Dual Indexを持つLibraryのシーケンサーセットアップ

Dual Indexを持つLibraryのシーケンサーセットアップ
小林 孝史
テクニカルアプリケーションサイエンティスト
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Indexシーケンシングとはなにか?
解析を行うDNA断片(library)の端に、識別のためのインデックスが付加されてある
→それぞれのDNA断片がどのサンプル由来か同定が可能・簡単
ということは?
→サンプルを混ぜて(pooling)解析して、後でクラスターをそれぞれのサンプルに
振り分ければいい(de-multiplex)→多サンプル解析(multiplex analysis)が可能
必要な作業・試薬は?
→サンプル調製の際にインデックス配列をつける作業
→index配列を読むためのシーケンスプライマー
→解析のためのソフトウェア
(イルミナの製品で全て揃います)
解析を行うDNA断片(Single-index library)の例
イルミナでは矢印の部分が
インデックス配列を指します
2
Dual-Indexシーケンシングとはなにか?
インデックス配列を両端に2つ持つライブラリを解析する
→一つのインデックスを持つもの(Single-Index; 最多24サンプル)よりも
たくさんのサンプル(Dual-Index; 最多96サンプル)の多サンプル解析が可能です!
ということは?
→1サンプル当たり、より経済的に安価に解析が可能です!
より具体的には、
1サンプルにつきデータ量がたくさん要らないサンプルについて
まとめて多くのサンプルを解析できる
別なサンプル
必要なデータ量: 1Gbases
別なサンプル
必要なデータ量: 1Gbases
必要なデータ量: 1Gbases
3
MiSeq Output: max 8Gbases
残った部分のデータ
は
実質捨ててしまう
Dual-Indexシーケンシングに用いるライブラリは?
解析を行うDNA断片(Dual-index library)の例
P5 Index 2
Index 1 P7
イルミナでは矢印の部分が
デュアルインデックス配列を指します
Index 1 (i7): P7配列近傍の8塩基:12種類
Index 2 (i5): P5配列近傍の8塩基:8種類
12 x 8 = 96種類の組み合わせ
Single-index library
4
IlluminaのキットでDual-Indexを使用している製品は?
Nextera kit全般
TruSeq Amplicon製品
TruSeq HT sample prep kit
かんたんに調製が可能
– TruSeq AmpliconとNextera kitでは専用のキットが用意されています
サンプル調製時(Nextera/TruSeq Amplicon)に:
– 96wellプレートの横にindex1の12個のチューブを並べ
– 次に縦にindex2の8個のチューブを並べる
– それぞれの組み合わせにより96個のインデックスの組み合わせが可能。
Index 2
Index 1
5
IlluminaのキットでDual-Indexを使用している製品は?
Nextera kit全般
TruSeq Amplicon製品
TruSeq HT sample prep kit
TruSeq HT kitではDual-Indexの付加したアダプターは96wellプレートで用意しております
TruSeq DNA Adapter Plate (DAP)
注意)一般的にキットが異なるとインデックスの配列も異なります。
一緒に解析したい場合には、サンプルシートの作成などご注意ください。
6
IlluminaのキットでDual-Indexを使用している製品は?
