MLPC（Mixed Lymphocyte Peptide Culture)法 3,000rpm, 末梢血20mlを採取 10分間遠心 単核球 血漿 5U/mlトロンビン 37℃,1~2時間 血清 細胞数 3×105/100μｌ ，h-TERTペプチド 10μg/ml となる ように 5％ 自己血清加培養液 (RPMI1640) で浮遊させ、 100μl/well ずつプレートの well に撒く 3日後 5%自己血清,IL-2 50U/ml加培養液100μl/well加える 3日後 各wellから上清を100μlずつ除き、新たに5%自己血 清,IL-2 50U/ml加培養液を100μl/wellずつ加える。 これを2日ごとに繰り返す。 培養2週目 各々のwellについてCMV tetramer 陽性CD8+T細胞の 割合をFACSを用いて解析する。 hTERT -tetramer MLPCによるhTERT-tetramer陽性細胞の解析 （培養14日目,EO-PBMNCｓ, initiated on 120618,h-TERT peputide) 0/27 FITC-CD8 120702 MLPC（Mixed Lymphocyte Peptide Culture)法 3,000rpm, 末梢血20mlを採取 10分間遠心 単核球 血漿 5U/mlトロンビン 37℃,1~2時間 血清 細胞数 3×105/100μｌ ，CMV ペプチド 5μg/ml となるよう に 5％ 自己血清加培養液 (RPMI1640) で浮遊させ、 100μl/well ずつプレートの well に撒く 3日後 5%自己血清,IL-2 50U/ml加培養液100μl/well加える 3日後 各wellから上清を100μlずつ除き、新たに5%自己血 清,IL-2 50U/ml加培養液を100μl/wellずつ加える。 これを2日ごとに繰り返す。 培養2週目 各々のwellについてCMV tetramer 陽性CD8+T細胞の 割合をFACSを用いて解析する。 MLPCによるCMV-tetramer陽性細胞の解析 （培養14日目,EO-PBMNCｓ, initiated on 120618 CMV peputide) 034 CMV C3.034 035 CMV C4.035 036 CMV C5.036 037 CMV C6.037 038 CMV C7.038 039 CMV C8.039 040 CMV C9.040 041 CMV C10.041 100 FITC-CD8 104 100 CMV -tetramer 042 CMV D3.042 100 FITC-CD8 100 FITC-CD8 100 FITC-CD8 FITC-CD8 FITC-CD8 104 100 FITC-CD8 104 100 FITC-CD8 FITC-CD8 FITC-CD8 104 100 045 CMV D6.045 104 100 051 CMV E4.051 104 100 058 CMV F4.058 FITC-CD8 044 CMV D5.044 104 100 051 CMV E4.051 104 100 057 CMV F3.057 104 100 043 CMV D4.043 104 100 050 CMV E3.050 FITC-CD8 FITC-CD8 104 100 FITC-CD8 104 100 046 CMV D7.046 104 100 052 CMV E5.052 FITC-CD8 FITC-CD8 104 100 FITC-CD8 104 100 047 CMV D8.047 104 100 053 CMV E6.053 FITC-CD8 FITC-CD8 104 100 FITC-CD8 104 100 FITC-CD8 104 048 CMV D9.048 049 CMV D10.049 104 100 054 CMV E7.054 FITC-CD8 FITC-CD8 104 100 055 CMV E8.055 104 100 FITC-CD8 FITC-CD8 104 056 CMV E9.056 104 100 FITC-CD8 104 059 CMV F5.059 104 100 FITC-CD8 26/27 104 FITC-CD8 120702 MACS-beads sorting of CD8+ cells No.of cells R1/total M1/total M1/R1 No. of T cells % recovery MNC 3.7×107 58.4 17.0 29.1 6.3×106 100.0 CD8ー 1.4×107 59.9 1.46 2.44 2.0×105 3.17 CD8＋ 4.7×106 96.2 89.4 92.9 4.2×106 66.7 001 PBMNC .001 002 CD8(-).002 003 CD8(+).003 EO 58.4% 0 200 400 600 800 FSC 001 PBMNC .001 1000 0 CD8+cells/R1 200 400 600 FSC 002 CD8(-).002 101 102 FITC-CD8 103 800 1000 0 CD8+cells/R1 29.1% 100 96.2% 59.2% 200 400 600 FSC 003 CD8(+).003 100 101 102 FITC-CD8 103 1000 CD8+cells/R1 1.46% 104 800 92.9% 104 100 101 102 FITC-CD8 103 104 120703 健常コントロール例における A24-CMV pp65 peptide を用いたCTL誘導の検討 APCs 1.5×105/well Dox 1μg/ml CMV 5μg/ml ①PMDC11-3 (+) ②PMDC11−3 (-) ③TLR-4 PMDC11-3 CD8+ cells (E.O) ④TLR-4 PMDC11-3 3.0×105/well ⑤TLR-4 PMDC11-3 (-) (+) (-) (+) (+) ⑥TLR-4 PMDC11-3 (-) ⑦medium (+) ⑧medium (-) Peptide plusは２４ｈｒ、Stimulationは毎週行う。 120531
© Copyright 2024 ExpyDoc
