カイネティクス解析～ALP 活性の測定

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新しい紫外可視分析情報
Date 2015/01/28
210-UV-0029
カイネティクス解析～ALP 活性の測定
薬品や食品など幅広いライフサイエンス分野では、酵素－基
質の親和性や酵素活性を調べるために、酵素－基質反応の測定
と解析が行われています。V-700 series では、温調可能な特別
付属品と [カイネティクス解析] プログラムを組み合わせること
で、酵素活性値、Michaelis 定数 (Km)、最大速度 (Vmax) 、阻害物
質定数の解析、および日本薬局方で定められているカリジノゲ
ナーゼの活性値テーブルを作成することができます。ここでは、
代表的な酵素－基質反応を例に、V-700 series による酵素活性の
測定・解析方法をご紹介します。
<Keyword>カイネティクス、Michaelis-Menten、Lineweaver-Burk、
Hofstee、Eadie、日本薬局方、カリジノゲナーゼ
概要
酵素 E と基質 S とが酵素基質複合体 ES を作り、生成
物 P を生じ、生成物 P を分離した酵素は再生する反応モ
デルを考えます。
酵素 (E) + 基質 (S)
酵素基質複合体 (ES)
ここで P が生成する初速度 v は
Vmax
V × [S ]
v = max
式1
図 1 上) V-730+STR-773+CSP-909
下) [カイネティクス解析] プログラム
酵素 (E) + 生成物 (P)
K m + [S ]
で表されます。この式は、MichaelisVmax/2
Menten の式と呼ばれ、Vmax は [S] が無限
大の時の反応速度を示し「最大速度」、
Km は v が Vmax の 1/2 になる基質濃度を示
し「Michaelis 定数」と呼ばれています。
(1) 式に基づき、[S] に対し v をプロット
したものを Michaelis-Menten プロットと
Km
呼び、このプロットから Vmax や Km を求め
図 2 Michaelis-Menten プロット
る事ができます (図 2)。Vmax が大きいほど
最大活性が高いことを示しています。また、Km は酵素と基質の親和性を示し、Km が小さいほ
ど酵素と基質の親和性は高く、素早く複合体形成することを意味しています。一方、Km が大き
いほど酵素と基質の親和性は低く、ゆっくりと複合体形成することを意味しています。
具体的には、これら Vmax や Km を求めるために、分光光度計を用いて次の測定を行います。
① ある一定濃度の酵素溶液にある濃度となる様に基質を加え、反応生成物または基質の吸光
度の時間変化測定を行います。
② 反応開始時の傾きを初速度 v として求めます。
③ 基質の濃度を変えて同様に①②を行い、[S] vs v をプロットします。
図 2 のように Michaelis-Menten プロットから目視で Vmax や Km を求めると目視による誤差を
生じやすいため、通常は (1) 式を変形した直線プロットを用います。直線プロットとして
Lineweaver-Burk、Hofstee、Eadie プロットが知られており、Vmax や Km はこれらプロットの傾
き、縦軸または横軸の切片から求める事ができます。
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Lineweaver-Burk プロット： 1/[S] vs 1/v
1 Km
1
1
=
×
+
v Vmax [ S ] Vmax
式2
傾き=Km/Vmax
式 2 に基づいて、1/[S] vs 1/v をプロットします (図 3)。
最小二乗法により直線の傾き (a) と切片 (b) を求め、
式 3, 4 から Vmax および Km を算出します。最もよく
1/Vmax
用いられるプロットで、 [S] の小さい領域でのプロッ
トに有効です。
Vmax =
1
b
-1/Km
式3
図 3 Lineweaver-Burk プロット
K m = a × Vmax
式4
Hofstee プロット： [S] vs [S]/v
K
[S ]
1
=
× [S ] + m
v Vmax
Vmax
式5
式 5 に基づいて、[S] vs [S]/v をプロットします (図
4)。最小二乗法により直線の傾き (a) と切片 (b) を求
め、式 6, 7 から Vmax および Km を算出します。[S]
の大きい領域でのプロットに有効です。
1
a
K m = b × Vmax
Vmax =
Km/Vmax
－Km
傾き=1/Vmax
式6
図 4 Hofstee プロット
式7
Eadie プロット： v/[S] vs [V]
v = −K m ×
v
+ Vmax
[S ]
式8
式 8 に基づいて、 v/[S] vs [V] をプロットします (図
5)。最小二乗法により直線の傾き (a) と切片 (b) を求
め、式 9, 10 から Vmax および Km を算出します。広