(まとめ)
TruSeq HT Sample Prep Kits
- TruSeq DNA HT sample prep kit
Dual Index
ライブラリ
Nextera Sample Prep Kits
- Nextera DNA sample prep kit
- Nextera XT sample prep kit
- Nextera Exome sample prep kit
TruSeq Amplicon Kits
- TruSeq TSCA sample prep kit
- TruSeq Amplicon cancer panel
7
Indexシーケンスの種類
シングルリードでSingle-Indexを読む
→短いリード、少ないサンプル
シングルリードでDual-Indexを読む
→短いリード、たくさんのサンプル
ペアエンドでSingle-Indexを読む
→長いリード、少ないサンプル
ペアエンドでDual-Indexを読む
→長いリード、少ないサンプル
実際の解析方法は?→フローセルの種類によって異なります
8
シングルリードのフローセルでDual-Indexを読む
Region complementary to P5 grafting primer
Index 2
P5 primer
DNA insert
P7 primer
Index 1
P7 grafting primer
9
Flow cell surface
シングルリードのフローセルでDual-Indexを読む
Region complementary to P5 grafting primer
Read1のシーケンシングプライマーが結合
Index 2
P5 primer
DNA insert
P7 primer
Index 1
P7 grafting primer
10
Flow cell surface
Read 1 sequencing primer
シングルリードのフローセルでDual-Indexを読む
Region complementary to P5 grafting primer
Read1を解析
(Read1)
Index 2
P5 primer
Read 1 sequencing primer
Sequence
DNA insert
P7 primer
Index 1
P7 grafting primer
11
Flow cell surface
シングルリードのフローセルでDual-Indexを読む
Region complementary to P5 grafting primer
Read1の伸長鎖を外す
Index 2
P5 primer
Read 1 sequencing primer
Sequence
DNA insert
P7 primer
Index 1
P7 grafting primer
12
Flow cell surface
シングルリードのフローセルでDual-Indexを読む
Region complementary to P5 grafting primer
Index1のシーケンシングプライマーが結合
Index 2
P5 primer
DNA insert
P7 primer
Index 1
P7 grafting primer
13
Flow cell surface
Index 1 Sequencing Primer
シングルリードのフローセルでDual-Indexを読む
Region complementary to P5 grafting primer
Index1を解析
(Index1 read)
Index 2
P5 primer
DNA insert
P7 primer
Index 1 Sequencing Primer
Index 1 read – 8 cycles
Index 1
P7 grafting primer
14
Flow cell surface
シングルリードのフローセルでDual-Indexを読む
Region complementary to P5 grafting primer
Index 2
P5 primer
DNA insert
P7 primer
Index 1
P7 grafting primer
15
Flow cell surface
Index1 readの伸長鎖を外す
シングルリードのフローセルでDual-Indexを読む
Region complementary to P5 grafting primer
Index 2 Sequencing Primer
Index 2
P5 primer
DNA insert
P7 primer
Index 1
P7 grafting primer
16
Flow cell surface
Index2のシーケンシングプライマーを結合
シングルリードのフローセルでDual-Indexを読む
Region complementary to P5 grafting primer
Index 2
P5 primer
DNA insert
P7 primer
Index 1
P7 grafting primer
17
Flow cell surface
Index 2 Sequencing Primer
Index 2 read – 8 cycles
Index2を解析→ラン終了
ペアエンドフローセルでDual-Indexを読む
18
ペアエンドフローセルでDual-Indexを読む
Region complementary to P5 grafting primer
Read1シーケンシングプライマーを結合
Index 2
P5 primer
Read1 Sequencing Primer
DNA insert
P7 primer
Index 1
P5 grafting primer
P7 grafting primer
Flow cell surface
19
ペアエンドフローセルでDual-Indexを読む
Region complementary to P5 grafting primer
Read1を解析
Index 2
P5 primer
DNA insert
SBS Sequencing Primer
Sequence
P7 primer
Index 1
P5 grafting primer
P7 grafting primer
Flow cell surface
