Dual Indexを持つLibraryのシーケンサーセットアップ 小林 孝史 テクニカルアプリケーションサイエンティスト © 2012 Illumina, Inc. All rights reserved. Illumina, illuminaDx, BaseSpace, BeadArray, BeadXpress, cBot, CSPro, DASL, DesignStudio, Eco, GAIIx, Genetic Energy, Genome Analyzer, GenomeStudio, GoldenGate, HiScan, HiSeq, Infinium, iSelect, MiSeq, Nextera, Sentrix, SeqMonitor, Solexa, TruSeq, VeraCode, the pumpkin orange color, and the Genetic Energy streaming bases design are trademarks or registered trademarks of Illumina, Inc. All other brands and names contained herein are the property of their respective owners. Indexシーケンシングとはなにか？ 解析を行うDNA断片（library）の端に、識別のためのインデックスが付加されてある →それぞれのDNA断片がどのサンプル由来か同定が可能・簡単 ということは？ →サンプルを混ぜて（pooling)解析して、後でクラスターをそれぞれのサンプルに 振り分ければいい（de-multiplex）→多サンプル解析(multiplex analysis)が可能 必要な作業・試薬は？ →サンプル調製の際にインデックス配列をつける作業 →index配列を読むためのシーケンスプライマー →解析のためのソフトウェア （イルミナの製品で全て揃います） 解析を行うDNA断片（Single-index library）の例 イルミナでは矢印の部分が インデックス配列を指します 2 Dual-Indexシーケンシングとはなにか？ インデックス配列を両端に２つ持つライブラリを解析する →一つのインデックスを持つもの（Single-Index; 最多24サンプル）よりも たくさんのサンプル（Dual-Index; 最多96サンプル）の多サンプル解析が可能です！ ということは？ →１サンプル当たり、より経済的に安価に解析が可能です！ より具体的には、 １サンプルにつきデータ量がたくさん要らないサンプルについて まとめて多くのサンプルを解析できる 別なサンプル 必要なデータ量: 1Gbases 別なサンプル 必要なデータ量: 1Gbases 必要なデータ量: 1Gbases 3 MiSeq Output: max 8Gbases 残った部分のデータ は 実質捨ててしまう Dual-Indexシーケンシングに用いるライブラリは？ 解析を行うDNA断片（Dual-index library）の例 P5 Index 2 Index 1 P7 イルミナでは矢印の部分が デュアルインデックス配列を指します Index 1 (i7): P7配列近傍の8塩基：12種類 Index 2 (i5): P5配列近傍の8塩基：8種類 12 x 8 = 96種類の組み合わせ Single-index library 4 IlluminaのキットでDual-Indexを使用している製品は？ Nextera kit全般 TruSeq Amplicon製品 TruSeq HT sample prep kit かんたんに調製が可能 – TruSeq AmpliconとNextera kitでは専用のキットが用意されています サンプル調製時(Nextera/TruSeq Amplicon)に: – 96wellプレートの横にindex1の12個のチューブを並べ – 次に縦にindex2の8個のチューブを並べる – それぞれの組み合わせにより96個のインデックスの組み合わせが可能。 Index 2 Index 1 5 IlluminaのキットでDual-Indexを使用している製品は？ Nextera kit全般 TruSeq Amplicon製品 TruSeq HT sample prep kit TruSeq HT kitではDual-Indexの付加したアダプターは96wellプレートで用意しております TruSeq DNA Adapter Plate (DAP) 注意）一般的にキットが異なるとインデックスの配列も異なります。 一緒に解析したい場合には、サンプルシートの作成などご注意ください。 6 IlluminaのキットでDual-Indexを使用している製品は？ （まとめ） TruSeq HT Sample Prep Kits - TruSeq DNA HT sample prep kit Dual Index ライブラリ Nextera Sample Prep Kits - Nextera DNA sample prep kit - Nextera XT sample prep kit - Nextera Exome sample prep kit TruSeq Amplicon Kits - TruSeq TSCA sample prep kit - TruSeq Amplicon cancer panel 7 Indexシーケンスの種類 シングルリードでSingle-Indexを読む →短いリード、少ないサンプル シングルリードでDual-Indexを読む →短いリード、たくさんのサンプル ペアエンドでSingle-Indexを読む →長いリード、少ないサンプル ペアエンドでDual-Indexを読む →長いリード、少ないサンプル 実際の解析方法は？