Agilent6460 による薬物の スクリーニングシステム ＜要旨＞向精神薬、睡眠薬、乱用薬物や一般医薬品(鎮痛薬、降圧 薬など)を含めた 220 薬物の LC-MS/MS による高感度スク リーニング手法を開発しました。このスクリーニング手 法を用いることで予め内部標準物質(正イオン:ジアゼパ ム-d5,負イオン：フェノバルビタール-d5)を用いた検量線 により半定量が可能です。検出限界は殆どの正イオン薬 物で 0.1 ng/mL、 殆どの負イオン薬物で 0.1 ng/mL でした。 また、このシステムには QuEChERS を用いた前処理手法も 含んでいます。 Key Words: DMRM、向精神薬，睡眠薬，乱用薬物，LC-MSMS， *************************** 1. はじめに 表 2 各薬物の MRM 条件 最近、法医学、救急救命の分野では多剤薬剤中毒患者 が急増しており乱用薬物、向精神薬、睡眠鎮静薬や一 般的な医薬品も含めて迅速な分析法が求められていま す。これら薬物の分析ではより多くの化合物の迅速な 一斉分析が必要なことから、タンデム四重極型質量分 析装置を用いた LC-MS が有効な手法です。 弊社ではタンデム四重極型質量分析計を用いた LC-MS システムによる 220 薬毒物迅速スクリーニングシステ ムを提供します。 2.1 装置及び測定条件 分析条件は表 1 に示した通りです。装置は Agilent6460 Triple Quadrupole LC/MS を使用しました。分析用カラム は逆相系の Agilent Technologies ZORBAX Eclipse Plus C18 RRHD (100mm,2.1mm,1.8um)、移動相にはアセトニトリル 及び 0.1%ぎ酸+10mM ギ酸アンモニウム混合水溶液を使 用しました。また、半定量分析を行う目的で内部標準 物質にジアゼパム-d5(正イオンモード)とフェノバルビ タール-d5(負イオンモード)を使用しました。分析条件及 び、各薬物の MRM 条件は表 2 に示した通りです。 No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 表1 220 薬物のスクリーニング分析 LC Column Mobile phase Column temp Sample volume Flow rate : 1260 Infinity : ZORBAX Eclipse Plus C18 RRHD(100mm,2.1mm,1.8um) : A:0.1%ギ酸+10mMギ酸アンモニウム B:アセトニトリル 10%B---(20min)---100%B : 40℃ : 3uL : 0.25mL/min MS Ionization Drying gas Nebulizer gas Fragmentor Sheath gas Nozzole : Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS : AJS(Positive/Negative) : 10L/min at 300℃ : 345kPa : 100V : 400℃ 12L/min : 0V drugs Acebutolol Acemetacin Acetaminophen Acetazolamide Acetylpheneturide Alimemazine Alprazolam Alprenolol Amantadine Amezinium Amiodarone Amitriptyline Amlodipine Amobarbital Amoxapine Arotinolol Atenolol Atropine Azelnidipine Barbital Biperidene Blonanserin Bromazepam Bromocriptine Bromovalerylurea Bromperidol Brotizolam Bupivacaine Buprenorphine Cabergolin Carbamazepine Carpipramine Carvezilol Chlordiazepoxide Chlormezanone Chlorphenesin Chlorpheniramine Chlorpromazine Chlorzoxazone Clemastine Clobazam Clocapramine Clofedanol Clomipramine Clonazepam No 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 drugs Clotiazepam Cloxazolam Clozapine Cocain Codein Cyclobarbital Cyproheptadine Dantrolene Delorazepam Desipramine Diazepam Diazepam-d5 Dibucaine Diclofenac Digitoxin Digoxin Dihydrocodein Diltiazem Dimetotiazine Diphenhydramine Diphenylpyraline Disopyramine Distigmine Donepezil Dosulepine Droperidol Duloxetine Eptazocin Estazolam Ethenzamide Ethotoin Ethyl loflazepate Ethylmorphine Etizolam Etodolac Fludiazepam Flufenamic