エピジェネティックス Ⅲ 3 エピジェネティックス 全ゲノム Bisulfite メチル化解析 Reduced Representation Bisulfite Sequencing (RRBS) MeDIP-seq 解析 ChIP-seq 解析 - 40 - 全ゲノム Bisulfite メチル化解析 製品概要 Bisulfite シーケンシングは、DNA メチル化を研究するための有力な手段として注目を集めています。次世代ハイスルー プットシーケンサプラットフォームに基づいて、全ゲノム Bisulfite 処理とデータ解析技術を組み合わせ、低コスト・ 高効率・高解像度な全ゲノム DNA メチル化地図を作成します。特定種の高精度なメチル化パターンの解析は、エピジェ ネティクス研究で役に立つのみならず、細胞分化・組織発育などの基礎研究・動植物の育種・人類の健康と疾患研 究の土台を築きます。 技術特長 • 高精度：単一塩基解像度、各 C 塩基のメチル化の程度を精確に解析可能 高効率：次世代ハイスループットプラットフォームを用いて、全ゲノムの 5- メチルシトシン (5mC) 情報を効率 よくスキャニング 高コストパフォーマンス：PCR+Sanger シーケンシング法に比べ、低コスト ワークフロー ゲノム DNA ライブラリー作製 （Bisulfite 処理） • マッピング率 / ユニークマッピング率 シーケンシング • カバー率 / シーケンスのリード深度統計 • リードの分布分析 • メチル化程度の計算 生データ 品質管理 • 全ゲノムメチル化マップの作成 クリーンデータ 可視化 • 全体メチル化趨勢の予測 可視化 アライメント アノテーション 5mC 同定 生物学解析 異なる領域でメチル化の程度分析（DMR） データ解析 1. 標準データ解析 • • • • データのフィルタリング：生データからアダプター 配列・コンタミネーション・低品質リードを除去 リファレンス配列とのアライメント シーケンス深度とカバー率の解析 C 塩基メチル化レベルの評価 • • • 全ゲノムメチル化レベルの分布動向 全ゲノムメチル化プロファイリング 異なるメチル化領域（DMR）の同定 2. カスタマイズ • お客様のご要望に合わせ、データ解析をカスタマイ ズします。 - 41 - Ⅲ エピジェネティックス • • 技術パラメーター 1. サンプル要件 DNA (明らかな分解がないこと。ゲル電気泳動検出図の提出が必要) サンプル データ量(clean data) サンプル量 （データ量によって異なる） DNA量 ≦ 40Gb 41-80Gb 81-120Gb ≧ 10µg ≧ 20µg ≧ 30µg OD260/280=1.8~2.0 サンプル純度 ※ライブラリー作製が困難と判断される場合がありますので、予備のサンプルの同梱を推奨しています。 ※ QUBIT で DNA サンプルを測定、DNA の最終量は BGI の検出結果を参考にしてください。 2. シーケンス解析：91PE 3. 推奨ライブラリーサイズ：200 ～ 300bp 納品物 1. シーケンシング結果 (clean data) は FASTQ ファイルで納品 40 2. 納品データ例 CG CHG CHH a 図1 b c d e f 標準的な DNA のメチル化プロファイル 30 20 10 Percentage of total mC g 0 0.6 0.4 a upstream b first exon c first intron d internal exon e internal intron f last exon g downstream 0.2 Mean Mehtylation 0.8 TSS 0.0 エピジェネティックス Ⅲ 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Methylation level (%) 図2 CG・CHG・CHH のメチル化レベルの分布 納期 単一サンプル：約 55 営業日 Bisulfite プロジェクトのデータ量は種によって異なりますので、ライブラリー作製量に大きな違いがあります。 サンプル数が多い場合の納期は、別途お問い合わせください。 - 42 - Reduced Representation Bisulfite Sequencing (RRBS) 製品概要 Reduced Representation Bisulfite Sequencing (RRBS) は酵素でカットしたプロモーターと CpG 島を集めて Bisulfite シーケンシングを行い、DNA メチル化程度の高解像度検出とシーケンシングデータの高利用率を実現できる DNA メチル化解析ソリューションです。 技術特長 高解像度：単一塩基レベルの解像度 高再現率：サンプル間 85％から 95％に至るまでのオーバーラップ 高網羅率：全ゲノムにわたる 500 万以上の CpG 部位を検出可能 Ⅲ 高コストパフォーマンス：CpG-rich 領域を中心に、少量のデータで良いシーケンス深度を取得可能 エピジェネティックス • • • • ワークフロー ゲノム DNA ライブラリー作製 （Bisulfite 処理） • マッピング率 / ユニークマッピング率 • カバー率 / シーケンスのリード深度統計 • リードの分布分析 シーケンシング 生データ 品質管理、データのフィルタリング • メチル化程度の計算 • メチル化分析 クリーンデータ 可視化 可視化 • DMRs の同定 アライメント アノテーション 5mC 統計 異なる領域でメチル化の程度 （DMR）分析 生物学解析 関連分析 ・WGBS と Small RNA データの組み合わせ解析 ・WGBS と mRNA 発現データの組み合わせ解析 ・WGBS･Small RNA と mRNA 発現データの組み合わせ解析 - 43 - データ解析 納品物 標準データ解析 • • • • • • データのフィルタリング：生データからアダプター 配列・コンタミネーション・低品質リードを除去 産出データの統計 RRBS 配列とリファレンス配列のアライメント 1. シーケンシング結果 (clean data) は FASTQ ファイル で納品 2. 