20
ペアエンドフローセルでDual-Indexを読む
Region complementary to P5 grafting primer
Read1の伸長鎖を外す
Index 2
P5 primer
DNA insert
SBS Sequencing Primer
Sequence
P7 primer
Index 1
P5 grafting primer
P7 grafting primer
Flow cell surface
21
ペアエンドフローセルでDual-Indexを読む
Region complementary to P5 grafting primer
Index1のシーケンシングプライマーを結合
Index 2
P5 primer
DNA insert
P7 primer
Index 1 Sequencing Primer
Index 1
P5 grafting primer
P7 grafting primer
Flow cell surface
22
ペアエンドフローセルでDual-Indexを読む
Region complementary to P5 grafting primer
Index1を解析
Index 2
P5 primer
DNA insert
P7 primer
Index 1 Sequencing Primer
Index 1
Index 1 read – 8 cycles
P5 grafting primer
P7 grafting primer
Flow cell surface
23
ペアエンドフローセルでDual-Indexを読む
Region complementary to P5 grafting primer
Index1 readの伸長鎖を外す
Index 2
P5 primer
DNA insert
P7 primer
Index 1
Index 1 read – 8 cycles
P5 grafting primer
P7 grafting primer
Flow cell surface
24
ペアエンドフローセルでDual-Indexを読む
保護基を外し、フローセル上の
P5 grafting primerに結合させる
P5 grafting primer
Flow cell surface
25
ペアエンドフローセルでDual-Indexを読む
画像を取得しない7cycle
7 chemistry only cycles
P5 grafting primer
Flow cell surface
26
ペアエンドフローセルでDual-Indexを読む
Index2を解析
→フローセル上のDNA鎖を使用するので、
(Index2)プライマーは必要ない
Index 2 - 8 cycles
7 chemistry only cycles
P5 grafting primer
Flow cell surface
27
ペアエンドフローセルでDual-Indexを読む
クラスターの再形成を行う(ブリッジPCR)
Index 2 index read
8 cycles
7 chemistry only cycles
P5 grafting primer
Flow cell surface
28
ペアエンドフローセルでDual-Indexを読む
DNA鎖を変性する。
Original strand
Flow cell surface
29
New strand
ペアエンドフローセルでDual-Indexを読む
Read1で用いた鎖を切断し
P5のブロックする
New strand
Flow cell surface
30
ペアエンドフローセルでDual-Indexを読む
Read2シーケンシングプライマーを結合
Read 2 Sequencing Primer
Flow cell surface
31
ペアエンドフローセルでDual-Indexを読む
Read2を解析→ラン終了
Read 2 Sequencing Primer
Sequence
Flow cell surface
32
ここまでのまとめ、Dual-Indexシーケンシングとは?
2つのインデックス配列(Index 1(i7) and Index 2 (i5) )を持つDual Indexライブラ
リを解析。
最も多くて96種類のDual-Indexライブラリが作製できる (12 Index 1 x 8 Index 2)。
Dual-Indexライブラリは下記のキットで作製可能。
TruSeq HT、 Nextera各種、 TruSeq Amplicon kit.
Dual Indexの概要→:
33
HiSeq/Genome Analyzerを使用する場合
34
Dual-Indexシーケンスに必要な試薬キット
ライブラリ
クラスター
形成
シーケンス
シーケンス
プライマー
35
• Nextera sample prep kit
• TruSeq HT sample prep kit
サンプル調製キット
• TruSeq Cluster Kit v2 – GA
• TruSeq Cluster Kit v3 – HS
cBot/cluster generation
• TruSeq SBS Kit v5 – GA
• TruSeq SBS Kit v3 – HS
HiSeq/GA
• Dual-Index Sequencing Primer Box –
Nextera、TruSeq HT single flow cell
HiSeq/GA
TruSeq Dual-Index Sequencing Primer Kit
TruSeq Dual-Index Sequencing Primer Kit TruSeq Dual-Index Sequencing Primer Kit
for Single-Read flow cell
for Paired-End flow cell
FC-121-1003
PE-121-1003
HP10- Read1 sequencing primer mix
HP10-Read1 sequencing primer mix
HP12- Index 1(i7) sequencing primer
mix
HP12- Index 1 (i7) sequencing primer
mix
HP9- Index 2 (i5) sequencing primer