→フローセルの種類によって異なります 8 シングルリードのフローセルでDual-Indexを読む Region complementary to P5 grafting primer Index 2 P5 primer DNA insert P7 primer Index 1 P7 grafting primer 9 Flow cell surface シングルリードのフローセルでDual-Indexを読む Region complementary to P5 grafting primer Read1のシーケンシングプライマーが結合 Index 2 P5 primer DNA insert P7 primer Index 1 P7 grafting primer 10 Flow cell surface Read 1 sequencing primer シングルリードのフローセルでDual-Indexを読む Region complementary to P5 grafting primer Read1を解析 (Read1) Index 2 P5 primer Read 1 sequencing primer Sequence DNA insert P7 primer Index 1 P7 grafting primer 11 Flow cell surface シングルリードのフローセルでDual-Indexを読む Region complementary to P5 grafting primer Read1の伸長鎖を外す Index 2 P5 primer Read 1 sequencing primer Sequence DNA insert P7 primer Index 1 P7 grafting primer 12 Flow cell surface シングルリードのフローセルでDual-Indexを読む Region complementary to P5 grafting primer Index1のシーケンシングプライマーが結合 Index 2 P5 primer DNA insert P7 primer Index 1 P7 grafting primer 13 Flow cell surface Index 1 Sequencing Primer シングルリードのフローセルでDual-Indexを読む Region complementary to P5 grafting primer Index1を解析 (Index1 read) Index 2 P5 primer DNA insert P7 primer Index 1 Sequencing Primer Index 1 read – 8 cycles Index 1 P7 grafting primer 14 Flow cell surface シングルリードのフローセルでDual-Indexを読む Region complementary to P5 grafting primer Index 2 P5 primer DNA insert P7 primer Index 1 P7 grafting primer 15 Flow cell surface Index1 readの伸長鎖を外す シングルリードのフローセルでDual-Indexを読む Region complementary to P5 grafting primer Index 2 Sequencing Primer Index 2 P5 primer DNA insert P7 primer Index 1 P7 grafting primer 16 Flow cell surface Index2のシーケンシングプライマーを結合 シングルリードのフローセルでDual-Indexを読む Region complementary to P5 grafting primer Index 2 P5 primer DNA insert P7 primer Index 1 P7 grafting primer 17 Flow cell surface Index 2 Sequencing Primer Index 2 read – 8 cycles Index2を解析→ラン終了 ペアエンドフローセルでDual-Indexを読む 18 ペアエンドフローセルでDual-Indexを読む Region complementary to P5 grafting primer Read1シーケンシングプライマーを結合 Index 2 P5 primer Read1 Sequencing Primer DNA insert P7 primer Index 1 P5 grafting primer P7 grafting primer Flow cell surface 19 ペアエンドフローセルでDual-Indexを読む Region complementary to P5 grafting primer Read1を解析 Index 2 P5 primer DNA insert SBS Sequencing Primer Sequence P7 primer Index 1 P5 grafting primer P7 grafting primer Flow cell surface 20 ペアエンドフローセルでDual-Indexを読む Region complementary to P5 grafting primer Read1の伸長鎖を外す Index 2 P5 primer DNA insert SBS Sequencing Primer Sequence P7 primer Index 1 P5 grafting primer P7 grafting primer Flow cell surface 21 ペアエンドフローセルでDual-Indexを読む Region complementary to