acid Flumazenil Flunitrazepam Fluphenazine Flurazepam Flutazolam Flutoprazepam Fluvoxamine No 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 drugs Glibenclamide Gliclazide Glimepiride Glutethimide Haloperidol Haloxazolam Homochlorcyclizine Hydroxizine Ibuprofen Imipramine Indomethacin Isopropylantipyrine Ketamine Ketoprofen Labetalol Levomepromazine Licocaine Lofepramine Lorazepam Lormetazepam Maprotyline Mazaticol Mazindol Medazepam Mefenamic acid Meloxicam Mephobarbital Mepivacaine Mequitazine Metarbital Methanphetamine Methocarbamol Methyldigoxin Methylphendate Metixene Mexazolam Mianserin Midazolam Midodrine Milnacipran Modafinil Morphine Mosapramine Nabumetone No 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 drugs Naloxon Naproxen Nemonapride nicotine Nilvadipine Nimetazepam Nitrazepam Nitrendipine Nordiazepam Nortriptyline Olanzapine Olmesatran medoxomil Oxaprozin Oxazepam Oxazolam Oxybuprocain Oxycodone Oxypertine Pancuronium Papaverine Paroxetine Pemoline Pentobarbital Pentzocine Pergolide Perospirone Perphenazine Pethidine Phenacetin Phenobarbital Phenobarbital-d5 Phenytoin Pimozide Pipamperone Piroheptine Piroxicam Pramipexole Prazepam primidon Procain Prochlorperazine Profenamine Promethazine Propericyazine No 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 drugs Quazepam Quetiapine Ramelteon Ranitidine Reserpine Rilmazefone Risperidone Rocuronium Ropivacaine Salicylic acid secobarbital Sertraline Setiptiline Spiperone Sulindac Sulpiride Sultopride Suxamethonium Talipexole Tandospirone Temazepam Tenoxicam Tetracine Thiamylal Thiopental Thioridazine Tiaprofenic acid Timiperone Tizanidine Tofisopam Tolfenamic acid Tramadol Trazodone Triazolam Trifluoperazine Trihexyphenidyl Trimipramine Triprolidine Tubocrarine Verapamil Zolpidem Zonisamide Zopiclone Zotepine Gapapentine 2.2 前処理条件 試料(全血)前処理には QuEChERS 法に準じて行いまし た。手順は図 1 の通りです。アセトニトリルと硫酸マ グネシウムによる相分離抽出は効率良く水溶性の高い 薬物を抽出することが可能です。また、PSA や C18 充填 剤による分散 SPE は全血中のマトリックス成分の除去 が可能であり、脂溶性薬物のイオン化阻害の低減に有 効です。 表 3 感度の低い薬物の検出限界 全血 ( 0.5 mL) 及び純水 (1 mL) を 15 mL 遠沈管に入れ 5 秒間 Vortex 化合物名 4 mm ステンレス玉 (2 個 ) 及びアセトニトリル ( 1.5 mL ) を 遠沈管に入れ10秒間Vortex 硫酸マグネシウム (0.4g) 及び酢酸ナトリウム (0.1g) を添加 10 秒間激しく手で振とう、その後、 30 秒間 Vortex 3000 回転で 5 分間遠心分離 上清 (2mL) を予め PSA(25mg) 、 C18(25mg) 及び硫酸マグネシウム (75mg) を添加した 2mL のポリバイアルに添加、 3 秒 Vortex ポリバイアルを 3000 回転で 5 分間遠心分離 試料(全血)前処理手順 150 3000 Homochlorcyclizine - 10 Levels, 10 Levels Used, 10 Points, 10 Point… x10 