant EAF-probe positive E . coli serotypes were 055:H-, 0111:H2 and 0119:116.These serotypes , especially 0111:112,were mainly isolated from cases with diarrhoea suggesting a strong causal association . Among the EAF positive non-EPEC serotypes, the most prevalent serotype was 088:125 and this represents a ,hitherto,unrecognized diarrheagenic E. coli serotype. 感 染症 学 雑 誌 第66巻 第11号
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