納品データ例 表1 Chromosome Numbers of DMR Length of DMR region chr1 247 79539 chr2 244 80743 chr3 145 49380 chr4 137 47258 chr5 185 62457 chr6 108 35249 chr7 193 64155 プロモーターと CGI（CpG アイランド）のカバー率 の分析 プロモーターと CGI のメチル化の程度の分析 異なるメチル化領域（DMR）の同定 技術パラメーター CGI: サンプル量 DNA (RNA、タンパク質汚染なし) ≧ 3μg CG CHG CHH C 80 サンプル 100 1. サンプル要件 ※ライブラリー作製が困難と判断される場合がありますので、 60 2. シーケンス解析：50PE 20 3. 推奨ライブラリーサイズ： 0 予備のサンプルの同梱を推奨しています。 40 サンプル純度 OD260/280=1.8~2.0 Percentage サンプル濃度 ≧ 50ng/μL 0 40~120bp・120~220bp 10 20 30 40 50 Depth 図1 納期 シトシンにおけるシーケンス深度の累積分布 約 45 営業日 10 20 30 40 mCG mCHG mCHH 0 Percentage of total mC エピジェネティックス Ⅲ DMR 鑑定 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Methylation level(%) 図2 - 44 - CG・CHG・CHH のメチル化レベルの分布 MeDIP-seq 解析 製品概要 Methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP) はメチル化 DNA を全ゲノムに渡って解析する技術です。5- メチルシ トシン (5mC) という抗体でメチル化 DNA 断片を沈降させ、ハイスループットシーケンシングを行います。MeDIP シー ケンシングは高メチル化や CpG が高密度にあるゲノム領域を検出することができます。 技術特長 • • 全ゲノム領域でメチル化 DNA を検出可能 抗体でメチル DNA を濃縮させ、DMRs 解析することで低コストを実現 Ⅲ エピジェネティックス ワークフロー ゲノム DNA ライブラリー作製 （5mC 抗体の集まり） シーケンシング ・マッピング率 / ユニークマッピング率 ・カバー率 / シーケンスのリード深度統計 ピークのスキャニングの 生データ ・リードの分布分析 品質管理 品質管理、データのフィルタリング • ゲノムのピーク分布 クリーンデータ 可視化 • ピークの長さの分布 可視化 アライメント アノテーション ピークのスキャニング マルチサンプルの差異解析 関連分析 ・MeDIP と smallRNA の組み合わせ解析 生物学解析 ・MeDIP と mRNA 発現データの組み合わせ解析 ・ピークに関する遺伝子の差異解析 ・MeDIP と smallRNA と mRNA 発現データの組み合わせ解析 ・GO 解析 ・KEGG pathway 解析 - 45 - データ解析 納品物 1. 標準データ解析 列・コンタミネーション・低品質リードを除去 リファレンス配列とのアライメント 表1 ピークのスキャニングとゲノム全体での分布情報 Sample Total Peaks Peak Mean Length Peak Median Length Peak Total Length Peak Covered Size In Genome Sample 1 138,508 1029.71 815 149,756,980 6.61% Sample 2 152,689 1018.57 965 156,945,069 6.93% 複数サンプルの差異解析 MeDIP・smallRNA の統合解析 MeDIP・mRNA の統合解析 Differential Genes(A vs B) 7000 MeDIP・smallRNA・mRNA の統合解析 ns tre 3’ am UT 2k R n ro 2k re st OD260/280=1.8~2.0 (RNAのコンタミネーションなし) ※ライブラリー作製が困難と判断される場合がありますので、 R UT 5’ w do サンプル純度 am サンプル濃度 ≧ 50ng/μL Int ≧ 5μg S DNA 0 サンプル D 1. サンプル要件 C 技術パラメーター 5000 ズします。 4000 Number of Genes お客様のご要望に合わせ、データ解析をカスタマイ サンプル量 Down Up 6000 3. カスタマイズ • ピーク領域の情報 up エピジェネティックス Ⅲ 2. 納品データ例 ユニークにマッピングされたリードの分布 2. オプションデータ解析 • • • で納品 3000 • • • • データフィルタリング：生データからアダプター配 1000 2000 • 1. シーケンシング結果 (clean data) は FASTQ ファイル 図1 異なるコンポーネントにおける異なる遺伝子の分布 予備のサンプルの同梱を推奨しています。 