1 y = 2.178263 * x - 0.020362 R^2 = 0.99994137 1 Type:Linear, Origin:Include, Weight:None 0.9 0.8 0.7 5 4 3 2 1 0.1 0 0 -0.1 12 13 14 3.5 4 4.5 5 Relative Concentration Tetracine - 10 Levels, 10 Levels Used, 10 Points, 10 Points Used, 0… x10 1 y = 9.939426 * x - 0.027867 R^2 = 0.99993549 Type:Linear, Origin:Include, Weight:None 4.5 Relative Responses 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 4 3.5 3 1 2 0.5 1 0 0 0 0.8ppb 12.5ppb 0.4ppb 6.4ppb 3.2ppb 1.6ppb アルプラゾラムの MRM クロマトグラム 0.2ppb 0.1ppb 0.05ppb 6 3 1.5 25ppb 7 4 2 全薬物の MRM クロマトグラム(25ng/mL) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 Relative Concentration Timiperone - 10 Levels, 10 Levels Used, 10 Points, 10 Points Used,… x10 1 y = 17.345466 * x - 0.071660 R^2 = 0.99991201 8 Type:Linear, Origin:Include, Weight:None 5 2.5 図3 6 0.5 0.2 1000 図2 7 0.6 0.3 100 9 1 1 5 2 2 5 5 10 10 10 25 25 5 0.5 25 0.5 1 0.5 Quetiapine - 10 Levels, 10 Levels Used, 10 Points, 10 Points Used,… x10 1 y = 18.244106 * x + 0.069446 9 R^2 = 0.99974840 Type:Linear, Origin:Include, Weight:None 8 0.4 Diazepam-d5 2000 8 検出限界 ナブメトン アセメタシン バルビタール サリチル酸 メトバルビタール フェノバルビタール シクロバルビタール アモバルビタール ペントバルビタール メホバルビタール セコバルビタール ケトプロフェン チアミラル ジクロフェナック イブプロフェン フルフェナム酸 メフェナム酸 トルフェナム酸 :負イオンモード 図 4 には前述の前処理法で薬物添加全血を処理し たマトリックス検量線を示しましたが、良好な直線 性があられました。 Relative Responses Phenobarbital-d5 1 25 0.2 0.2 5 2 1 1 1 1 1 25 1 1 5 0.5 25 5 Relative Responses 3. 結果及び考察 今回紹介する薬物スクリーニングシステムでの測定 例は図 3 に示しました。このスクリーニングシステム では正、負イオンの同時測定が可能であり、負イオン モードで測定する必要のあるバルビタール系睡眠薬に ついても同時測定が可能です。 図 2 には全薬物及び内部標準物質の MRM クロマトグラ ムを示しました。また、図 3 に一例としてアルプロゾ ラムの MRM クロマトグラムを示しましたが、0.05ng/mL で S/N が 100 以上でした。全薬物の検出限界は表 3 に 示した薬物以外は全て 0.1ng/mL 以下であり、表 3 の薬 物も通常の処方量から推定すると生体試料中で十分に 測定可能な感度でした。 Relative Responses 図1 検出限界 化合物名 アセタゾラミド ジスチグミン パンクロニウム ハロキサゾラム フルタゾラム ブロモワレニル尿素 オキサゾラム クロルメザノン クロルゾキサゾン フェニトイン チオペンタール ダントロレン グルテチミド ロラゼパム アセチルフェネトライド チアプロフェン酸 オルメサルタン ナプロキセン 濃度単位:ng/mL 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 Relative Concentration 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 Relative Concentration 図 4 薬物の全血によるマトリックス検量線 4.まとめ 今回、LC/MS を使用した薬物スクリーニングシステ ムの紹介をしましたが、このスクリーニングシステム を使用することで、標準品を使用しない全血中薬物の 半定量が可能と思われます。 【LC-MS-201510TK-001】 アジレントは、本文書に誤りが発見された場合、また、 本文書の使用により付随的または間接的に生じる障害について 一切免責とさせていただきます。 また、本文書に記載の情報、説明、製品仕様等は予告なしに 変更することがあります。 アジレント・テクノロジー株式会社 〒192-8510 東京都八王子市高倉町 9-1 http://www.agilent.com/chem/jp
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