岐阜薬科大学特別研究費報告書 (2007) 5 ―平成１９年度岐阜薬科大学特別研究費（奨励）― 時間変動マトリックス方式-動電クロマトグラフィーによる高機能複合モード分離システムの構築とその応用江坂幸宏１．緒言３．結果・考察このわずか 10 年の間に、生命科学は遺伝子情報（ゲノ濃度グラジエント MEKC：CGR-EKC 法では、電気浸透ミクス）から翻訳結果（プロテオミクス）、生命活動の証流抑制条件下、構造分配相（キャリアー）が組成・濃度を（メタボロミクス）を使って生命を議論する形へシフトを変化させながら、試料群を相互作用の強さに応じた速度で続けた観がある。この進展を支えた技術革新の中には、多検出器に向かって運搬する。浸透流抑制には、低 pH 条件くの生体分子の同定に不可欠であった高性能分離手法（キの採用、もしくはキャピラリー内壁修飾が用いられる。今ャピラリー電気泳動法（CE）、マイクロ LC）の進展と質回は pH 制限のないポリアクリルアミド誘導体修飾法をと量分析の汎用化・高性能化があった。MS とのハイフネーった。分離系には陽イオン性界面活性剤であるセチルトリションによって、上流分離システムは既存法を用いれば充メチルアンモニウムクロライド（CTAC）を用いたミセル分という見方もあるが、科学の進歩とともに、更なる複雑 EKC（MEKC）を用いた。これまでに、CTAC-ポリオキシ系を相手にすることになり、その構成成分を追うためにはエチレンアルキレート系非イオン性界面活性剤（Cn-POE，絶えまざる分離手法の高性能化を続ける必要がある。 Brij 35 か Tween 20）混合系において、Cn-POE の濃度を個々の部位において分化・変質した個々の細胞の活動一分離中に逐次変化させるやり方（組成グラジエントを追うシングルセル分析は、LC の既存法では対応できな MEKC）で、有機アニオンのグラジエント溶出を行い、分いといわれる。特に、微少量の一細胞液の構成成分を無駄離向上・時間短縮に成功している。しかし、Cn-POE の働なく、迅速に分析しきる要求に対し、キャピラリー電気泳きはミセルと試料のイオンペア形成を抑制する効果に基動法が分析ツールのエースとして期待されている。ただし、づくため、非荷電有機分子の分離においては有効ではない。汎用性、MS との接続等の課題もある。本研究では、それ非荷電分子の分離では、本体のミセル（この場合 CTAC）らの背景と課題を踏まえ、CE の高性能化を目指す。我々の濃度が変化する濃度グラジエント法が有効である。は、動的分配相のみで構成される動電クロマトグラフィーしかし、イオン性界面活性剤（IS）である CTAC の濃（EKC）では、LC では不可能な構造分配相側のグラジエ度変化は、異なる濃度ゾーン間で電気伝導度の顕著な差をント法が可能であることを示した。[1] このキャリアーグ生み、回路的にはキャピラリー内に異なる値の抵抗（を持ラジエント（CGR）-EKC の延長上に多段の分離モードをつゾーン）が直列につながった状態を生む。これにより、直列連結したマルチモード（MM）-CE の実現が可能であ各ゾーンに印加される電場の強さが IS 濃度に反比例してると考える。ここでは CGR-EKC の展開を通して、MM-CE 減少する。濃度グラジエント法では、先にミセルを低濃度の実現に必要な理論・技術の確立を行った。で導入して分離を完成させながら、次第に濃度の高いゾーンを導入して分離時間を短縮する。しかし、単純な IS 濃２．実験度変化では、前ゾーンの電場がより大きいため、後半の高濃度ゾーンが試料まで追いつかず、分離に関与しない、即溶融シリカキャピラリーチューブは、浸透流抑制のためちグラジエント溶出が成立しないことが判った。に、Poly-N,N-Dimethylacrylamide 内壁コーティングをしてこの問題は、IS 濃度減少分を他の電解質で補償するこ用いた。モデル試料には、置換ベンゼン類（図１参照）、とで原理的には解決するが、定常的に補償するためには電置換安息香酸類を用いた。注入は落作法を採った。分離過解質の構成イオンがミセルと同じ電気泳動移動度を有す程中の分離系へのキャリアー逐次導入は、GND に接したる必要がある。そこで、移動度が同程度のイオンを検索し陽極側のリザーバーの瞬時の交換(< 1 sec)によって行った。岐阜薬科大学機能分子学大講座薬品分析化学教室（〒502-8585 岐阜市三田洞東５丁目６−１） Laboratory of Pharmaceutical Analytical Chemistry, Gifu Pharmaceutical University (5-6-1, Mitahora-higashi, Gifu 502-8585, JAPAN) 江坂幸宏：時間変動マトリックス方式-動電クロマトグラフィーによる高機能複合モード分離システムの構築とその応用 6 たところ、テトラアルキルアンモニウムイオン（R4N＋）の実現が考えられる。しかし、定常的なキャリアーゾーンが候補となった。中でも、エチル基を持つイオンが、最もの形成が必要であり、前項の方法では、異なる電気泳動移移動度が近く、CTAC ミセルとの有意な相互作用も観測さ動度の複数キャリアーを用いる系には対応できない。これれないことから適当と判断した。には、等速電気泳動法（ITP）の概念をキャリアーに対して適用することにした。ITP 分離系では、リーディングイオン（L）とターミナルイオン（T）のつめられたキャピ 4 ,5 ,6 (1) 9 ,1 0 ラリーの L ゾーンと T ゾーンの界面に L、T の電気泳動移 2 ,3 動度の間の値を持つ試料イオン群を注入し、電場印加後に 0 ,1 7 1 2 1 1 8 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 等速で移動する各試料ゾーンが経時的に自然形成（分離完 3 0 了）することを利用している。