範囲の[S] のプロットに有効です。
Vmax = b
式 9
K m = −a
式 10
Vmax
傾き=－Km
Vmax/Km
図 5 Eadie プロット
測定の概要
P-ニトロフェニルリン酸に酵素 (ALP：ホスファターゼ) を作用させると、無機リン酸と
p-ニトロフェノールが遊離します。この遊離した p-ニトロフェノールは、アルカリ性
(pH10) で安定な黄色を呈するので、その吸収極大において時間変化測定を行い、基質濃度
[S] に対し初速度 (傾き) v をプロットし、ALP 活性を求めます。
装置
V-730
STR-773
CSP-909
紫外可視分光光度計
スターラー付恒温セルホルダー
シリンジポート付き試料室カバー
測定・解析プログラム
測定：[時間変化測定] プログラム
解析：VWKN-772 [カイネティクス解析] プログラム
試料
酵素液
・ 0.1 M 炭酸緩衝液 (約 pH10),
・ 10 mM 塩化マグネシウム液
・酵素液：アルカリホスファターゼ (ALP) の生理食塩水液 0.0004 ug/mL
基質液
・ p-ニトロフェニルリン酸 2 ナトリウム水溶液：0.067, 0.167, 0.333, 0.667, 0.833,
1.11, 1.67, 3.33 mmol/L (酵素液との混合による終濃度：0.0067, 0.0167, 0.0333,
0.0667, 0.0833, 0.111, 0.167, 0.333
0.7
mmol/L)
402 nm
0.6
スペクトル測定によるピーク波長の検出
酵素液に 0.667 mM の基質液を混合してから
2000 sec 後にスペクトルを測定したところ、
402 nm に p-ニトロフェノールの吸収ピークが
見られました (図 6)。そのため、この波長で
ALP 活性の測定を行うことにしました。
0.4
Abs
0.2
0
300
400
500
600
Wavelength [nm]
700
780
図 6 2000 sec 後の吸収スペクトル
測定の流れ
① 0.1 M 炭酸緩衝液 1.5 mL, 10 mM 塩化マグネシウム液 0.3 mL, 酵素液 0.9 mL を 10 mm
角セルに入れて、ブランク測定を行いました。
② ①の試料の時間変化測定を開始した後、0.067 mmol/L 基質液 0.3 mL を①に添加し、
そのまま時間変化測定を続けました。
③ 他の濃度の基質液で①②を繰り返しました。
測定条件
測定範囲
データ取込間隔
UV/Vis バンド幅
レスポンス
測定波長
温度
0 - 2000 sec
1 sec
1 nm
0.96 sec
402 nm
37 度
結果
各基質濃度の時間変化測定結果を図 7 に示します。各濃度の時間変化データに対し、反
応開始直後の各時間変化データの傾き (abs/min) を初速度 v として求めた結果が表 1 です。
1.6
1
表 1 基質濃度 [S] と速度 v
反応開始
Abs
0.5
-0.1
0
500
1000
Time [sec]
1500
[S] mmol/L
0.0067
0.0167
0.0333
0.0667
0.0833
0.111
0.167
0.333
―
―
―
―
―
―
―
―
2000
v abs/min
0.004
0.010
0.018
0.028
0.034
0.039
0.048
0.061
図 7 各基質濃度の時間変化データ
この結果を Michaelis-Menten, Lineweaver-Burk, Hofstee, Eadie でプロットし、プロット
法から Vmax, Km を求めました。なお、Michaelis-Menten プロットでは、はじめに Vmax と
Km を Eadie プロットから算出し、その値を初期値にして、実測した v と (1) 式から計算さ
れる v とを最小二乗法でフィッティングを行い Vmax および Km を算出しました。
表 2 計算結果
Vmax
Km
MichaelisMenten
0.0835
0.1238
式
－
計算方法
Lineweaver-Burk
Hofstee
Eadie
0.0815
0.1179
1/v = 1.447×1/[S]
+ 12.27
0.0828
0.1212
[S]/v = 12.0721×[S]
+ 1.4632
0.0818
0.1187
v = -0.01187×v/[S]
+ 0.08185
0.07
230
0.06
200
0.04
v
1/v 100
0.02
0
0
0.1
0.2
[S]
0.3
0
-10 0
0.4
50
100
150
1/[S]
図 8 a) Michaelis-Menten plot
図 8 b) Lineweaver-Burk plot
6
0.09
0.08
4
0.06
[S]/v
v 0.04
2
0.02
0
-0.2
0
0.2
[S]
図 8 c) Hofstee plot
0.4
0
0
0.2
0.4
v/[S]
図 8 d) Eadie plot
0.6
0.7

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