簡易マニュアル（カードパンチ用）

これは簡易マニュアルです。詳細は PowerPlex® Fusion System Technical Manual #TMD039 をご
覧ください。マニュアルはウェブからダウンロードできます。www.promega.com/protocols/
PowerPlex® Fusion
カードパンチを使用する場合
始める前に
PowerPlex® Fusion System は以下のサンプルで使用可能です。
FTA®のサンプル種
FTA®以外のサンプル種
Whatman EasiCollect™または Fizco Sampact™により
Bode Buccal DNA Collector™で採取した口腔サンプル
®
FTA カードに採取された口腔細胞
滅菌したスワブで採取し、FTA®あるいは FTA®の表示があ
血液あるいは口腔サンプルで FTA®以外のカードパンチ
るカードに移したもの
FTA®カードに添加した液状血液（Vacutainer®あるいはフ
ィンガー・スティック法で採取・保存したもの）
FTA®カードパンチの場合、前処理は必要ありません。FTA 以外のカードの場合は以下の方
法で前処理を行ってください。より詳細な情報は PunchSolution™ Kit Technical Manual
#TMD038 をご覧ください。
マニュアルはウェブからダウンロードできます。www.promega.com/protocols/
1.
96 ウェルプレートに 1.2 mm のパンチを加え、10 µl の PunchSolution™ Reagent（カ
タログ番号 DC9271）を加える。
＊プレートに蓋をしたり、高温になった蓋を閉めた状態でサーマルサイクラー内に置か
ないでください。
2.
70℃で 30 分間、ウェルが乾燥するまでインキュベートする。
PCR の準備
1.
使用直前に試薬を融解する。
2.
ボルテックスで 15 秒間撹拌し、軽く遠心する。使用前に再度 15 秒間ボルテックスで撹
拌する（この後に遠心操作は行わないでください）
。
3.
下記の表に従い、サンプル数（ポジティブコントロール、ネガティブコントロールを含
む）+1 回分もしくは 2 回分の PCR 用ミクスチャーを調製する。
PCR Amplification Mix の構成品
Water, Amplification Grade
PowerPlex® Fusion 5X Master Mix
PowerPlex® Fusion 5X Primer Pair Mix
サンプルあたりの液量
15 µl
5.0 µl
5.0 µl
合計反応液量
× 反応数
最終液量（µl）
×
＝
×
＝
×
＝
25 µl
プロメガ株式会社 www.promega.co.jp
テクニカルサービス
Tel. 03-3669-7980
E-mail: [email protected]
4.
3 をボルテックスで 5～10 秒混ぜる。
5.
FTA®あるいは PunchSolution™ Reagent で処理した FTA®でないパンチの場合、血液
サンプルなら 1.2 mm パンチを 1 枚、口腔サンプルなら 1.2 mm パンチを 1～2 枚を、
25 µl の PCR 用ミクスチャーに加える（枚数は必要に応じて最適化してください）。
6.
ポジティブコントロールのため、25 µl の PCR 用ミクスチャーの入ったウェルに 2800M
Control DNA（10 ng/µl の濃度に希釈）を 1 µl 加える。コントロールなのでパンチは
加えない。
7.
プレートをシールし、軽く遠心する。
PCR
本システムの PCR 増幅は GeneAmp® PCR System 9700（シルバー、ゴールドコーティ
ングしたシルバーのブロックを使用、ランプスピードは Max Mode）に最適化されています。
1.
以下に従いサイクル条件を設定する。パンチを使用する場合は 27 サイクルを推奨します
が、必要に応じて最適化してください。
GeneAmp® PCR System 9700 用サーマルサイクル条件
2.
サンプルはすぐに解析に用いるか、遮光して-20℃で保存可能。
プロメガ株式会社 www.promega.co.jp
テクニカルサービス
Tel. 03-3669-7980
E-mail: [email protected]
装置の準備、サンプル調製
サンプル解析の前に PowePlex® 5-Dye Matrix Standards（カタログ番号 DG4700）を用
いて Spectral Calibration を行う必要があります。詳細は PowePlex® 5-Dye Matrix
Standards, 3100/3130, Technical Bulletin #TBD024 をご覧ください。
装置の準備
1.
Applied Biosystems® 3500 または 3500xL Genetic Analyzer を使用する場合、イン
ジェクションの少なくとも 30 分前に 60℃のプレヒートを行うことを推奨します。
2.
以下パラメーターに従い装置を設定する。
解析装置
Applied Biosystems® 3500
Applied Biosystems® 3500xL
Applied Biosystems® 3130 and 3130xl
®
ABI PRISM 3100 and 3100-Avant
(with Data Collection Software, Version 2.0)
ランモジュール
HID36_POP4
ダイセット
Promega G5
インジェクション
パラメーター
1.2 kV, 15 seconds
ランタイム
1,210 seconds
HID36_POP4
Promega G5
1.2 kV, 24 seconds
1,210 seconds
HIDFragmentAnalysis36_POP4
G52
3 kV, 5 seconds
1,500 seconds
HIDFragmentAnalysis36_POP4
2
3 kV, 5 seconds
1,500 seconds
G5
1
Injection time を調節して（2-24 秒）ピークの高さを増減させることもあります。
2
PowePlex® 5-Dye で作製したファイルがセットされていることを確認してください。
サンプル調整
キャピラリー電気泳動用サンプルはローディング前に速やかに調整を行ってください。
1.
泳動試薬を融解する。CC5 Internal Lane Standard 500（CC5 ILS 500）を軽く遠心
し、使用前に再度 15 秒間ボルテックスで撹拌する（この後、遠心は不要です）
。
2.
下記の表に従い、サンプル数（ランごとの allelic ladder も含む）+1 回分もしくは 2 回
分の Loading Cocktail（CC5 ILS 500 と Hi-Di™ formamide の混合液）を調製する。
CC5 ILS 500 の量は最適化が必要な場合もある。
構成品
サンプルあたりの液量
CC5 ILS 500
1.0 µl
Hi-Di™ formamide
10 µl
1
× 反応数
最終液量（µl）
×
＝
×
＝
1
CC5 ILS 500 の量を増減してサイズスタンダードのピークの蛍光強度を調節できます。2 µl までが目安です。
Hi-Di™ formamide の量は 10 µl で変更せず、ステップ 3 でウェルに加える量を適宜調節してください。
3.
Loading Cocktail10-15 秒間ボルテックスで撹拌し、ピペットマンで 11 µl ずつ各ウェ
ルに加える。
4.
1 µl の PCR 産物（または 1 µl の PowerPlex® Fusion Allelic Ladder Mix）を加える。
ウェルをセプタなどで封じ、軽く遠心する。
5.
95℃で 3 分間変性処理を行い、即座に砕氷上あるいは氷水で 3 分間冷却する。
プロメガ株式会社 www.promega.co.jp
テクニカルサービス
Tel. 03-3669-7980
E-mail: [email protected]
6.
プレートアセンブリをオートサンプラーに配置する。
7.
キャピラリー電気泳動をスタートする。
データ解析
GeneMapper® ID software, version 3.2 と GeneMapper® ID-X software, version 1.2
またはそれ以上を用いた解析には panel、bin、stutter text file が必要です。以下サイトか
らダウンロードできます。
www.promega.com/resources/tools/genemapper-id-software-panels-and-bin-sets/
プロメガ株式会社 www.promega.co.jp
テクニカルサービス
Tel. 03-3669-7980
E-mail: [email protected]

Download Report