本原理を複数種の荷電キャ 4 ,5 リアーに適用する。ITP 状態の形成条件は次式になる。 2 ,3 6 (2) 1 0 0 ,1 9 1 1 1 2 7 8 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 4 ,5 3 0 CT =CL 3 5 (3)     ep , L     ep, C  µ µ ep, T + µ μep : イオン電気泳動移動度 C : イオン濃度 L : リーディングイオン T : ターミナルイオンこの場合のイオンがキャリアーに相当する。L、T は各々 3 8 ,9 6 最前列、最後列のキャリアーとなる。各ゾーンが濃度を調 10 1 11 2 0  µ ep, T  µ ep, L + µ ep, C  12 7 0 5 10 15 20 25 整して印加電場を調節し等速になる。この式が成り立つ濃 30 度で後続のキャリアーを導入すればよいことになる。これ 5 3 1 0 6 を、胆汁酸ミセルと SDS の逐次 MEKC に適用した。 (4) 1 デオキシコール酸（SDC)系と SDS 系の途中置換を想 1 2 8 4 1 1 2 7 0 0 5 9 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5 定した場合、SDS ミセルのほうが速いので L、SDC の方 4 0 を T とした。 C は共通で Na+ となる。 mep,c=4.8 [/ 5 3 1 2 8 2 0 0 5 (5) 1 0 6 1 10-4cm-1V-1s-1][2]および、実験値 mep,L= 3.6, mep,T=2.75 から、 1 1 CT/CL=0.85 と試算される。例えば、[SDC]=50 mM ならば 9 7 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5 4 0 [SDS]=42.5 mM となる。実際にこの濃度比で双方のゾーン移動速度は等しくなり、切替は問題なく行われた。置換ベンゼン類の CTAC-MEKC 分離 [(1)-(4) イソクラティック溶出法、(5)濃度グラジエント溶出法条件：キャピラリー（0.050mm I.D.×0.375 mm O.D）全長 60 cm (有効長 30cm); 印加電圧(電流) -10kV（24μA），泳動液：CTAC/50 mM acetate buffer (pH 4.76)；[CTAC], (1)65 mM (2)50 mM (3)35 mM (4)25 mM (5) 25mM (0-3 min) 35 mM(3-5 min) 50 mM (5-7 min) 65 mM(7 min -) ；試料 , 0 ： 4-chloro-2-nitroPhenol 1 ： p-ethylPhenol 2 ： 4-nitroPhenol 3：p-cresol 4：p-toluidine 5：Acetotoluidine 6：Aniline 7：p-chloroanisole 8：Anisole 9：Phenylacetate 10：Acetanilide 11： Hydroquinone 12：Hydroxyacetanilide 対イオンを共通にするため、テトラエチルアンモニウ同様の胆汁酸と SDS の複合系で、コール酸ナトリウム（SC) から SDS/Tween 20 への途中置換による置換ベンゼン類の分離について予備的検討を行ったところ、“各キャリアーゾーンの効果の加成性”が明確に見られた。これは、 MM-CE を成立させる上で極めて重要な成果である。また、胆汁酸ミセルは光学分割を可能にする一方で、SDS は全般的な分離能力に優れる。これらを複合的に任意の貢献度で働かせることの有用性は疑問のないものである。ムクロライド（TEAC）を補償剤に選択し、CTAC 濃度グ展望：本計画によって見出されたキャリアーゾーンのラジエントを行った。有機アニオン（置換安息香酸）及び定常的形成法の適用は、原理上、各種 MEKC モードの直非荷電有機分子（置換ベンゼン）双方に対して、良好にグ列だけでなく、錯生成を含めた各種 EKC、CZE の直列もラジエント溶出が行われた。置換ベンゼン類の結果を上図可能にする。今後、実際に様々な組み合わせを検討し、問に示す。各濃度での分離の優れた部分が活かされ、かつ分題点の抽出・解決と実用性の高いシステムを構築して行く離時間の短縮が行われている。（興味深いことに、CTAC 予定である。また、本法では、MS 測定直前にキャリアー＝100mM の溶液と TEAC＝40mM の溶液は同程度の伝導を系から退避させることが可能であり、分子識別能を有す度を示す。これは輸率の考えに従えば、CTAC はミセル中る EKC と MS の汎用的結合を可能にすると考えている。でイオンペアを 6 割程度も形成している計算になる。） MM-CE のための等速電気泳動条件の導入：これまでの検４．引用文献討では同種のキャリアーの濃度・組成の変化にとどまっているが、その延長には全く異なるキャリアーの組み合わせによる逐次的多段階分離モード(マルチモード：MM)-CE 1) Esaka,Y., Sawamura, M., Murakami, H., Uno, B., Anal. Chem., 2006, 78, 8142. 2) 高柳俊夫、本水昌二, CE アドバンス, 2000, 4, 48.