ProjYRBM-v3.0.1 RBC Bioscience Total RNA Extraction Kit Maxi (Blood) Total RNA Extraction Kit Maxi (Blood / Bacteria / Cultured-Tissue Cells) Cat. No. YRBM10 10 マキシプレップ RBC Lysis Buffer: 200ml ×2 本 RB Buffer: 60ml * RT Buffer: 30ml R-W1 Buffer: 50ml R-Wash Buffer (conc.): 25ml ** RNase-free Water: 10ml Filter Maxi Column (50ml Centrifuge にセットして提供): 10 本 RB Maxi Column (50ml Centrifuge Tube にセットして提供): 10 本 Cat. No. YRBM25 25 マキシプレップ RBC Lysis Buffer: 500ml×2 本 RB Buffer: 150ml * RT Buffer: 60ml R-W1 Buffer: 130ml R-Wash Buffer (conc.): 40ml * RNase-free Water: 30ml Filter Maxi Column (50ml Centrifuge Tube にセットして提供): 25 本 RB Maxi Column (50ml Centrifuge Tube にセットして提供): 25 本 対象サンプル（プロトコール掲載） ：動物細胞 100～200mg、培養細胞 107～108、 血液サンプル 5ml、バクテリア 109～1010 収量： ～500μg 所要時間： 60 分以内 溶出量： 500μl * ご使用になられる前に、RB Buffer 1ml に対して 10μl のβ－メルカプトエタノ ール（β－ME）を加えてください。β－ME を加えた RB Buffer は 1 ヶ月まで常温 で保存できます。 ** 初めにご使用になられる前に、R-Wash Buffer に 4 倍量のエタノールを加えて ください。 本製品の付属品は全て RNase フリーです。 ゲノミック DNA を完全に除去したい場合は、RNase フリーの DNase I を別途ご 用意ください。 1 概要 Total RNA Extraction Kit Maxi (Blood / Bacteria / Cultured-Tissue Cells) は、血液 やバクテリア、培養細胞や培養組織から全 RNA を迅速かつ簡単に精製するために 設計されています。 本製品では、まず、組織試料を液体窒素中ですりつぶした後、フィルターカラム を使用してデブリスを取り除きます。カオトロピック塩を含む結合バッファーの存 在下で、溶液中の全 RNA は、スピンカラム内のグラスファイバー充填材に結合し ます。また、DNase 処理を施すことにより、混入した DNA を取り除くことができ ます。最後に、RNase-free Water を加えることにより、精製された全 RNA が溶出 されます。フェノール抽出やアルコール沈殿などの処理は必要ありません。60 分 以内に一連のプロセスが完了します。 精製された全 RNA は cDNA 合成、RT-PCR、リアルタイム PCR、ノーザン・ブ ロッティングなどの用途に使用できます。 品質管理 Total RNA Extraction Kit Maxi (Blood / Bacteria / Cultured-Tissue Cells)はロット 毎に、 マウスの肝臓 100mgから全 RNAを単離する方法で品質試験を行っています。 留意点（混入したゲノミック DNA の除去について） RNA とゲノミック DNA は化学的に似ているため、RNA 抽出のプロセスにおい て、通常わずかなゲノミック DNA が同時に抽出されると考えられます。アガロー スゲルを用いた分析では RNAの上部にあるゲノミック DNAを確認することができ ます。用途によっては、ゲノミック DNA の混入は特に問題になりません。しかし ながら、高純度の RNA が必要な場合は、DNase I（RNase フリー）による処理を 行ってください。 