これは簡易マニュアルです。詳細は PowerQuantTM System Technical Manual #TMD047 をご覧ください。マニュアルはウェブからダウンロードできます。www.promega.com/protocols/ PowerQuantTM System（カタログ番号 PQ5002、PQ5008）簡易マニュアル PowerQuant™ Male gDNA Standard の段階希釈 1. 最初に使用する場合、PowerQuant™ Male gDNA Standard を 4℃で一晩保存してください。PowerQuant™ Male gDNA Standard をハイスピードで 10 秒間、3 回ボルテックスしてください。 2. 以下の濃度をチューブに記載してください：2ng/µl、0.08ng/µl、0.0032ng/µl 3. 以下に示すように希釈します。希釈するごとに 10 秒間ボルテックスし、次の希釈を行います。ピペットマンのチップは希釈するごとに交換してください。 DNA 濃度 PowerQuant™ Male gDNA Standard の液量 50 ng/µl 2 ng/µl 0.08 ng/µl 0.0032 ng/µl 希釈せず使用希釈せず 4 µl 使用 2 ng/µl の希釈液を 4 µl 使用 0.08 ng/µl の希釈液を 4 µl 使用 PowerQuant™ Dilution Buffer の液量 0 µl 96 µl 96 µl 96 µl PowerQuant™反応の準備 1. PowerQuant™ 2X Master Mix、PowerQuant™ 20X Primer/Probe/IPC Mix と Water, Amplification Grade を室温で完全に融解します。 2. PowerQuant™ 2X Master Mix と PowerQuant™ 20X Primer/Probe/IPC Mix をボルテックスで 10 秒間撹拌します。この後に遠心操作は行わないでください。 3. テンプレートなしのコントロール反応を含めた反応数を決定します。決定した反応数を 10~15％増やします。 4. 下記の表に従い、Water, Amplification Grade、PowerQuant™ 2X Master Mix、 PowerQuant™ 20X Primer/Probe/IPC Mix を混合して Reaction Mix を調製します。構成品 1 反応あたりの液量 Water, Amplification Grade PowerQuant™ 2X Master Mix PowerQuant™ 20X Primer/Probe/IPC Mix 7.0 µl 10.0 µl 1.0 µl 合計反応液量 18 µl × 反応数 × × × 最終液量（µl）＝＝＝ 5. ボルテックスで 10 秒混ぜます。この後に遠心操作は行わないでください。 6. MicroAmp® Optical 96-Well Reaction Plate の反応ウェルに 18µl の Reaction Mix を加えます。 7. 上記で調整した PowerQuant™ Male gDNA Standard または unknown の DNA サンプルを 2µl、適切なウェルに加えます。プロメガ株式会社 www.promega.co.jp テクニカルサービス Tel. 03-3669-7980 E-mail: [email protected] 8. 2µl の TE-4 Buffer (pH8.0)、または Water, Amplification Grade をテンプレートなしのコントロール反応に加えます。 9. MicroAmp® Optical Adhesive Film でプレートをシールします。 10. プレートを軽く遠心します。サーマルサイクリングサーマルサイクリングを行う前に、ラン用テンプレート（.edt ファイル）を作成し、ここにダイの情報とターゲットの名前、Task を保存します（ウェルの位置、DNA スタンダード用 DNA 濃度、ランメソッド、解析の設定）。PowerQuant™ System を使用する前に、機器を PowerQuant™ Dye 用にキャリブレーションを行ってください。詳細は PowerQuant™ System テクニカルマニュアル（TMD047）をご覧ください。 1. HID Real-Time PCR Analysis Software, Version 1.1 または 1.2 を使用する場合はホームスクリーンの Custom Assays ボタンか、Assays menu の「Custom Assays」を選択してください Applied Biosystems® 7500 Software, Version 2.0.6 を使用する場合はステップ 2 に進んでください。 2. 画面上部の File メニューから「Open」を選択してランテンプレートファイルを開きます。.edt ファイルに移動し、「Open」を選択します。 3. File メニューから「Save As…」を選択して.edt ファイルを.eds ファイルとして保存します。 4. 使用していないウェルのターゲットを選択解除します。 5. サンプル名を加えるため、Setup メニューから「Plate Setup」を選択し、Define Targets and Samples タブを選択します。「Add New Sample」を選択し、表示されているセクションにサンプル名を入力します。全てのサンプルでこれを繰り返します。 6. Assign Targets and Samples タブに移動し、同じサンプルのレプリケートを含むウェルを強調表示します。Assign sample(s) to the selected wells セクションのサンプル名の隣にある Assign ボックスにチェックを入れます。ランメソッドを確認します。全てのサンプルが指定されるまで繰り返します。ランメソッドを確認します。 7. サンプルが正しく指定されたら、.eds ファイルを保存します。 8. トレイドアを開けてプレートを置きます。トレイドアを閉め、「Start Run」を押します。プロメガ株式会社 www.promega.co.jp テクニカルサービス Tel. 03-3669-7980 E-mail: [email protected] スタンダードカーブの評価 1. サーマルサイクリング終了後、Applied Biosystems® 7500 Software の左横パネルの「Analysis」を選択します。View Plate Layout タブで解析するウェルが全て強調表示され、使用しないウェルは選択されていないことを確認します。 2. 「Analyze」を選択します。 3. HID Real-Time PCR Analysis Software, Version 1.1 または 1.2 を使用する場合、 Analysis メニューから「Standard Curve」を選択してスタンダードカーブを表示します。Target ドロップダウンメニューから「All」を選択してすべてのターゲットについてスタンダードカーブを表示してください。 Applied Biosystems® 7500 Software, Version 2.0.6 の場合、Analysis メニューから「Standard Curve」を選択してスタンダードカーブを表示します。Target ドロップダウンメニューからターゲットを選択して各ターゲットについてスタンダードカーブを表示してください。解析データのエクスポート 1. エクスポートするデータのあるウェルがプレートマップ上で強調表示されていることを確認します。ツールバーから「Export」を選択します。 2. Export Data ウィンドウの Export Properties タブから、次のように選択します。 Select data to export セクションの「Results」を選択 Select one file or separate files ドロップダウンメニューから「One File」を選択ファイルタイプとして「.xls」を選択適当なエクスポートファイルの名前を指定します。 Browse ボタンでファイルの場所を選択します。「Start Export」を選択します。 PowerQuant™ Analysis Tool を用いたデータ解析 1. ダウンロードした PowerQuant™ Analysis Tool に移動し、アイコンをクリックします。 2. Home ワークシートのボタンで Admin Settings ワークシートを選択します。各パラメーターの値が適切であることを確認します。 3. Home ワークシートに戻り、Import Data ボタンを選択します。 4. Applied Biosystems® 7500 Real-Time PCR System software からエクスポートした.xls ファイルをブラウズし、ファイルを強調表示して「OK」を選択します。 5. File メニューから「Save As」を選択し、マクロフリーのワークブックとしてファイルを保存します。コンピューターの所定の場所に、.xlsx ファイルを保存します。 6. PowerQuant™の結果を検討します。プロメガ株式会社 www.promega.co.jp テクニカルサービス Tel. 03-3669-7980 E-mail: [email protected]