HP11- Read2 sequencing primer mix
 必要な時
 Nextera各種のキットを使用して作製されたライブラリ
 Single-Read TruSeq HT flow cellを使用してDual Indexランを行う場合
 TruSeq あるいは Nexteraの各種のキットを使用して作製された全てのライブラリに対応
 TruSeqとNexteraで作製されたライブラリを同じフローセルの別レーンで解析する場合
36
シーケンスプライマーについて
Nexteraライブラリ – Dual-Index
Sequencing Primer Kitが必要
SingleRead FC
Paired-End
Read FC
SingleRead FC
R1:HP10
R1: HP10
R1:
HP6/10
R1:
HP6/10
I1: HP12
I1: HP12
I1:
HP8/12
I1:
HP8/12
I2: HP9
I2:
grafted
P5
I2: HP9
I2:
grafted
P5
R2: HP11
37
TruSeq HTライブラリ – DualIndex Sequencing Primer Kit,
Single-read flow cellが必要
Paired-End
Read FC
R2:
HP7/11
シングルリードのランに必要な試薬
IEMを用いた
サンプルシート
の作成
SBS試薬の
セット
Index read
用の試薬の
セット
Single-Index
#19: HT2
#18: Diluted HP33.5mls
#17: HP8 か HP12
38
それぞれの
シーケンス反応
Dual index
#19: HT2
#18: Diluted HP3- 4mls
#17: HP8 or HP12
#16: HP9
の開始
シングルリードのランに必要な試薬
IEMを用いた
サンプルシート
の作成
SBS試薬の
セット
それぞれの
Index read用の
試薬のセット
の開始
Single index
#19: HT2
#18: Diluted HP33.5mls
#17: HP8 or HP12
39
シーケンス反応
Dual-Index
#19: HT2
#18: Diluted HP3- 4mls
#17: HP8 か HP12
#16: HP9
ペアエンドのランに必要な試薬
IEMを
用いた
サンプル
SBS試薬の
セット
シート
Index read
に用いる試
薬のセット
Read1と
Index read
sequencing
の作成
Single-Index
#19: HT2
#18: Diluted HP3 3.5mls
#17: HP8 か HP12
40
Dual index
#19: HT2
#18: Diluted HP34mls
#17: HP8 or HP12
#10: RMX
Read2に使
用する 試薬
のセット
Read2用の
SBS試薬の
セット
Read2の
sequencing
ペアエンドのランに必要な試薬
IEMを
用いた
サンプル
シート
SBS試薬の
セット
Index read
に用いる試
薬のセット
Read1と
Index read
sequencing
の作成
Single index
#19: HT2
#18: Diluted HP3 3.5mls
#17: HP8 or HP12
Dual-Index
#19: HT2
#18: Diluted HP3- 4mls
#17: HP8 か HP12
#10: RMX
41
Read2に使
用する 試薬
のセット
Read2用の
SBS試薬の
セット
Read2の
sequencing
ペアエンドのランに必要な試薬
IEMを
用いた
サンプル
シート
SBS試薬の
セット
Index read
に用いる試
薬のセット
Read1と
Index read
sequencing
Read2に使
用する 試薬
のセット
Read2用の
SBS試薬の
セット
Read2の
sequencing
の作成
Single-Index
RMXを含めすべての
試薬をセット
42
Dual index
Prepare PE reagents
except RMX
ペアエンドのランに必要な試薬
IEMを
用いた
サンプル
シート
SBS試薬の
セット
Index read
に用いる試
薬のセット
Read1と
Index read
sequencing
Read2に使
用する 試薬
のセット
Read2用の
SBS試薬の
セット
Read2の
sequencing
の作成
Single index
Prepare RMX along
with all other reagents
43
Dual-Index
RMX以外の試薬を
セット
必要なSBS試薬–HiSeq
ランの種類
サイクル数
DualIndexed
Paired-End
101+8+(7)+8+101
225
--
4*
93+8+(7)+8+93
209
1
4*
76+8+(7)+8+76
175
1
3
51+8+(7)+8+51
125
1
3
36+8+(7)+8+36
95
1
2
101+8+8
117
1
2
76+8+8
92
1
2
51+8+8
67
1
2
36+8+8
52
1
1
DualIndexed
SingleRead
44
総サイクル数
SBS Kits
(200-cycle)
SBS kits
(50-cycle)
必要なSBS試薬–HiSeq
ランの種類
サイクル数
DualIndexed
Paired-End
101+8+(7)+8+101
225
--
4*
93+8+(7)+8+93
209
1
4*
76+8+(7)+8+76
175
1
3
51+8+(7)+8+51
125
1
3
36+8+(7)+8+36
95
1
2
101+8+8
117
1
2
76+8+8
92
1
2
51+8+8
67
1
2
36+8+8
52
1
1
DualIndexed
SingleRead
45
総サイクル数
SBS Kits
(200-cycle)
SBS kits
(50-cycle)
HCS 1.5.15を使用してのRecipeの作成
46
Recipeの互換性- GA
ランの種類
Recipe
Non-Indexed Single-Read