2. シーケンス解析：50PE 3. 推奨ライブラリーサイズ：200~300bp 納期 約 50 営業日 sample 1 chr1 chr2 chr3 chr4 chr5 chr6 chr7 chr8 chr9 chr10 chr11 chr12 chr13 chr14 chr15 chr16 chr17 chr18 chr19 chr20 chr21 chr22 chrX chrY 0 図2 5000 10000 15000 各染色体における MeDIP シーケン シングのリードの分布 - 46 - 2000 25000 ChIP-seq 解析 製品概要 クロマチン免疫沈降法（ChIP）は生体内のタンパク質と DNA との相互作用を研究する手法であり、ヒストン修飾と 特異転写因子の遺伝子発現制御作用などの分野で広く使われます。次世代シーケンシング技術の発展に伴い、クロ マチン免疫沈降法とハイスループットシーケンシング技術を組み合わせた ChIP シーケンシングにより、全ゲノム範 囲で DNA 結合タンパク質の結合部位を効率良く、且つ精確に同定できます。 ChIP-Seq 解析では、特異抗体を用いて目的タンパク質を免疫沈降した後、それと結合した DNA 断片を分離します。 ハイスループットシーケンシング技術とデータ解析で、全ゲノム範囲で目的タンパク質の DNA 結合部位を探し、複 数のサンプルを比較し、差異を研究します。 Ⅲ • • • エピジェネティックス 技術特長 広い検出範囲：全ゲノム範囲での免疫沈降とシーケンシング分析 高い費用対効果：抗体濃縮の標的領域に基づいて、データ量を効率的に減少 少量のサンプルで解析可能：免疫沈降した DNA サンプルの最小必要量は 10ng ワークフロー ChIPed DNA ライブラリー作製 シーケンシング 生データ ・マッピング率 / ユニークマッピング率 ・カバー率 / シーケンスのリード深度統計 ・リードの分布分析 品質管理 ピークスキャニングの品質管理 ・ピークの長さの分布 クリーンデータ 可視化 ・ピークのゲノム全体での分布 可視化 SOAP アライメント アノテーション ピークスキャニング 生物学解析 ・ピークに関連する遺伝子の検出 ・ChIP と small RNA のシーケンシングデータ ・GO 解析 ・ChIP と mRNA のシーケンシングデータ ・UCSC ゲノムブラウザ ・ChIP、mRNA と small RNA のシーケンシングデータ ・複数サンプルの差異解析 ・Transcriptome start site (TSS) 付近の ChIP シーケンシングリードの分布 - 47 - データ解析 納品物 1. シーケンシング結果 (clean data) は FASTQ ファイル 1. 標準データ解析 • • • • • • • 生データからアダプター配列・コンタミネーション・ 低品質リードを除去し、産出量を統計 リファレンスゲノム配列とアラインメント 表1 ピークのスキャニングと分布情報 ピーク関連遺伝子のスキャニングと GO 機能解析 Sample Peak 複数サンプルの差異分析 Sample 1726 1 Sample 604 2 Sample 1118 3 UCSC Genome Browser の使用説明 TSS 付近領域の ChIP シーケンシングリードの分布 ピークスキャニング Peak length(bp) Average Median Percentage peak length(bp) (%) length(bp) 1147367 665 659 0.038 324771 538 495 0.011 253561 227 195 0.008 3. カスタマイズ • お客様のご要望に合わせ、データ解析をカスタマイ ズします。 Number of peaks 技術パラメーター 1. サンプル要件 サンプル サンプル量 DNA ≧ 10ng ChIPed DNA サンプル濃度 ≧ 1ng/μL サンプル純度 OD260/280=1.8~2.0 Length of peaks (bp) 図1 ピークの長さの分布 DNA 断片サイズ： 100-500bp に分布（メインバンドは 250bp 前後） sample 1 80-10 DNA 断片サイズが要件を満たすかどうかを判断するた Normalized Counts エピジェネティックス Ⅲ 2. 納品データ例 全ゲノムにおける ChIP シーケンシングリードの分布 2. オプションデータ解析 • で納品 めに、抽出した DNA の電気泳動の写真を提出してく ださい。また、Sample Information Sheet と ChIP 後の q-PCR 検出結果も提出してください。 BGI では以下の抗体の ChIP 濃縮実験も可能です。 標準抗体：H3K4Me3、H3K4Me2、H3K9Me3、H3K9Me2、 60-10 40-10 20-10 0 -1000 H3K27Me3、H3K27Me2 -5000 0 5000 10000 Position relative to Tss (bp) 2. シーケンス解析：50SE 3. 推奨ライブラリーサイズ：100~500bp hlgh low silent 図 2 TSS 付近のリード分布 納期 ・25 個以下の免疫沈降後の DNA：約 30 営業日 ・12 個以下の株細胞：約 42 営業日 ※ サンプル数と規模によって、納期は変わります。 - 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