血 清 型 別 検 査 （微生物部） 血清凝集反応 確認培養等による生化学性状から属及び種が決定されたら、次に免疫血清に対する凝集反応に より血清型を決める。ここでは、腸内細菌及び類似菌（ブドウ糖を分解する菌として、サルモネ ラ、赤痢菌、チフス菌、腸炎ビブリオ、コレラ菌など）の血清型別検査の方法について述べる。 なお、病原菌の血清型の決め方は各種診断用免疫血清の説明に従って行う。 １．血清型の決定 ２．凝集反応 ３．H 抗原の相の誘導法（相誘導） １．血清型の決定 血清型の決定は各種診断用免疫血清により行う。各種診断用免疫血清と被検菌を混和させたと き、免疫血清と対応する菌との抗原抗体反応により菌体の凝集塊が生じる。この反応を目視にて 観察することで血清型の決定を行う。被検菌は普通寒天培地や HI 寒天培地等に接種した純培養 菌を用いて凝集反応を行うが、腸内細菌及び類似菌では確認培地の TSI 寒天斜面培養菌を用いる こともできる。 （１）O 抗原*1（菌体抗原）、K 抗原＊2（莢膜抗原）の型別 ＊1：O 抗原の由来 ohne Hauchbildung ＊2：K 抗原の由来 Kapsel ① 被検菌として生菌を用いる場合 ・サルモネラ、赤痢菌、コレラ菌の O 抗原、腸炎ビブリオの K 抗原、チフス菌の Vi 抗原の血 清型を決めるときは、生菌を用いる。 ・普通寒天培地、HI 寒天培地等に接種した純培養の生菌＊3 を使用し凝集反応（スライド凝集反 応）を行う。 ＊3: 生化学性状試験に使用した TSI 寒天斜面培養菌を使用すると時間の短縮になる。 ② 被検菌として加熱死菌を用いる場合 ・菌体の周囲に形成された莢膜様物質を不活化するために、加熱死菌を用いる。 ・大腸菌、チフス菌の O 抗原、腸炎ビブリオの O 抗原の血清型を決めるときは、加熱死菌を用 いる。 ・純培養菌を生理食塩水に濃厚接種した浮遊液を作成し、100℃で 30‐60 分間加熱した加熱死 菌を使用し凝集反応（スライド凝集反応）を行う。 ・加熱温度・時間は菌により異なるので、各種診断用免疫血清の説明に従って行う。 （２）H 抗原＊4（鞭毛 毛抗原）の型 型別 Hauchbilduung ＊4： H 抗原の由来 抗 ・サルモネラ ラ、大腸菌の の H 抗原の血 血清型を決める。 ・被検菌とし して HI ブイヨンや BHI ブ ブイヨンに接 接種した純培養 養の液体培養 養菌液に 1％ホルマリ ン加生理食 食塩水を等量加 加えたもの（最終濃度 0.5％ホルマリ 0 リン液）を使 使用し凝集反 反応（試験 管内凝集反 反応）を行う。 ・サルモネラの のように 2 つの つ H 抗原を をもつ菌（複相 相菌）は、通常 常一方の相に にのみ凝集がみられ、 他の相とは は反応しない。従って、最 最初に凝集し した H 血清に対 対する H 抗原 原の他に、もう 1 つの H 抗原を確認 認しなければ ば、血清型は は決定できない い。それには は、後述する る H 抗原の相 相の誘導法 に従って被 被検菌液を作り り、それを使 使って再度凝 凝集反応（試験 験管内凝集反 反応）を行う。 ・H 凝集 集反応は鞭毛抗 抗原による凝 凝集反応であることから、鞭毛が十分 分発育している必要が ある。生化学性状試 試験に用いた た SIM あるい いは LIM 培地に発育した菌 菌の 2-3 白金 金耳を（試 入れる前に）B BHI か HI ブイ イヨンに接種 種すると良い い。 薬を入 一夜培養した た後、1％ホル ルマリン加生 生理食塩水を等 等量加え ・36‐377℃のインキュベータで一 て静か かに混和し、殺 殺菌固定を兼 兼ねて 2 時間 間ほど静置して供試する ＊ ＊長時間の培養 養は避ける （恒温槽で で培養すると 4－5 時間で で発育する） ２．凝集反応 凝集反 反応には、ス スライド凝集 集反応と試験 験管内凝集反 反応とがある。通常はスライド凝集反 反応で血 清型を決 決めるが、サ サルモネラの の H 抗原は試 試験管内凝集 集反応で血清 清型を決める。 スライド凝集 集反応 （１）ス 片側に血清 清 他方に被検 検菌 血清と被検 検菌を混和し して凝集を観察 察 凝集（－） 凝集（＋） 凝集の の状況は菌により異なる場 場合がある （２）試 試験管内凝集 集反応 ① 小試験管を用 用いる場合 ・小試験管（ （できるだけき きれいなもの のを選ぶ。 ）に に H 血清 0.02ml とホルマ マリン処理の液体培養 菌液 0.4ml を混和し、5 50℃の恒温槽 槽で 30 分間静 静置する。 ・蛍光灯など どの光にかざし し、凝集の有 有無を確認す する。非常にも もろい凝集塊 塊なので注意 意して取り 扱う。 凝集（＋） ） 凝集（－） 凝集が強いと（左）液層 層が透明にな なり、 験管全体が混 混濁 凝集が無いと（右）試験 ② 軽く振る ると柔らかい い凝集塊が認 認め られるが が、強く振るとくずれてし しま ので注意 意する マ マイクロプレ レート（V 型）を用いる場 場合 ・5 倍希釈した た H 血清 10μl とホルマ マリン処理の の液体培養菌液 液 30μl＊5 を を混和（プレ レートミキ サーで 30 秒程度）し、 秒 36℃のインキ キュベータで で 30 分静置後 後、各ウェル ルについて凝 凝集塊の有 無を確認す する。 （凝集が が認められない い場合はさら らに 30 分延長 長） ＊5）マイ イクロプレー ートを用いる場合は、生化 化学性状試験 験に使用した たリジン脱炭酸試験培 地 1％ホルマ 地に マリン加生理 理食塩水を等 等量加えたもの のを使用する ると時間の短 短縮になる。 ペで見ると分 分りやすい。 ・下から光を当て、ルーペ 凝集 集（－） 凝集 集（＋） H ３．H 抗原の相の の誘導法（相 相誘導） （1） サ サルモネラの の相誘導 ・サ サルモネラの多くは 2 つの H 抗原をもち（複相菌 菌） 、通常はど どちらか一方 方の抗原を持 持つ菌が優 勢 勢を占めてい いる。まず、最 最初に凝集し した相（１相 相目）の H 血清 清型が決定し したらその血 血清型の相 誘 誘導用免疫血 血清（デンカ生 生研）を HI 半 半流動培地（寒天 0.3-0.5％）に所定 定量加え、滅 滅菌したク レ レーギー管を無菌的に培地 地の中に立て てて固めた後 後、クレーギー ー管 中 中の培地上部 部 5mm 程度の のところ(矢印 印）まで菌を接種し、もう 1 つ つの相（2 相目）を誘導す する。 相目を持つ菌 菌は、1 相目の の H 血清型に に該当しない い H 抗原を持つ つ菌 ・2 相 で で、1 相目を持つ菌は血清 清により運動 動が抑えられ れ、2 相目を持 持つ 菌 菌が 18-22 時間でクレーギ 時 ギー管の外側 側まで運動し して発育する－ －誘 導 有 ない菌もあり り、最初の凝 凝集に対応する H 抗血清を を加 ・1 つの相しかな え えた半流動培 培地では、他の の相が無いた ため菌は動か かない－誘導 無 構造表に H 抗 抗原の 1 相：2 相が記載さ され ＊Kauffmann-White 抗原構 誘 誘導 有 誘導 誘 無 未 未接種 ているが、1 相が始め めに出るとは は限らない。 導後の被検菌 菌の調製 （2）誘導 ・2 相目を持 持つ菌が試験管 管全体に発育 育（18-22 時間：長時間培 時 培養する と、元の相 相（1 相目）の の菌が発育し してくるので で注意する）し したら、 クレーギー ー管の外側上部 部から 2-3 白 白金耳釣菌し し、BHI ブイヨ ヨンに接 種後、37℃ ℃の水浴中で 5-6 時間培養 養し十分に発 発育した菌に 1％ホル クレーギー管 ク 管の外側 マリン加生 生理食塩水を液 液体培養菌液 液と等量加え えて、殺菌固定 定 (2 時 上部から、 上 2-33 白金耳 間くらい静 静置）したもの のを被検菌と とし、凝集反 反応を行い抗原 原を決定 釣菌する 釣 する。 ・同定時間 間を短縮する るため、生化 化学性状試験で で使用したリ リジン脱炭酸 酸試験培地をホ ホルマリン 処理して て、マイクロ ロプレートを用 用いた簡易法 法で 1 相目を を決定する。次に生化学性 性状試験で 使用した た TSI 寒天斜 斜面培養菌で相 相誘導を行い い（夕方接種 種）翌朝 BHI ブ ブイヨンに接 接種し、4-5 時間培養 養した後、ホ ホルマリン処理 理し、同様に に 2 相目を決 決定する。こ この方法だと血 血清型決定 に 1 日の の短縮が可能 能である。
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