GA2_151Cycle_SR_v10
Single-Indexed Single-Read
GA2-PEM(2X)_MP_151+7Cycle_SR_v8.5(px)- single-indexed library
GA2-PEM(2X)_MP_151+8Cycle_SR_v10(px)- dual-indexed library
Dual-Indexed Single-Read
GA2-PEM(2X)_MP_151+8+8Cycle_SR_v10(px)
Non-Indexed Paired-End
GA2-PEM(2X)_2x151Cycle_v10(px)
Single-Indexed Paired-End
GA2-PEM(2X)_MP_151+7+151Cycle_v8.5(px)- single-indexed library
GA2-PEM(2X)_MP_151+7+151Cycle_v10(px)- dual-indexed library
Dual-Index Paired-End
GA2-PEM(2X)_MP_151+8+8+151Cycle_PE_v10(px)
 Single-Indexライブラリ: recipe v8.5
 Index無しのライブラリとDual-Indexライブラリ: recipe v10
47
Recipeの互換性- GA
ランの種類
Recipe
Non-Indexed Single-Read
GA2_151Cycle_SR_v10
Single-Indexed Single-Read
GA2-PEM(2X)_MP_151+7Cycle_SR_v8.5(px)- single-indexed library
GA2-PEM(2X)_MP_151+8Cycle_SR_v10(px)- dual-indexed library
Dual-Indexed Single-Read
GA2-PEM(2X)_MP_151+8+8Cycle_SR_v10(px)
Non-Indexed Paired-End
GA2-PEM(2X)_2x151Cycle_v10(px)
Single-Indexed Paired-End
GA2-PEM(2X)_MP_151+7+151Cycle_v8.5(px)- single-indexed library
GA2-PEM(2X)_MP_151+7+151Cycle_v10(px)- dual-indexed library
Dual-Index Paired-End
GA2-PEM(2X)_MP_151+8+8+151Cycle_PE_v10(px)
 Single-Indexライブラリ: recipe v8.5
 Index無しのライブラリとDual-Indexライブラリ: recipe v10
48
サンプルシートの作成- HiSeq/GA
Illumina Experiment Manager (IEM; 最新版はversion1.4)を使用しての
サンプルシートの作成をお薦めしております.
CASAVAで解析を行うためには必ずサンプルシートの作成が必要です
サンプルシートが作成されていればindex配列の情報がラン中に閲覧するこ
とが出来ます。
CASAVA
49
ソフトウェアの互換性
Platform
Control software *
Analysis *
Sample
sheet *
Sequencing
primers #
HiSeq1000/2000
HCS1.5
CASAVA1.8.2
Illumina
Experiment
Manager 1.2
TruSeq dual Index
sequencing primer
kit
Genome Analyzer
SCS2.10
CASAVA 1.8.2
Illumina
Experiment
Manager 1.2
TruSeq dual Index
sequencing primer
kit
MiSeq
MCS1.2
MiSeq
Reporter 1.1
Illumina
Experiment
Manager 1.2
--
* このバージョンより新しいもの
# Nextera由来のライブラリとSingle-Read TruSeq HT flow cellsを使用する場合に必要
50
まとめ
シーケンスプライマー:
– Nextera ライブラリ、あるいはSingle-Read TruSeq HT flow cellを使用の場合:
Dual-Index sequencing primer box (SR: FC-121-1003; PE: PE-121-103)が必要
– Paired-End TruSeq HT flow cell: クラスターキット内のsequencing primerを使用
装置と解析用のソフトウェアのアップデートを忘れずに
Index read用の試薬:
SBS試薬
Single-Read
Paired-End
HT2
HT2
Diluted HP3
Diluted HP3
HP8/HP12
HP8/HP12
HP9
RMX
– たとえば、HiSeqで2x100 dual indexのランを行う場合には、23 cycles (8+7+8)分を考
慮して50 cycle kits を4キット用意する必要が有ります
レシピ
– (HiSeq) HCS1.5を使用される場合は
7塩基のインデックス配列を読む場合にはTruSeq multiplex sequencing primer box
を、8塩基のインデックス配列を読む場合にはTruSeq Dual-Index sequencing primer
Kitを使用する。
– (GA) Dual-Indexライブラリを解析するにはGA recipe v10を使用する
51
MiSeqを使用される場合
52
Dual-Indexシーケンスのワークフロー
TruSeq
Amplicon
Nextera
TruSeq
HT
P5
Index 2
Rd1 seq primer
Insert
Index 1
Rd2 seq primer
53
P7
必要なSequencing Primer
「TruSeq Dual-Index Sequencing Primer Box (FC-121-1003, PE-121-1003)」 は
MiSeqを使用される場合には必要ございません!