メーカーの説明書に従って DNase I 溶液をご用意の上、プロトコールに従い DNase I 溶液を RB Maxi Column に加えてください。このとき RNA 分解が起こら ないよう、DNase I は必ず高純度のものをご使用ください。 多量のゲノミック DNA の混入が見られた場合や、極めて高純度の RNA が必要な 場合は、DNase の使用量を増やすか、残留 DNA の分解の処理においてインキュベ ーション時間を長くしてください。ただしこの場合、RNA の収量が減少する可能 性があります。 注意事項 (1) Buffer は、刺激性があり有害な物質を含有しています。消毒済みで RNase フリーの実験器具をお使いください。また、ご使用中は必ず、 白衣、使い捨ての手袋、防護用眼鏡を着用してください。 2 Total RNA Extraction Kit Maxi (Blood) RNA 結合 11. RB Maxi Column を設置する。 12. サンプル溶液にサンプル量の半分のエタノールを加え、すぐにボルテックスに かけて混ぜ合わせる。 （例えば、溶液 5ml に 2.5ml のエタノールを加える。 ） 13. 得られた溶液を RB Maxi Column に加える。 14. 遠心分離機にフルスピードで 5 分間かけ、排液を捨てる。 最良の結果を得るために、以下のプロトコールではスウィングバケット式の遠心機 をご使用ください。 ヒト新鮮血用プロトコール 溶解 1. 抗凝血剤で処理した採血管で新鮮血を集める。 2. RBC Lysis Buffer 15ml を滅菌済みの 50ml 遠心管に入れる。 （この遠心管は本製 品の付属品ではありません。） 3. 新鮮血 5ml を加え、遠心管をひっくり返す方法で混ぜ合わせる。ボルテックス にはかけないでください。 4. 室温で 10 分間インキュベートする。 5. 遠心分離機に 500xg で 5 分間かける。 6. 上澄み液を捨てる。 7. RB Buffer 5ml とβ－メルカプトエタノール（β－ME）50μl を加え、ボルテ ックスにかけて混ぜ合わせる。 （β－ME は本製品の付属品ではありません。 ） 8. Filter Maxi Column にサンプル溶液を加える。 9. 遠心分離機にフルスピードで 5 分間かける。 10. Filter Maxi Column を捨て、透明な排液を新しい 15ml 遠心管に移し入れる。 （こ の遠心管は本製品の付属品ではありません。） 3 付加処理（推奨）：残留 DNA の分解 a. RB Maxi Column に R-W1 Buffer 2ml を加え、遠心分離機にフルスピードで 3 分間かけた後、排液を捨てる。 b. DNase I 20 Unit と DNase 反応緩衝液 140μl を混合した DNase I 溶液を RB Maxi Column の中央に加える。 （DNase I は追加でご用意ください。 ） c. 室温で 20 分間、遠心管を立てて置く。 d. RB Maxi Column に R-W1 Buffer 2ml を加え、遠心分離機にフルスピードで 3 分間かけた後、排液を捨てる。続けて洗浄の処理（18～）を行う。 洗浄 15. RB Maxi Column に R-W1 Buffer 4ml を加える。 16. 遠心分離機にフルスピードで 3 分間かける。 17. 排液を捨て、RB Maxi Column を遠心管内に戻す。 18. RB Maxi Column に（エタノールで薄めた）R-Wash Buffer 6ml を加える。 19. 遠心分離機にフルスピードで 3 分間かける。 20. 排液を捨て、RB Maxi Column を遠心管内に戻す。 21. 再度、遠心分離機にフルスピードで 10 分間かけて、カラム充填材を乾かす。 RNA 溶出 22. 乾いた RB Maxi Column を滅菌済みの 50ml 遠心管（RNase フリー）に移し入 れる。 （この遠心管は本製品の付属品ではありません。） 23. カラム充填材の中央に、RNase-free Water 500μl を加える。 24. RNase-free Water が充填材に吸収されるまで 5 分間、遠心管を立てて置く。 