P5 grafting primer Index1のシーケンシングプライマーを結合 Index 2 P5 primer DNA insert P7 primer Index 1 Sequencing Primer Index 1 P5 grafting primer P7 grafting primer Flow cell surface 22 ペアエンドフローセルでDual-Indexを読む Region complementary to P5 grafting primer Index1を解析 Index 2 P5 primer DNA insert P7 primer Index 1 Sequencing Primer Index 1 Index 1 read – 8 cycles P5 grafting primer P7 grafting primer Flow cell surface 23 ペアエンドフローセルでDual-Indexを読む Region complementary to P5 grafting primer Index1 readの伸長鎖を外す Index 2 P5 primer DNA insert P7 primer Index 1 Index 1 read – 8 cycles P5 grafting primer P7 grafting primer Flow cell surface 24 ペアエンドフローセルでDual-Indexを読む 保護基を外し、フローセル上の P5 grafting primerに結合させる P5 grafting primer Flow cell surface 25 ペアエンドフローセルでDual-Indexを読む 画像を取得しない7cycle 7 chemistry only cycles P5 grafting primer Flow cell surface 26 ペアエンドフローセルでDual-Indexを読む Index2を解析 →フローセル上のDNA鎖を使用するので、 (Index2)プライマーは必要ない Index 2 - 8 cycles 7 chemistry only cycles P5 grafting primer Flow cell surface 27 ペアエンドフローセルでDual-Indexを読む クラスターの再形成を行う（ブリッジPCR） Index 2 index read 8 cycles 7 chemistry only cycles P5 grafting primer Flow cell surface 28 ペアエンドフローセルでDual-Indexを読む DNA鎖を変性する。 Original strand Flow cell surface 29 New strand ペアエンドフローセルでDual-Indexを読む Read1で用いた鎖を切断し P5のブロックする New strand Flow cell surface 30 ペアエンドフローセルでDual-Indexを読む Read2シーケンシングプライマーを結合 Read 2 Sequencing Primer Flow cell surface 31 ペアエンドフローセルでDual-Indexを読む Read2を解析→ラン終了 Read 2 Sequencing Primer Sequence Flow cell surface 32 ここまでのまとめ、Dual-Indexシーケンシングとは？ ２つのインデックス配列（Index 1(i7) and Index 2 (i5) ）を持つDual Indexライブラ リを解析。 最も多くて96種類のDual-Indexライブラリが作製できる (12 Index 1 x 8 Index 2)。 Dual-Indexライブラリは下記のキットで作製可能。 TruSeq HT、 Nextera各種、 TruSeq Amplicon kit. Dual Indexの概要→: 33 HiSeq/Genome Analyzerを使用する場合 34 Dual-Indexシーケンスに必要な試薬キット ライブラリ クラスター 形成 シーケンス シーケンス プライマー 35 • Nextera sample prep kit • TruSeq HT sample prep kit サンプル調製キット • TruSeq Cluster Kit v2 – GA • TruSeq Cluster Kit v3 – HS cBot/cluster generation • TruSeq SBS Kit v5 – GA • TruSeq SBS Kit v3 – HS HiSeq/GA • Dual-Index Sequencing Primer Box – Nextera、TruSeq HT single flow cell HiSeq/GA TruSeq Dual-Index Sequencing Primer Kit TruSeq Dual-Index Sequencing Primer Kit TruSeq Dual-Index Sequencing Primer Kit for Single-Read flow cell for Paired-End flow cell FC-121-1003 PE-121-1003 HP10- Read1 sequencing primer mix HP10-Read1 sequencing primer mix HP12- Index 1(i7) sequencing primer mix HP12- Index 1 (i7) sequencing primer mix HP9- Index 2 (i5) sequencing primer HP11- Read2 sequencing primer mix 必要な時 Nextera各種のキットを使用して作製されたライブラリ Single-Read TruSeq HT flow cellを使用してDual Indexランを行う場合 TruSeq あるいは Nexteraの各種のキットを使用して作製された全てのライブラリに対応 TruSeqとNexteraで作製されたライブラリを同じフローセルの別レーンで解析する場合 36 シーケンスプライマーについて Nexteraライブラリ – Dual-Index Sequencing Primer Kitが必要 SingleRead FC Paired-End Read FC SingleRead FC R1:HP10 R1: HP10 R1: HP6/10 R1: HP6/10 I1: HP12 I1: HP12 I1: HP8/12 I1: HP8/12 I2: HP9 I2: grafted P5 I2: HP9 I2: grafted P5 R2: HP11 37 TruSeq HTライブラリ – DualIndex Sequencing Primer Kit, Single-read flow cellが必要 Paired-End Read FC R2: HP7/11 シングルリードのランに必要な試薬 IEMを用いた サンプルシート の作成 SBS試薬の セット Index read 用の試薬の セット Single-Index #19: HT2 #18: Diluted HP33.5mls #17: HP8 か HP12 38 それぞれの シーケンス反応 Dual index #19: HT2 #18: Diluted HP3- 4mls #17: HP8 or HP12 #16: HP9 の開始 シングルリードのランに必要な試薬 IEMを用いた サンプルシート の作成 SBS試薬の セット それぞれの Index read用の 試薬のセット の開始 Single index #19: HT2 #18: Diluted HP33.5mls #17: HP8 or HP12 39 シーケンス反応 Dual-Index #19: HT2 #18: Diluted HP3- 4mls #17: HP8 か HP12 #16: HP9 ペアエンドのランに必要な試薬 IEMを 用いた サンプル SBS試薬の セット シート Index read に用いる試 薬のセット Read1と Index read sequencing の作成 Single-Index #19: HT2 #18: Diluted HP3 3.5mls #17: HP8 か HP12 40 Dual index #19: HT2 #18: Diluted HP34mls #17: HP8 or HP12 #10: RMX Read2に使 用する 試薬 のセット Read2用の SBS試薬の セット Read2の sequencing ペアエンドのランに必要な試薬 IEMを 用いた サンプル シート SBS試薬の セット Index read に用いる試 薬のセット Read1と Index read sequencing の作成 Single index #19: HT2 #18: Diluted HP3 3.5mls #17: HP8 or HP12 Dual-Index #19: HT2 #18: Diluted HP3- 4mls #17: HP8 か HP12 #10: RMX 41 Read2に使 用する 試薬 のセット Read2用の SBS試薬の セット Read2の sequencing ペアエンドのランに必要な試薬 IEMを 用いた サンプル シート SBS試薬の セット Index read に用いる試 薬のセット Read1と Index read sequencing Read2に使 用する 試薬 のセット Read2用の SBS試薬の セット Read2の sequencing の作成 Single-Index RMXを含めすべての 試薬をセット 42 Dual index Prepare PE reagents except RMX ペアエンドのランに必要な試薬 IEMを 用いた サンプル シート SBS試薬の セット Index read に用いる試 薬のセット Read1と Index read sequencing Read2に使 用する 試薬 のセット Read2用の SBS試薬の セット Read2の sequencing の作成 Single index Prepare RMX along with all other reagents 43 Dual-Index RMX以外の試薬を セット 必要なSBS試薬–HiSeq ランの種類 サイクル数 DualIndexed Paired-End 101+8+(7)+8+101 225 -- 4* 93+8+(7)+8+93 209 1 4* 76+8+(7)+8+76 175 1 3 51+8+(7)+8+51 125 1 3 36+8+(7)+8+36 95 1 2 101+8+8 117 1 2 76+8+8 92 1 2 51+8+8 67 1 2 36+8+8 52 1 1 DualIndexed SingleRead 44 総サイクル数 SBS Kits (200-cycle) SBS kits (50-cycle) 必要なSBS試薬–HiSeq ランの種類 サイクル数 DualIndexed Paired-End 101+8+(7)+8+101 225 -- 4* 93+8+(7)+8+93 209 1 4* 76+8+(7)+8+76 175 1 3 51+8+(7)+8+51 125 1 3 36+8+(7)+8+36 95 1 2 101+8+8 117 1 2 76+8+8 92 1 2 51+8+8 67 1 2 36+8+8 52 1 1 DualIndexed SingleRead 45 総サイクル数 SBS