(MiSeqカートリッジに必要なプライマーがすべて入っている)
MiSeqのフローセルはPaired-Endのみです。
そのため、カートリッジにはHP09(index2プライマー)がありません。
54
Position
Reagent Name
Description
12
HP10
Read 1 Primer Mix
13
HP12
Index 1 Primer Mix
14
HP11
Read 2 Primer Mix
サンプルシートの作成
Illumina Experiment Manager (IEM)を使用します。
MiSeqのOSであるMCS (MiSeq Control Software) は「ランの種類」や「サイク
ル数」についてサンプルシートを参照する設定になっておりますので、サンプル
シートはすべてのランに必要になります。
Index配列の入力フォーマットはCASAVAとMCSで異なるので注意。
MiSeq
55
CASAVA
MiSeqを使用する際のまとめ
Dual-Indexシーケンスに必要なプライマーは、MiSeqのカートリッジに
標準装備されています。
サンプルシートはそれぞれのランに対して用意します。
Illumina Experiment Manager (IEM; 現行version 1.4)を使用してサンプ
ルシートを作成します。(MyIlluminaからダウンロード可能)
http://support.illumina.com/downloads/illumina_experiment_manager.ilmn
56
Sequencing Primersについて
57
Sequencing Primersについて(まとめ)
MiSeq
TruSeq HT
Nextera
MiSeq reagent kit
TruSeq Amplicon
Single-Read
TruSeq Sequencing
primer box for SR
Paired-End
PE cluster kit v3
Genome Analyzer
HiSeq1000/2000
TruSeq HT
TruSeq Sequencing
primer box for PE
Single-Read
TruSeq Sequencing
primer box for SR
Paired-End
TruSeq Sequencing
primer box for PE
Nextera
58
よくあるご質問リスト
ペアエンドフローセル、ペアエンドライブラリを用いてDual Indexのシングルリー
ドを行うことは出来ますか?
– Read2のサイクル数を0に設定すれば可能。その場合はIndex2を解析した時点で終了しま
す。
Sequencing Analysis Viewer (SAV)でIndex readの結果が見られないのはなぜです
か?
– ランを開始する前にサンプルシートが必要です。SAV v1.8以上のバージョンがインデッ
クス情報を得るのに必要です。
Dual-IndexシーケンシングでRMXが使用されるのはいつですか?
– ペアエンドのランにはRMXはIndex 2 (i5) Readの際に必要です。
– Read 2では必要ではありません。
現行のTruSeq Dual-Index Primer KitはすべてのTruSeqライブラリに対応しています
か? 昔 Epicentre社より販売されていました Nextera kitにも対応していますか?
– TruSeq Dual Index primer kitはIllumina Nextera primersに加えすべてのTruSeqライブラリ
に対応していますが、昔販売されていましたEpicentreのNextera kitには対応しておりませ
ん。
59
Dual Indexing FAQs
Dual-IndexのインデックスランでもSingle-Indexの場合と同様に補正のための
1サイクルが必要になりますか?
– No, 6塩基(+補正1塩基)のSingle-Indexに比べてDual-Indexは8塩基の配列になる
ので 補正のサイクルが必要になりません。
Dual-Indexシーケンシングでは通常のシーケンシングに比べてどれだけの時間
がかかりますか?
– HiSeq でv3 SBS reagents とv3 flow cellを使用される場合、それぞれのサイクルご
とに 53分 (計16サイクル(8+8)) とペアエンドの場合はケミストリーオンリーの7
サイクルに 2時間 かかるので、通常のHiSeqランに比べて~16時間ほど必要です。
Illumina Dual-Indexライブラリはほかのライブラリと同一レーンで解析可能で
すか?
– No, ですが同じフローセルで解析することは可能です。その際は、TruSeq DualIndex Sequencing Primer kitを必ずご使用ください。また、その際は Illumina PhiX
control libraryのスパイクインをお試しください。
60
ご清聴ありがとうございました。
ご質問は[email protected]でも承ります。
61