25. 遠心分離機にフルスピードで 5 分間かけて、精製された RNA を溶出させる。 4 培養細胞（浮遊培養動物細胞）用プロトコール トリプシン処理 付着培養細胞を使用する場合、まずトリプシン処理を行った後、いずれかの細胞 の溶解の処理を行ってください。 a. 培地を取り除き、PBS を使って細胞を洗浄する。 b. PBS を吸引し、0.10～0.25％トリプシンを加えて細胞にトリプシン処理を施す。 c. 細胞を取り出し、培地を加えて 15ml 遠心管に移し入れる。 （この遠心管は本製 品の付属品ではありません。 ） d. 浮遊培養動物細胞として細胞をペレット化する。 細胞の溶解（細胞を回収して溶解する場合） 1. 細胞 107～108 を 15ml 遠心管に移し入れ、遠心分離機に 300xg で 5 分間かけて 細胞を集める。 （この遠心管は本製品の付属品ではありません。 ） 2. 上澄み液を捨てる。 3. RB Buffer 5ml とβ－メルカプトエタノール（β－ME）50μl を加え、ボルテ ックスにかけて混ぜ合わせる。 （β－ME は本製品の付属品ではありません。 ） 4. Filter Maxi Column にサンプル溶液を加える。 5. 遠心分離機にフルスピードで 5 分間かける。 6. Filter Maxi Column を捨て、透明な排液を新しい 15ml 遠心管に移し入れる。 （こ の遠心管は本製品の付属品ではありません。 ） 7. RNA 結合の処理（15～）を行う。 細胞の溶解（培養容器中の細胞を溶解する場合） 8. 培養容器中の培地を取り除く。 9. RB Buffer 5ml とβ－メルカプトエタノール（β－ME）50μl を培養容器に加 える。 （β－ME は本製品の付属品ではありません。 ） 重要：容器を振って細胞を完全に RB Buffer に浸す。 10. ラバーポリスマンを使って細胞溶解物を集める。 11. Filter Maxi Column を設置する。 12. 細胞溶解液を Filter Maxi Column に加える。 13. 遠心分離機にフルスピードで 5 分間かける。 14. Filter Maxi Column を捨て、透明な排液を新しい 15ml 遠心管に移し入れる。 （こ の遠心管は本製品の付属品ではありません。 ） 5 バクテリア用プロトコール グラム陰性の場合 1. バクテリア培養液（109～1010）を 15ml 遠心管に移し入れる。 （この遠心管は本 製品の付属品ではありません。 ） 2. 遠心分離機にフルスピードで 5 分間かけた後、上澄み液を捨てる。 3. RT Buffer 2ml を加え、ボルテックスにかけるか、ピペッティングにより、細胞 ペレットを再懸濁させる。 4. 室温で 5 分間インキュベートする。 グラム陽性の場合 リゾチーム緩衝液を追加でご用意ください。ご使用の直前に調合してください。 （リゾチーム 20mg/ml；20mM Tris-HCl；2mM EDTA；1％ Triton X-100；pH 8.0） 1. バクテリア培養液（109～1010）を 15ml 遠心管に移し入れる。 （この遠心管は本 製品の付属品ではありません。 ） 2. 遠心分離機にフルスピードで 5 分間かけた後、上澄み液を捨てる。 3. リゾチーム緩衝液 2ml を加え、ボルテックスにかけるか、ピペッティングする ことで、細胞ペレットを再懸濁させる。 4. 室温で 10 分間インキュベートする。インキュベーション中 2～3 分毎に、エッ ペンチューブをひっくり返す方法で混ぜ合わせる。 溶解 5. RB Buffer 5ml とβ－メルカプトエタノール（β－ME）50μl を加え、ボルテ ックスにかけて混ぜ合わせる。 （β－ME は本製品の付属品ではありません。 ） 6. 室温で 5 分間インキュベートする。 7. Filter Maxi Column にサンプル溶液を加える。 8. 遠心分離機にフルスピードで 5 分間かける。 9. Filter Maxi Column を捨て、透明な排液を新しい 15ml 遠心管に移し入れる。 （こ の遠心管は本製品の付属品ではありません。） Total RNA Extraction Kit Maxi (Blood) RNA 結合 15. RB Maxi Column を設置する。 16. 6 または 15 のサンプル溶液にサンプル量の半分のエタノールを加え、すぐに、 ボルテックスにかけて混ぜ合わせる。 （例えば、溶液 5ml に 2.5ml のエタノー ルを加える。 ） 17. 得られた溶液を RB Maxi Column に加える。 18. 遠心分離機にフルスピードで 5 分間かけ、排液を捨てる。 付加処理（推奨）：残留 DNA の分解 a. RB Maxi Column に R-W1 Buffer 2ml を加え、遠心分離機にフルスピードで 3 分間かけた後、排液を捨てる。 b. DNase I 20 Unit と DNase 反応緩衝液 140μl を混合した DNase I 溶液を RB Maxi Column の中央に加える。 （DNase I は追加でご用意ください。 ） c. 室温で 5～15 分間、遠心管を立てて置く。 d. RB Maxi Column に R-W1 Buffer 2ml を加え、遠心分離機にフルスピードで 3 分間かけた後、排液を捨てる。続けて洗浄の処理（23～）を行う。 洗浄 19. RB Maxi Column に R-W1 Buffer 4ml を加える。 20. 遠心分離機にフルスピードで 3 分間かける。 21. 排液を捨て、RB Maxi Column を 50ml Centrifuge Tube 内に戻す。 22. RB Maxi Column に（エタノールで薄めた）R-Wash Buffer 6ml を加える。 23. 遠心分離機にフルスピードで 3 分間かける。 24. 排液を捨て、RB Maxi Column を 50ml Centrifuge Tube 内に戻す。 25. 再度、遠心分離機にフルスピードで 10 分間かけて、カラム充填材を乾かす。 RNA 溶出 26. 乾いた RB Maxi Column を新しい 50ml 遠心管 （RNase フリー） に移し入れる。 （この遠心管は本製品の付属品ではありません。） 27. カラム充填材の中央に、RNase-free Water 500μl を加える。 28. RNase-free Water が充填材に吸収されるまで 5 分間、遠心管を立てて置く。 29. 遠心分離機にフルスピードで 5 分間かけて、精製された RNA を溶出させる。 6 Total RNA Extraction Kit Maxi (Blood) 付加処理（推奨）：残留 DNA の分解 a. RB Maxi Column に R-W1 Buffer 2ml を加え、遠心分離機にフルスピードで 3 分間かけた後、排液を捨てる。 b. DNase I 20 Unit と DNase 反応緩衝液 140μl を混合した DNase I 溶液を RB Maxi Column の中央に加える。 （DNase I 溶液は追加でご用意ください。 ） c. 室温で 5～15 分間、遠心管を立てて置く。 d. RB Maxi Column に R-W1 Buffer 2ml を加え、遠心分離機にフルスピードで 3 分間かける。続けて洗浄の処理（17～）を行う。 洗浄 14. RB Maxi Column に R-W1 Buffer を 4ml 加える。 15. 遠心分離機にフルスピードで 3 分間かける。 16. 排液を捨て、RB Maxi Column を遠心管内に戻す。 17. RB Maxi Column に（エタノールで薄めた）R-Wash Buffer 6ml を加える。 18. 遠心分離機にフルスピードで 3 分間かける。 19. 排液を捨て、RB Maxi Column を遠心管内に戻す。 20. 再度、遠心分離機にフルスピードで 10 分間かけて、カラム充填材を乾かす。 RNA 溶出 21. 乾いた RB Maxi Column を滅菌済みの 50ml 遠心管（RNase フリー）に移し入 れる。 （この遠心管は本製品の付属品ではありません。） 22. カラム充填材の中央に、RNase-free Water 500μl を加える。 23. RNase-free Water が充填材に吸収されるまで 5 分間、遠心管を立てて置く。 24. 遠心分離機にフルスピードで 5 分間かけて、精製された RNA を溶出させる。 RNA 結合 10. RB Maxi Column を設置する。 11. サンプル溶液にサンプル量の半分のエタノールを加え、すぐに、ボルテックス にかけて混ぜ合わせる。 （例えば、溶液 5ml に 2.5ml のエタノールを加える。 ） 12. 得られた溶液を RB Maxi Column に加える。 13. 遠心分離機にフルスピードで 5 分間かけ、排液を捨てる。 7 8 組織用プロトコール 溶解 1. 新鮮な、または、冷凍保存された動物性組織 100mg（最大 200mg まで）を切 り取る。 2. 液体窒素の中に浸したサンプルを粉末状になるまですりつぶす。 3. RB Buffer 5ml とβ－メルカプトエタノール（β－ME）50μl を加え、ボルテ ックスにかけて混ぜ合わせる。 （β－ME は本製品の付属品ではありません。 ） 4. 15ml 遠心管に移し入れる。 （この遠心管は本製品の付属品ではありません。 ） 5. 室温で 5 分間インキュベートする。 6. Filter Maxi Column にサンプル溶液を加える。 7. 遠心分離機にフルスピードで 5 分間かける。 8. Filter Maxi Column を捨て、透明な排液を新しい 15ml 遠心管に移し入れる。 （こ の遠心管は本製品の付属品ではありません。） Total RNA Extraction Kit Maxi (Blood) 18. 排液を捨て、RB Maxi Column を遠心管内に戻す。 19. 再度、遠心分離機にフルスピードで 10 分間かけて、カラム充填材を乾かす。 RNA 溶出 20. 乾いた RB Maxi Column を滅菌済みの 50ml 遠心管（RNase フリー）に移し入 れる。 （この遠心管は本製品の付属品ではありません。） 21. カラム充填材の中央に、RNase-free Water 500μl を加える。 22. RNase-free Water が充填材に吸収されるまで 5 分間、遠心管を立てて置く。 23. 遠心分離機にフルスピードで 5 分間かけて、精製された RNA を溶出させる。 RNA 結合 9. RB Maxi Column を設置する。 10. サンプル溶液にサンプル量の半分のエタノールを加え、すぐにボルテックスに かけて混ぜ合わせる。 （例えば、溶液 5ml に 2.5ml のエタノールを加える。 ） 11. 得られた溶液を RB Maxi Column に加える。 12. 遠心分離機にフルスピードで 5 分間かけ、排液を捨てる。 付加処理（推奨）：残留 DNA の分解 a. RB Maxi Column に R-W1 Buffer 2ml を加え、遠心分離機にフルスピードで 3 分間かけた後、排液を捨てる。 b. DNase I 20 Unit と DNase 反応緩衝液 140μl を混合した DNase I 溶液を RB Maxi Column の中央に加える。 （DNase I 溶液は追加でご用意ください。 ） c. 室温で 5～15 分間、遠心管を立てて置く。 d. RB Maxi Column に R-W1 Buffer 2ml を加え、遠心分離機にフルスピードで 3 分間かける。続けて洗浄の処理（16～）を行う。 洗浄 13. RB Maxi Column に R-W1 Buffer を 4ml 加える。 14. 遠心分離機にフルスピードで 3 分間かける。 15. 排液を捨て、RB Maxi Column を遠心管内に戻す。 16. RB Maxi Column に（エタノールで薄めた）R-Wash Buffer 6ml を加える。 17. 遠心分離機にフルスピードで 3 分間かける。 9 製品の取扱い方法についてのお問合せは、以下の弊社窓口まで ご相談ください。 RBC Bioscience 社製品 日本総代理店 有限会社 サイトローブ マーケティング営業部 〒113-0034 東京都文京区湯島 3-21-5 Tel ：03-3834-2525 Fax：03-3834-2550 E-mail：[email protected] 10
© Copyright 2024 ExpyDoc