Kits (200-cycle) SBS kits (50-cycle) HCS 1.5.15を使用してのRecipeの作成 46 Recipeの互換性- GA ランの種類 Recipe Non-Indexed Single-Read GA2_151Cycle_SR_v10 Single-Indexed Single-Read GA2-PEM(2X)_MP_151+7Cycle_SR_v8.5(px)- single-indexed library GA2-PEM(2X)_MP_151+8Cycle_SR_v10(px)- dual-indexed library Dual-Indexed Single-Read GA2-PEM(2X)_MP_151+8+8Cycle_SR_v10(px) Non-Indexed Paired-End GA2-PEM(2X)_2x151Cycle_v10(px) Single-Indexed Paired-End GA2-PEM(2X)_MP_151+7+151Cycle_v8.5(px)- single-indexed library GA2-PEM(2X)_MP_151+7+151Cycle_v10(px)- dual-indexed library Dual-Index Paired-End GA2-PEM(2X)_MP_151+8+8+151Cycle_PE_v10(px) Single-Indexライブラリ: recipe v8.5 Index無しのライブラリとDual-Indexライブラリ: recipe v10 47 Recipeの互換性- GA ランの種類 Recipe Non-Indexed Single-Read GA2_151Cycle_SR_v10 Single-Indexed Single-Read GA2-PEM(2X)_MP_151+7Cycle_SR_v8.5(px)- single-indexed library GA2-PEM(2X)_MP_151+8Cycle_SR_v10(px)- dual-indexed library Dual-Indexed Single-Read GA2-PEM(2X)_MP_151+8+8Cycle_SR_v10(px) Non-Indexed Paired-End GA2-PEM(2X)_2x151Cycle_v10(px) Single-Indexed Paired-End GA2-PEM(2X)_MP_151+7+151Cycle_v8.5(px)- single-indexed library GA2-PEM(2X)_MP_151+7+151Cycle_v10(px)- dual-indexed library Dual-Index Paired-End GA2-PEM(2X)_MP_151+8+8+151Cycle_PE_v10(px) Single-Indexライブラリ: recipe v8.5 Index無しのライブラリとDual-Indexライブラリ: recipe v10 48 サンプルシートの作成- HiSeq/GA Illumina Experiment Manager (IEM; 最新版はversion1.4）を使用しての サンプルシートの作成をお薦めしております. CASAVAで解析を行うためには必ずサンプルシートの作成が必要です サンプルシートが作成されていればindex配列の情報がラン中に閲覧するこ とが出来ます。 CASAVA 49 ソフトウェアの互換性 Platform Control software * Analysis * Sample sheet * Sequencing primers # HiSeq1000/2000 HCS1.5 CASAVA1.8.2 Illumina Experiment Manager 1.2 TruSeq dual Index sequencing primer kit Genome Analyzer SCS2.10 CASAVA 1.8.2 Illumina Experiment Manager 1.2 TruSeq dual Index sequencing primer kit MiSeq MCS1.2 MiSeq Reporter 1.1 Illumina Experiment Manager 1.2 -- * このバージョンより新しいもの # Nextera由来のライブラリとSingle-Read TruSeq HT flow cellsを使用する場合に必要 50 まとめ シーケンスプライマー: – Nextera ライブラリ、あるいはSingle-Read TruSeq HT flow cellを使用の場合: Dual-Index sequencing primer box (SR: FC-121-1003; PE: PE-121-103)が必要 – Paired-End TruSeq HT flow cell: クラスターキット内のsequencing primerを使用 装置と解析用のソフトウェアのアップデートを忘れずに Index read用の試薬: SBS試薬 Single-Read Paired-End HT2 HT2 Diluted HP3 Diluted HP3 HP8/HP12 HP8/HP12 HP9 RMX – たとえば、HiSeqで2x100 dual indexのランを行う場合には、23 cycles (8+7+8)分を考 慮して50 cycle kits を４キット用意する必要が有ります レシピ – (HiSeq) HCS1.5を使用される場合は 7塩基のインデックス配列を読む場合にはTruSeq multiplex sequencing primer box を、8塩基のインデックス配列を読む場合にはTruSeq Dual-Index sequencing primer Kitを使用する。 – (GA) Dual-Indexライブラリを解析するにはGA recipe v10を使用する 51 MiSeqを使用される場合 52 Dual-Indexシーケンスのワークフロー TruSeq Amplicon Nextera TruSeq HT P5 Index 2 Rd1 seq primer Insert Index 1 Rd2 seq primer 53 P7 必要なSequencing Primer 「TruSeq Dual-Index Sequencing Primer Box (FC-121-1003, PE-121-1003)」 は MiSeqを使用される場合には必要ございません！ （MiSeqカートリッジに必要なプライマーがすべて入っている） MiSeqのフローセルはPaired-Endのみです。 そのため、カートリッジにはHP09（index2プライマー）がありません。 54 Position Reagent Name Description 12 HP10 Read 1 Primer Mix 13 HP12 Index 1 Primer Mix 14 HP11 Read 2 Primer Mix サンプルシートの作成 Illumina Experiment Manager (IEM)を使用します。 MiSeqのOSであるMCS (MiSeq Control Software) は「ランの種類」や「サイク ル数」についてサンプルシートを参照する設定になっておりますので、サンプル シートはすべてのランに必要になります。 Index配列の入力フォーマットはCASAVAとMCSで異なるので注意。 MiSeq 55 CASAVA MiSeqを使用する際のまとめ Dual-Indexシーケンスに必要なプライマーは、MiSeqのカートリッジに 標準装備されています。 サンプルシートはそれぞれのランに対して用意します。 Illumina Experiment Manager (IEM; 現行version 1.4)を使用してサンプ ルシートを作成します。(MyIlluminaからダウンロード可能) http://support.illumina.com/downloads/illumina_experiment_manager.ilmn 56 Sequencing Primersについて 57 Sequencing Primersについて（まとめ） MiSeq TruSeq HT Nextera MiSeq reagent kit TruSeq Amplicon Single-Read TruSeq Sequencing primer box for SR Paired-End PE cluster kit v3 Genome Analyzer HiSeq1000/2000 TruSeq HT TruSeq Sequencing primer box for PE Single-Read TruSeq Sequencing primer box for SR Paired-End TruSeq Sequencing primer box for PE Nextera 58 よくあるご質問リスト ペアエンドフローセル、ペアエンドライブラリを用いてDual Indexのシングルリー ドを行うことは出来ますか？ – Read2のサイクル数を0に設定すれば可能。その場合はIndex2を解析した時点で終了しま す。 Sequencing Analysis Viewer (SAV)でIndex readの結果が見られないのはなぜです か？ – ランを開始する前にサンプルシートが必要です。SAV v1.8以上のバージョンがインデッ クス情報を得るのに必要です。 Dual-IndexシーケンシングでRMXが使用されるのはいつですか？ – ペアエンドのランにはRMXはIndex 2 (i5) Readの際に必要です。 – Read 2では必要ではありません。 現行のTruSeq Dual-Index Primer KitはすべてのTruSeqライブラリに対応しています か? 昔 Epicentre社より販売されていました Nextera kitにも対応していますか? – TruSeq Dual Index primer kitはIllumina Nextera primersに加えすべてのTruSeqライブラリ に対応していますが、昔販売されていましたEpicentreのNextera kitには対応しておりませ ん。 59 Dual Indexing FAQs Dual-IndexのインデックスランでもSingle-Indexの場合と同様に補正のための 1サイクルが必要になりますか？ – No, 6塩基（＋補正1塩基）のSingle-Indexに比べてDual-Indexは8塩基の配列になる ので 補正のサイクルが必要になりません。 Dual-Indexシーケンシングでは通常のシーケンシングに比べてどれだけの時間 がかかりますか？ – HiSeq でv3 SBS reagents とv3 flow cellを使用される場合、それぞれのサイクルご とに 53分 (計16サイクル（8+8）) とペアエンドの場合はケミストリーオンリーの7 サイクルに 2時間 かかるので、通常のHiSeqランに比べて~16時間ほど必要です。 Illumina Dual-Indexライブラリはほかのライブラリと同一レーンで解析可能で すか？ – No, ですが同じフローセルで解析することは可能です。その際は、TruSeq DualIndex Sequencing Primer kitを必ずご使用ください。また、その際は Illumina PhiX control libraryのスパイクインをお試しください。 60 ご清聴ありがとうございました。 ご質問は[email protected]でも承ります。 61
© Copyright 2024 ExpyDoc
